Method Article

Lokalisatie en kwantificering van Begomovirussen in Whitefly Weefsels door immunofluorescentie en kwantitatieve PCR

DOI:

10.3791/60731

⸱

February 8th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een immunofluorescentie en kwantitatieve PCR-methode voor de lokalisatie en kwantificering van begomovirussen in insectenweefsels. Het immunofluorescentieprotocol kan worden gebruikt om virale en vectoreiwitten samen te lokaliseren. Het kwantitatieve PCR-protocol kan worden uitgebreid om virussen in hele wittevlieglichamen en met virussen geïnfecteerde planten te kwantificeren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Begomovirussen (geslacht Begomovirus, familie Geminiviridae) worden overgedragen door witte vliegen van de Bemisia tabaci complex in een aanhoudende, circulerende manier. Gezien de grote schade veroorzaakt door begomovirussen aan de productie van gewassen wereldwijd, is het noodzakelijk om de interactie tussen begomovirussen en hun wittevliegvector te begrijpen. Om dit te doen, lokalisatie en kwantificering van het virus in de vectorweefsels is van cruciaal belang. Hier, met behulp van tomaat geel blad krul virus (TYLCV) als voorbeeld, beschrijven we een gedetailleerd protocol om begomovirussen lokaliseren in wittevlieg midguts, primaire speekselklieren, en eierstokken door immunofluorescentie. De methode is gebaseerd op het gebruik van specifieke antilichamen tegen een viruscoat eiwit, kleurstof-gelabeldsecundaire antilichamen, en een confocale microscoop. Het protocol kan ook worden gebruikt om begomovirale en wittevliegeiwitten te colocaliseren. We beschrijven verder een protocol voor de kwantificering van TYLCV in wittevliegmiddeningewanden, primaire speekselklieren, hemolymph en eierstokken door kwantitatieve PCR (qPCR). Met behulp van primers speciaal ontworpen voor TYLCV, de protocollen voor kwantificering maken de vergelijking van de hoeveelheid TYLCV in verschillende weefsels van de wittevlieg. Het beschreven protocol is potentieel nuttig voor de kwantificering van begomovirussen in het lichaam van een wittevlieg en een met virussen geïnfecteerde plant. Deze protocollen kunnen worden gebruikt om de circulatieroute van begomovirussen in de wittevlieg te analyseren of als aanvulling op andere methoden om wittevlieg-begomovirus interacties te bestuderen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen decennia hebben begomovirussen (geslacht Begomovirus, familie Geminiviridae)ernstige schade toegebracht aan de productie van vele plantaardige, vezel- en siergewassen wereldwijd1. Begomovirussen worden op een hardnekkige manier overgedragen door de witte vlieg Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), een complexe soort met meer dan 35 cryptische soorten2,3. Begomovirussen kunnen direct of indirect invloed hebben op de fysiologie en het gedrag van witte vlieg, zoals vruchtbaarheid4,levensduur4en ga....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Whitefly, Virus, Plants, en De verwerving van het Virus

  1. Achterwitte vliegen (MEAM1) op katoen (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) in insectenbestendige kooien in een kas bij 26 ± 1 °C met een licht-donkere cyclus van 14:10 uur en 60 ± 10% relatieve vochtigheid.
  2. Voer conventionele PCR uit op basis van wittevliegmitochondrial cytochroomoxidase I-gen om de zuiverheid van de wittevliegpopulatie te bepalen.
    1. Verzamel 20 volwassen witvliegen en breng ze individueel over naar een PCR-buis met 30 μL lysisbuffer (10 mM Tris, pH = 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] gelatine, 0,45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Prote....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De MEAM1 whiteflies van het B. tabaci complex en TYLCV werden hier als voorbeeld gebruikt om de procedures te beschrijven. Het overzicht van de immunofluorescentie- en virale kwantificeringsprocedures die in dit manuscript worden beschreven, is weergegeven in figuur 1. Figuur 2 toont representatieve resultaten van immunofluorescentiedetectie van TYLCV- en DAPI-vlekken in PSG's, midguts en eierstokken, wat aangeeft dat TYLCV meer heeft opgehoopt in de PS.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een protocol voor de lokalisatie en kwantificering van een begomovirus in de weefsels van zijn wittevliegvector door immunofluorescentie en qPCR. Dissectie is de eerste stap om het virus in wittevliegweefsels te lokaliseren en te kwantificeren. De wittevlieg lichaam is ongeveer 1 mm lang, wat betekent dat de weefsels zijn zeer klein, en het is moeilijk om ze te ontleden. Bovendien zijn er sterke verbindingen tussen de weefsels. De eierstokken zijn bijvoorbeeld nauw verbonden met de bacteriocyten, waar.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door National Key Research and Development Program (Grant number: 2017YFD0200600), het geoormerkte fonds voor China Agriculture Research System (subsidienummer: CARS-23-D07) en de Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP11497777 ). Wij danken Prof. Jian-Xiang Wu voor het verstrekken van TYLCV CP antilichamen.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4% ParaformaldehydeMultiSciencesF0001
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)Abcamab104139
Bovine Serum Albumin (BSA)MultiSciencesA3828
CFX Connect Real-Time PCR Detection SystemBio-RAD185-5201
Confocal microscopyZeissLSM800
Dylight 549-goat anti-mouseEarthoxE032310-02Secondary antibody
Monoclonal antibody (MAb 1C4)Primary antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sangon BiotechB548119-0500
Stereo microscopeZeissStemi 2000-C
TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)TaKaRaRR820AqPCR master mix
ThermocyclerThermofisherA41182
TissuelyzerShaghai jingxinTissuelyser-48
Triton-X-100BBI life sciences9002-93-1
Tween 20BBI life sciences9005-64-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
  2. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Begomovirus LocalizationWhitefly Tissue DissectionImmunofluorescence ProtocolQuantitative PCRConfocal MicroscopyTYLCV DetectionStromal Vascular FractionHemolymph CollectionPrimary Salivary GlandsVirus Quantification

Related Articles