Het creëren van zeer specifieke chemisch geïnduceerde eiwit Dimerization systemen door stepwise Phage selectie van een Combinatoriale één-domein antilichamen bibliotheek

Luis Gomez-Castillo; Kurumi Watanabe; Huayi Jiang; Shoukai Kang; Liangcai Gu

doi:10.3791/60738

Method Article

Het creëren van zeer specifieke chemisch geïnduceerde eiwit Dimerization systemen door stepwise Phage selectie van een Combinatoriale één-domein antilichamen bibliotheek

DOI:

10.3791/60738

⸱

January 14th, 2020

Luis Gomez-Castillo*¹ , Kurumi Watanabe*¹ , Huayi Jiang*¹ , Shoukai Kang¹ , Liangcai Gu¹

¹Department of Biochemistry and Institute for Protein Design, University of Washington

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het creëren van chemisch geïnduceerde eiwit door dimerisatie systemen met de gewenste affiniteit en specificiteit voor een bepaalde kleine molecule ligand zou veel biologische sensing en bediening toepassingen. Hier beschrijven we een efficiënte, generaliseerbare methode voor de Novo engineering van chemisch geïnduceerde door dimerisatie systemen via de stapsgewijze selectie van een Phage-weergegeven combinatorische single-Domain antilichamen bibliotheek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit door dimerisatie gebeurtenissen die alleen optreden in de aanwezigheid van een kleine molecule ligand maken de ontwikkeling van kleine-molecuul biosensoren voor de dissectie en manipulatie van biologische trajecten. Momenteel bestaat er slechts een beperkt aantal chemisch geïnduceerde door dimerisatie (CID)-systemen en worden nieuwe technieken met de gewenste gevoeligheid en selectiviteit voor specifieke kleine molecuul liganden een uitdaging op het gebied van proteïne-engineering. Hier beschrijven we een hoge doorvoer screeningsmethode, combinatorial binders-eingeschakeld sverkiezing van Cid (combineert-CID), voor de de Novo engineering van CID systemen toepasbaar op een grote verscheidenheid van liganden. Deze methode maakt gebruik van de tweestapsselectie van een Phage-weergegeven combinatoriale nanobody-bibliotheek om 1) "anker Binders" te verkrijgen die eerst binden aan een ligand van belang en vervolgens 2) "dimerization bindmiddelen" die alleen binden aan anker Binder-ligand complexen. Om anker binders te selecteren, wordt een combinatorische bibliotheek van meer dan 10⁹ -gerandomiseerde nanolichamen gescreend met een biotinyleerd ligand en worden hits gevalideerd met de niet-gelabelde ligand door bio-Layer interferometrie (bli). Om bindmiddelen te verkrijgen, wordt de nanobody-bibliotheek gescreend met anker Binder-ligand-complexen als doelen voor positieve screening en de niet-afhankelijke anker Binders voor negatieve screening. COMBINEERT-CID is algemeen toepasbaar om CID binders te selecteren met andere immunoglobulin, niet-immunoglobulin, of computationeel ontworpen steigers om biosensoren te creëren voor in vitro en in vivo detectie van geneesmiddelen, metabolieten, signaal moleculen, enz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CID-systemen, waarin twee eiwitten alleen in de aanwezigheid van een klein-molecuul ligand (Figuur 1) dimeriseren, bieden veelzijdige gereedschappen voor het ontleden en manipuleren van metabole, signalering en andere biologische trajecten¹. Ze hebben aangetoond dat het potentieel in biologische werking, zoals drug gecontroleerde t-cel activering² en apoptosis³^,⁴, voor het verbeteren van de veiligheid en werkzaamheid van adoptie t-cel therapie. Daarnaast bieden ze een nieuwe methodologie voor in vivo of in vitro detectie van kleine m....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bibliotheek constructie

Gebruik een synthetische combinatorische bibliotheek met één domein antilichamen met een diversiteit van ~ 1,23 – 7.14 x 10⁹, zoals eerder beschreven¹⁹. Hoewel dit protocol geen bibliotheek constructie bevat, kan het worden toegepast op andere combinatorische Binder bibliotheken.

2. biotinylatie van ligand target of ligand

Biotinylaat de geselecteerde ligand, bijvoorbeeld, CBD en tetrahydrocannabinol (THC)¹⁹, via verschillende chemische synthese strategieën, afhankelijk van de geschikte biotinylatie plaatsen van een doelwit.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven de twee-stap in vitro selectie en validatie van anker-en door dimerisatie bindmiddelen door de combinatorische nanobody Library te screenen met een diversiteit hoger dan 10⁹ met CBD als doel. Beoordeling van de verrijking van de faag biopanning tijdens de opeenvolgende selectie rondes voor zowel anker-als door dimerisatie bindmiddelen is belangrijk. Typische verrijking resultaten na 4 – 6 selectie rondes zoals weergegeven in afbeelding 5 zijn een goede indicatie dat.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het is essentieel om te kiezen van de juiste concentraties van de invoer faag bibliotheken voor verschillende rondes van biopanning. We zijn meestal gestart vanuit een invoer bibliotheek van ~ 10¹²– 10¹³ faag deeltjes met een diversiteit > 10⁹, waardoor ~ 100 – 1000 kopieën van elke faag-kloon worden weergegeven in de pull-down assay. Als de faag concentratie in een bindende assay te hoog of te laag is, zal de waarschijnlijkheid van niet-specifieke binding of verlies van positieve klonen .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een voorlopig octrooi met betrekking tot dit werk is ingediend door de Universiteit van Washington.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de University of Washington Innovation Award (to L.G.), een subsidie van de Amerikaanse National Institutes of Health (1R35GM128918 tot L.G.), en een startup Fonds van de Universiteit van Washington (naar L.G.). H.J. werd gesteund door de Washington Research Foundation undergraduate Fellowship. K.W. werd gesteund door een undergraduate Fellowship van het University of Washington Institute for protein design.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution	Thermo Fisher Scientific	34029
Agar	Thermo Fisher Scientific	BP1423-2
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff)	Millipore	UFC900324
Ampicillin	Thermo Fisher Scientific	BP1760-25
Bio-Rad Protein Assay Kit II	Bio-Rad	5000002
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit	Avidity	BirA500
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153-50G
Casein	Sigma-Aldrich	C7078-1KG
CM13 Helper phage	Antibody Design Labs	PH020L
D-(+)-Glucose monohydrate	Alfa Aesar	A11090
Dynabeads M-280 Streptavidin	Thermo Fisher Scientific	11205D
DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D
EDTA	Thermo Fisher Scientific	BP120-1
Fast DNA Ladder	New England Biolabs	N3238S
FastDigest BglI	Thermo Fisher Scientific	FD0074
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	BP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	GE Healthcare	28989335
HiPrep 26/10 Desalting Column	GE Healthcare	17508701
HisTrap-FF-1ml	GE Healthcare	11000458
Imidazole	Alfa Aesar	161-0718
IPTG	Thermo Fisher Scientific	34060
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	BP906-5
M13 Major Coat Protein Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53004
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-500G
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates	Thermo Fisher Scientific	260251
Nunc MaxiSorp	Thermo Fisher Scientific	44-2404-21
Octet RED96	ForteBio	N/A
pADL-23c Phagemid Vector	Antibody Design Labs	PD0111
PEG-6000	Sigma-Aldrich	81260-1KG
Platinum SuperFi DNA Polymerase	Invitrogen	12351010
PureLink PCR Purification Kit	Thermo Fisher Scientific	K310001
QIAprep Spin M13 Kit	Qiagen	27704
Recovery Medium	Lucigen	80026-1
SpectraMax Plus 384	Molecular Devices	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389-1KG
Super Streptavidin (SSA) Biosensors	ForteBio	18-5057
Superdex 75 increase 10/300 GL Column	GE Healthcare	28-9909-44
T4 DNA Ligase	Thermo Fisher Scientific	15224-025
TG1 Electrocompetent Cells	Lucigen	60502-1
Triethylamine	Sigma-Aldrich	471283-100mL
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	BP9726-5
Tween 20	Thermo Fisher Scientific	BP337-500
Yeast Extract	Thermo Fisher Scientific	BP1422-2
Zeba Spin Desalting Column	Thermo Fisher Scientific	89882

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359 (6380), (2018).
Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Het creëren van zeer specifieke chemisch geïnduceerde eiwit Dimerization systemen door stepwise Phage selectie van een Combinatoriale één-domein antilichamen bibliotheek

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles