Visualisatie, kwantificering en mapping van immuuncelpopulaties in de tumormicro-omgeving

Summary

Hier beschrijven we een eenvoudige en toegankelijke strategie voor het visualiseren, kwantificeren en in kaart brengen van immuuncellen in formaline-vaste paraffine-ingebedde tumorweefselsecties. Deze methodologie combineert bestaande beeldvormings- en digitale analysetechnieken met als doel de multiplexingcapaciteit en multiparameteranalyse van beeldvormingstesten uit te breiden.

Abstract

Het immuunlandschap van de tumormicroomgeving (TME) is een bepalende factor in de progressie van kanker en de respons op de therapie. Met name de dichtheid en de locatie van immuuncellen in de TME hebben belangrijke diagnostische en prognostische waarden. Multiomic profiling van de TME heeft exponentieel toegenomen ons begrip van de talrijke cellulaire en moleculaire netwerken reguleren tumor initiatie en progressie. Deze technieken geven echter geen informatie over de ruimtelijke organisatie van cellen of celcelinteracties. Betaalbare, toegankelijke en eenvoudig uit te voeren multiplexingtechnieken die ruimtelijke resolutie van immuuncellen in weefselsecties mogelijk maken, zijn nodig als aanvulling op technologieën met een hoge doorvoer op basis van één cel. Hier beschrijven we een strategie die seriële beeldvorming, sequentiële etikettering en beelduitlijning integreert om virtuele multiparameterdia's van hele weefselsecties te genereren. Virtuele dia's worden vervolgens geautomatiseerd geanalyseerd met behulp van door de gebruiker gedefinieerde protocollen die identificatie, kwantificering en het in kaart brengen van celpopulaties van belang maken. De beeldanalyse wordt gedaan, in dit geval met behulp van de analysemodules Tissuealign, Auteur en HISTOmap. We presenteren een voorbeeld waarbij we deze strategie met succes toepasten op één klinisch monster, waarbij we de informatie die kan worden verkregen uit beperkte weefselmonsters maximaliseren en een onbevooroordeeldbeeld van de TME in de gehele weefselsectie bieden.

Introduction

De ontwikkeling van kanker is het resultaat van een proces met wederzijdse interacties tussen kwaadaardige cellen en de TME. Anders dan tumorcellen, de TME is samengesteld uit niet-kwaadaardige cellen, stromalcellen, immuuncel populaties, en extracellulaire matrix (ECM)¹. De ruimtelijke organisatie van de verschillende cellulaire en structurele componenten van het tumorweefsel en de dynamische uitwisseling tussen de kanker en naburige niet-kankercellen moduleren uiteindelijk tumorprogressie en reactie op therapie^2,3,4. Het is aangetoond dat de immuunrespons bij kanker is spatiotemporally geregeld^5,6. Verschillende immuuncelpopulaties die de neoplastische laesie en het aangrenzende weefsel infiltreren vertonen onderscheidende ruimtelijke distributiepatronen en gevarieerde activerings- en differentiatietoestanden die verband houden met verschillende functies (bijvoorbeeld pro- versus antitumor). Deze verschillende immuunpopulaties en hun parameters coevolve overuren met de tumor en de stromal compartimenten.

De opkomst van technologieën die multiomics profilering met één cel mogelijk maken, heeft ons begrip van de talrijke cellulaire en moleculaire netwerken die carcinogenese en tumorprogressie reguleren exponentieel vergroot. De meeste analytische hulpmiddelen met een hoge doorvoer vereisen echter weefselverstoring en isolatie van één cel, wat resulteert in verlies van informatie over de ruimtelijke organisatie van cellen en celcelinteracties⁷. Omdat de locatie en rangschikking van specifieke immuuncellen in de TME diagnostische en prognostische waarde hebben, zijn technologieën die ruimtelijke resolutie mogelijk maken een essentiële aanvulling op op één cellen gebaseerde immuunprofileringstechnieken.

Traditioneel zijn beeldvormingstechnieken zoals immunohistochemie (IHC) en multiplex immunofluorescentie (mIF) beperkt tot een klein aantal biomarkers die tegelijkertijd kunnen worden gevisualiseerd. Deze beperking heeft de studie van de spatiotemporale dynamiek van tumor-infiltrerende immuuncellen belemmerd, die meestal worden gedefinieerd door verschillende fenotypische markers. Recente ontwikkelingen op het gebied van beeldvorming en analytische tools hebben de mogelijkheden van multiplexing uitgebreid. Nieuwe op antilichamen gebaseerde etiketteringstechnologieën zoals histocytometrie en beeldvormingsmassacytometrie zijn gebruikt om tot 12 en 32 biomarkers ruimtelijk te scheiden, respectievelijk^8,9. Massaspectrometrie beeldvorming, een techniek die geen etikettering vereist, heeft het potentieel om duizenden biomarkers tegelijk beeld in een enkel weefsel sectie^10,11. Hoewel deze technieken hebben al aangetoond groot potentieel voor het ontleden van het weefsel immuun landschap bij kanker, ze gebruiken zeer geavanceerde en dure apparatuur en software en zijn niet gemakkelijk toegankelijk voor de meerderheid van de onderzoekers.

Als alternatief is het multiplexingvermogen van traditionele IHC en mIF uitgebreid door het gebruik van seriële beeldvorming, sequentiële rondes van etikettering en spectrale beeldvorming^{7,12,13,14,15,16}. Deze technieken genereren meerdere afbeeldingen van dezelfde of van seriële weefsel secties die kunnen worden geconsolideerd in virtuele multiparameter dia's met behulp van beeldanalyse software. Als gevolg hiervan neemt het aantal markers toe dat tegelijkertijd kan worden gevisualiseerd en geanalyseerd.

Hier stellen we een strategie voor het rationele ontwerp van weefselmultiplex-testen met behulp van commercieel beschikbare reagentia, betaalbare microscopie-apparatuur en gebruiksvriendelijke software (figuur 1). Deze methodologie integreert seriële beeldvorming, sequentiële multiplex etikettering, hele weefsel beeldvorming, en weefsel uitlijning om virtuele multiparameter dia's die kunnen worden gebruikt voor geautomatiseerde kwantificering en mapping van immuuncellen in weefsel secties te genereren. Met behulp van deze strategie hebben we een virtuele dia gemaakt bestaande uit 11 biomarkers plus twee veelgebruikte histologische vlekken: hematoxyline en eosine (H&E) en picrosirius rood (PSR). Meerdere immuuncelpopulaties werden geïdentificeerd, gelokaliseerd en gekwantificeerd in verschillende weefselcompartimenten en hun ruimtelijke verdeling werd opgelost met behulp van weefselheatmaps. Deze strategie maximaliseert de informatie die kan worden verkregen uit beperkte klinische specimens en is van toepassing op formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) gearchiveerde weefselmonsters, met inbegrip van heel weefsel, kernnaaldbiopten en weefselmicroarrays. We stellen deze methodologie voor als een nuttige gids voor het ontwerpen van aangepaste testen voor identificatie, kwantificering en in kaart brengen van immuuncelpopulaties in de TME.

Protocol

Drie seriële FFPE-secties van resected hepatitis B virus (HBV)-geassocieerd menselijk hepatocellulair carcinoma werden verkregen bij het Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CHUM) Hepatopancreatobiliary Cancer Clinical Database and Biological Specimen Repository (HBP Biobank). Patiënten die deelnemen aan deze weefselbank hebben geïnformeerde toestemming gegeven. Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele ethische commissie (Protocol nummer 09.237) en uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki.

1. Hematoxylin en eosine (H&E) kleuringsprotocol

OPMERKING: De H&E-kleuring werd uitgevoerd door de moleculaire pathologiekernfaciliteit van het Centre de Recherches du Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) met behulp van de Shandon multiprogram robotdiavlek met behulp van het volgende programma.

1. Voor deparaffine, dompel dia's 3x voor 2,5 min elk in xyleen substituut.
   LET OP: Xyleenvervangers zijn ontvlambaar, irriterende stoffen en schadelijk bij inademing.
2. Voor rehydratie, dompel dia's onder in 100% ethanol 3x voor 2,5 min per stuk. Was gedurende 1 min in dubbel gedestilleerd water (ddH₂O) om te hydrateren.
3. Incubeer gedurende 1 min in hematoxylin. Was 3x voor 1 min elk in ddH₂O.
4. Incubeer voor 5 s met eosine. Was 30 s met 95% ethanol. Was 2x voor 1 min met 100% ethanol.
   LET OP: Ethanol is ontvlambaar en irriterend voor het oog. Eosin is een irriterende oog.
5. Voor uitdroging, dompel 3x voor 1,5 min elk in de xyleen substituut. Zet dia's handmatig in.
   OPMERKING: De geschatte tijd voor het uitvoeren van dit deel van het protocol is 30 min.

2. Multiplex immunofluorescentie kleuring protocol voor FFPE secties

OPMERKING: Dit protocol is aangepast van Robertson et al.¹⁷.

1. Deparaffine en rehydratie
   OPMERKING: Voordat de antilichaam-gemedieerde etikettering van FFPE-secties door IHC of mIF wordt gemedieerd, moet de paraffine worden verwijderd. Het niet efficiënt verwijderen van de paraffine resulteert in suboptimale kleuring.
   1. Plaats 4 μm FFPE weefsel sectie dia's in glazen schuifhouders. Dompel de dia's onder de rookkap onder in een Coplin-pot met 37°C voorverwarmde xyleen gedurende 10 min.
      LET OP: Xyleen is ontvlambaar, irriterend voor de huid en schadelijk bij inademing.
   2. De dia's handmatig roeren gedurende 10 s per 2 min. Herhaal 1x in vers xyleen voor nog eens 5 minuten.
   3. Dompel in de chemische kap de dia's achtereenvolgens gedurende 5 min onder in elk van de volgende oplossingen: 1) xyleen : ethanol (1:1 v/v); 2) 100% ethanol; 3) 70% ethanol; 4) 50% ethanol; 5) 30% ethanol; 6) fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
      OPMERKING: Bewaar de dia's in PBS tot ze klaar zijn om het antigeen ophalen uit te voeren. Houd de gedewaxte secties te allen tijde gehydrateerd. Uitdrogen zal leiden tot niet-specifieke antilichaam binding en dus een hoge achtergrond kleuring.
2. Warmte-geïnduceerde antigeenterugwinning
   OPMERKING: Antigenen kunnen worden gemaskeerd bij formalinefixatie, waardoor antilichaambinding en bijgevolg visualisatie wordt voorkomen. Het gebruik van antigeenontmaskeringsbuffers en -procedures herstelt gedeeltelijk de inheemse conformatie van epitopen en herstelt daarmee de antilichaamherkenning. Het type antigeenbuffer en de duur moeten worden geoptimaliseerd voor de specifieke testomstandigheden (bijvoorbeeld doel, antilichaam, weefsel, enz.).
   1. Dompel gedewaxte dia's onder in een Coplin-pot met de antigeenterugwinningsoplossing (recept in Tabel van materialen).
   2. Plaats gesloten Coplin pot in een elektrische snelkookpan met kraanwater. Het waterniveau mag niet groter zijn dan de helft van de hoogte van de pot, zodat het water zich niet mengt met de antigeenterugwinningsoplossing.
   3. Sluit het deksel en de drukklep van het fornuis. Selecteer hoge druk gedurende 10 min en start. Wanneer u klaar bent, trek het fornuis los, laat de druk los, open het deksel en houd de pot 30 min in het fornuis, zodat de dia's kunnen afkoelen.
3. Blokkering van niet-specifieke binding
   1. Breng het rek met de glijbanen naar een Coplin pot gevuld met PBS. Spoel de antigeenbuffer af met PBS 2x voor 5 min per stuk.
   2. Omcirkel de weefselsecties met een PAP-pen om een hydrofobe barrière te creëren. Dompel de dia's onder in een Coplin-pot met 0,1 m glycine in PBS. Incubeer gedurende 15 min bij kamertemperatuur (RT).
      OPMERKING: Glycine verzadigt de aldehydegroepen die worden gegenereerd tijdens het ophalen van antigenen. Deze groepen kunnen primaire en secundaire antilichamen niet specifiek binden.
   3. Spoel de glycine-oplossing af door 2x met PBS te wassen gedurende 5 min. Plaats de dia's in een vochtigheidskamer en voeg voldoende blokkeringsoplossing toe om alle weefselsecties te bedekken. Vermijd het overlopen van de hydrofobe barrière. Incubatie voor 30 min bij RT.
      LET OP: Het recept voor de blokkeringsoplossing is te vinden in de Materiaaltafel. De blokkeringsoplossing moet een eiwit (bsa) bevatten om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren. Het kan ook wasmiddelen zoals Triton X-100 of Tween 20 opnemen die hydrofobe interacties tussen antilichamen en weefseldoelen verminderen, waardoor de antigeenherkenning selectiever wordt. De toevoeging van 10% totaal serum van de soort waar het weefsel vandaan komt zou Blokkeren Fc receptoren, en dus verminderen niet-specifieke antilichaam binding. Ten slotte zou de toevoeging van 10% van het serum van de soorten waarin de secundaire antilichamen werden gekweekt, de directe niet-specifieke hechting van secundaire antilichamen aan de weefselsectie tot een minimum beperken.
4. Immunofluorescentieetikettering
   1. Spoel met PBS-Tween (0,1% v/v) 2x voor 5 min per stuk en plaats de glijbanen terug in de vochtigheidskamer.
   2. Voeg de cocktail van primaire antilichamen opnieuw opgehangen in het blokkeren van de oplossing. 's nachts uitte broeden bij 4 °C. Primaire en secundaire antilichamen die voor deze studie worden gebruikt, zijn opgenomen in De Tabel van Materialen.
      OPMERKING: De cocktail van primaire antilichamen moet antilichamen bevatten die bij verschillende soorten zijn gekweekt, of van dezelfde soort, maar van verschillende isotypes. Voor een lijst van de primaire-secundaire antilichaamparen die in dit onderzoek worden gebruikt, raadpleegtu tabel 2 . Details van alle gebruikte antilichamen staan in de materiaaltafel en tabel 2.
   3. Spoel met PBS-Tween (0,1% v/v) 3x gedurende 5 min en plaats de glijbanen terug in de vochtigheidskamer. Voeg in het donker de cocktail van secundaire antilichamen toe en incubeer 1 uur bij RT.
      OPMERKING: Wanneer de primaire antilichamen van verschillende soorten zijn, moeten de secundaire antilichamen zo worden geselecteerd dat elk van hen zich alleen bindt aan een van de primaire antilichamen en niet aan elkaar. Dit wordt vaak bereikt door het gebruik van secundaire antilichamen die allemaal in dezelfde soort worden gefokt, zolang deze soort verschilt van de soort waar de primaire antilichamen werden gegenereerd. In gevallen waarin de primaire antilichamen bij dezelfde soort zijn gekweekt, maar verschillende isotypen hebben, moeten isotypespecifieke secundaire antilichamen worden gebruikt.
   4. Spoel met PBS-Tween (0,1% v/v) 3x voor 5 min per stuk. Spoel af met ddH₂O. Verwijder overtollige vloeistof en monteer in montagemedia met DAPI. Het gebruikte volume is afhankelijk van de grootte van de sectie. Meestal is 40 μL voldoende om het oppervlak van een gewone microscopiedia te bedekken.
   5. Plaats de deksel schuif op de sectie en voorzichtig knijp uit de overtollige montage media vermijden bubble vorming. Laat de glijbanen 20 minuten drogen bij RT in het donker en bewaar op 4 °C tot ze klaar zijn voor aankoop.
   6. Verkrijg afbeeldingen voor alle kanalen met behulp van de hele diascanner (zie Materiaaltabel).
      OPMERKING: De antilichamen werden gevalideerd met behulp van menselijke hepatocellulaire carcinoma weefsel als een positieve controle. Voor elk primair antilichaam, werden drie seriële secties bevlekt met of primair antilichaam, isotypecontrole, of slechts blokkerend oplossing respectievelijk zonder variatie in de rest van het kleuringsprotocol. De verworven beelden werden vergeleken om de specificiteit van de kleuring vast te stellen. De kleuring werd als specifiek beschouwd toen het signaal in de sectie geïncubeerd met primair antilichaam het verwachte patroon had en gemakkelijk te onderscheiden was van de achtergrond. Primaire antilichamen die een hoog achtergrondsignaal of etiketteringsweefselcomponenten in het isotype gaven en geen primaire antilichaamsecties als niet-specifiek werden beschouwd. De geschatte tijd voor het invullen van dit deel van het protocol is 2 dagen. Vereiste controles omvatten: (1) Isotype controle om de bijdrage van niet-specifieke binding van het primaire antilichaam aan het achtergrondsignaal vast te stellen. Een sectie is gekleurd op dezelfde manier als de andere monsterweefsels, behalve dat het wordt geïncubeerd met een antilichaam met hetzelfde isotype en de oorsprong van het primaire antilichaam, maar specifiek voor een doel dat afwezig is in de weefselsectie. Indien het juiste isotypebestrijdingsantilichaam niet beschikbaar is, kan het worden vervangen door totale IgG van dezelfde soort waar het primaire antilichaam is gekweekt; (2) Geen primaire antilichaamcontrole (d.w.z. negatieve controle) om de specificiteit van de kleuring vast te stellen en de bijdrage van niet-specifieke binding van secundaire antilichamen aan het achtergrondsignaal te schatten. In dit geval wordt de controlesectie op dezelfde wijze gekleurd als de andere secties, behalve dat er geen primair antilichaam wordt toegevoegd; (3) Positieve controle om vast te stellen dat de kleuring werkt. In dit geval wordt de kleuring uitgevoerd op een weefselsectie waarvan bekend is dat de marker die door het primaire antilichaam wordt herkend, wordt herkend.

3. Picro-sirius rood (PSR)/fast green staining protocol

OPMERKING: Het doel van deze kleuring is om fibrillar collageen I en III te visualiseren in de FFPE weefsel secties. Dit protocol werd aangepast van Segnani et al.¹⁸. Alle stappen worden uitgevoerd in een chemische kap.

1. Voer de deparaffine en rehydratie uit van weefselsecties die vergelijkbaar zijn met het multiplex immunofluorescentiekleuringsprotocol voor de FFPE-secties (punt 2.1).
   OPMERKING: Als de te bevlekte sectie eerder is gebruikt voor immunofluorescentielabeling en de paraffine al is verwijderd, zijn de deparaffine-rehydratiestappen nuttig om de montagemedia te verwijderen. DAPI wordt niet verwijderd met behulp van deze procedure, maar het niet waarneembaar interfereren met de PSR vlekken.
2. Dompel de dia's onder in een pot met de picro-sirius rood/snelgroene oplossing (recept in Table of Materials)en incubeer gedurende 30 min bij RT (meer dan 30 min resulteert in niet-specifieke kleuring van de kernen van hepatocyten).
3. Was dia's snel in ddH₂O (5 dips). Dan, snel wassen in ethanol 100% (5 dips). Was voor 30 s in xyleen-100% ethanol (1:1 v/v). Was voor 30 s in xyleen. Monteer met montagemedia (zie Tabel van materialen)voordat xyleen volledig is verdampt (dit helpt bij de montage).
   OPMERKING: De geschatte tijd voor het uitvoeren van dit deel van het protocol is 1 uur.

4. Elutie van antilichamen uit weefselsecties

OPMERKING: Om weefselsecties in sequentiële etiketteringstests te hergebruiken, is volledige verwijdering van primaire en secundaire antilichamen vereist. Gebonden antilichamen werden gestript zoals eerder beschreven¹³.

Verwarm een waterbad voor op 56 °C. Doe de secties in een pot met strippen buffer (recept in Tabel van materialen),sluit het deksel, en sluit het met paraffine film tape om te voorkomen dat lekken tijdens het schudden.

1. Doe de pot in het waterbad en incubeer 30 min met agitatie.
2. Was 4x voor 15 min elk in ddH₂O bij RT. Spoel af met PBS-Tween (0,1% v/v).
3. Houd de secties gehydrateerd in PBS-Tween of water tot u klaar bent om de sectie opnieuw te onderzoeken met de tweede ronde van primaire antilichamen.
   OPMERKING: De geschatte tijd voor het uitvoeren van dit deel van het protocol is 2 uur.
4. Controleer de efficiëntie van de antilichaamelutieprocedure.
   OPMERKING: Voordat het protocol voor antilichaam-elutie wordt gebruikt in een sequentiële etiketteringstest, moet de efficiëntie van het verwijderen van primaire en secundaire antilichamen worden gecontroleerd.
   1. Voer de kleuring en beeldverwerving uit van een sectie met een bepaald primair-secundair antilichaampaar van belang zoals aangegeven in het multiplex immunofluorescentiekleuringsprotocol voor FFPE-secties (secties 2.1–2.4.6).
   2. Bij het verkrijgen van afbeeldingen, verricht de elutie van weefselgebonden primaire-secundaire antilichaamcomplexen zoals aangegeven in de punten 4.1–4.3.
   3. De sectie uitbroeden met hetzelfde secundaire antilichaam en dezelfde voorwaarden die in stap 2.4.3 worden gebruikt.
   4. Voer de stappen voor het wassen, monteren en het verwerven van afbeeldingen uit zoals aangegeven in 2.4.4–2.4.6.
   5. Vergelijk naast elkaar verworven beelden voor en na het strippen om vast te stellen of het specifieke signaal al dan niet is verdwenen.
      OPMERKING: Vergelijking van afbeeldingen voor en na het verwijderen van antilichamen zal de efficiëntie van de elutieprocedure valideren. Het is echter normaal om een toename van het achtergrondsignaal in alle kanalen te zien, evenals verspreiding van DAPI. Dit beperkt het aantal rondes van strippen die kunnen worden uitgevoerd op dezelfde weefselsectie. Drie rondes strippen lijken het maximum te zijn.

5. Beeldverwerving

1. Afbeeldingen genereren met een hele diascanner.
2. Gebruik een 20x 0,75NA objectieve lens en een resolutie van 0,3225 μm/pixel.

6. Beeldanalyse

OPMERKING: De hier beschreven methode verwijst naar het huidige voorbeeld. Raadpleeg tabel 1 en de tekst om zich aan te passen aan andere specifieke voorbeelden.

1. Weefseluitlijning uitvoeren met behulp van de Tissualign-module van de beeldanalysesoftware (VIS in dit protocol, zie Materiaaltafel).
   1. Open de software voor beeldanalyse en klik op het tabblad Tissuealign.
   2. De afbeeldingen importeren die in de dialade moeten worden uitgelijnd door naar Bestand te gaan | Database en selecteer de eerste afbeelding die moet worden uitgelijnd. Ga terug naar het tabblad Tissuealign en laad de afbeelding door op de knop Laden in de dialade teklikken. De afbeelding wordt weergegeven in de dialade en in de werkruimte.
      OPMERKING: Alleen de stapel rente mag in de schuiflade worden geladen.
   3. Herhaal stap 6.1.2 voor alle afbeeldingen in de volgorde die moet worden uitgelijnd en laad ze één voor één. Zodra alle afbeeldingen van belang op de dialade zijn geladen, wordt de afbeelding gekoppeld door op Volgende te drukken in de werkstroomstappen op het lint.
   4. Sleep vervolgens de tweede afbeelding boven op de eerste afbeelding en zet deze neer. De eerste en tweede beelden zijn nu gekoppeld. Herhaal deze stap voor de andere beelden worden uitgelijnd, een voor een, in een ordelijke manier. De naam van de eerste afbeelding verandert, wat aangeeft dat deze is gekoppeld aan de andere afbeeldingen. Tegelijkertijd worden de gekoppelde afbeeldingen weergegeven in de werkruimte rechts van de dialade.
   5. Lijn de afbeeldingen op dit punt uit met automatische uitlijning, halfautomatische uitlijning of handmatige uitlijning. Het is altijd beter om eerst automatische uitlijning te proberen. Voor automatische uitlijning drukt u op de knop Volgende in de werkstroomstappen (stap 3) op het lint.
   6. Controleer de automatische uitlijning door door verschillende locaties van het weefsel te navigeren en visueel te controleren of de overeenkomstige structuren in verschillende afbeeldingen op dezelfde manier zijn gerangschikt in de twee dimensies van de afbeelding.
   7. Als het resultaat van de automatische uitlijning niet bevredigend is, u deze verbeteren met behulp van pinnen (gebruik minimaal drie pinnen per afbeelding) die homologe weefselkenmerken in de gekoppelde afbeeldingen aangeven. Zodra de pinnen op homologe locaties in de gekoppelde afbeeldingen zijn geplaatst, heeft de gebruiker twee keuzes: semi-automatische uitlijning of handmatige uitlijning. Voor semiautomatische uitlijning klikt u op de knop Automatisch uitlijnen op basis van de huidige pinpoints in het lint. Klik voor handmatige uitlijning op de knop Pins toepassen op het lint.
   8. Wanneer u tevreden bent met de uitlijning, klikt u op de knop Volgende in de werkstroomstappen en slaat u de samengestelde afbeelding op in de database.
      OPMERKING: Het uitlijnen van zes dia's van 11 markeringen plus de H&E- en PSR-afbeeldingen duurde 15 min in de gepresenteerde analyse.
2. Weefseldetectie uitvoeren met behulp van het door de gebruiker gedefinieerde protocol Analysis Protocol Package 1 (APP 1, Tabel 1).
   1. Open de module Afbeeldingsanalyse van de software door op het tabblad Afbeeldingsanalyse op het lint te klikken.
   2. De samengestelde (uitgelijnde) afbeelding importeren door naar Bestand te gaan | Database en het selecteren van de afbeelding van belang en het terugklikken op het tabblad Afbeeldingsanalyse.
   3. Open het dialoogvenster APP-selectie door op het pictogram APP openen te klikken en selecteer welk Analysis Protocol Package (APP) u wilt gebruiken. Selecteer in dit geval APP 1 voor weefseldetectie.
   4. Zodra APP 1 is geopend, bevestigt u dat APP1 naar behoren werkt door naar een geselecteerde weefsellocatie te gaan en op de knop Voorbeeld te klikken. Als de resultaten bevredigend zijn, ga dan naar de volgende stap.
   5. Klik hier om APP 1 uit te voeren en de afbeelding te verwerken met de geselecteerde APP.
   6. Exporteer de gegevens (bijvoorbeeld afbeeldingen, metingen, enz.) wanneer de analyse wordt uitgevoerd door op Bestand/exporteren te klikken.
      OPMERKING: APP 1 maakt een gebied van belang (ROI) dat het weefsel (ROI Tissue) afgebakt en berekent het gebied van het weefsel.
   7. Sla de gewijzigde afbeelding op met de nieuw gecreëerde ROI door naar Bestand te gaan | Bewaar.
      OPMERKING: Het detecteren van het weefsel en het creëren van een ROI met APP 1 in het meegeleverde voorbeeld nam 5 min in het beeldanalysestation beschreven. Het gebied van het verwerkte weefsel was 3,2 cm².
3. Weefselsegmentatie uitvoeren in Stroma en Parenchyma met behulp van APP 2 (Tabel 1).
   LET OP: APP 2 werkt aan het vooraf gedefinieerde ROI Tissue. APP 2 segmenteert het weefsel in de ROIs Stroma en Parenchyma.
   1. Open de module Afbeeldingsanalyse door op het tabblad Afbeeldingsanalyse op het lint te klikken.
   2. De afbeelding met het ROI-weefsel importeren door naar Bestand te gaan | Database en het selecteren van de afbeelding die is opgeslagen in stap 6.2.7. Ga terug naar het tabblad Afbeeldingsanalyse en laad de afbeelding door op de knop Laden in de dialade teklikken. De afbeelding wordt weergegeven in de dialade en in de werkruimte.
   3. Open APP 2 met het dialoogvenster APP-selectie zoals in 6.2.3.
   4. Bekijk een voorbeeld van APP 2 door te verwerken in een geselecteerd gezichtsveld. Als de resultaten bevredigend zijn, voert u APP 2 op de volledige afbeelding uit door op de knop Uitvoeren te klikken. Als de output van APP 2 wordt het ROI-weefsel gesegmenteerd in de ROIs Stroma en Parenchyma en hun respectieve gebieden bepaald. Exportresultaten in 6.2.6. Sla de gewijzigde afbeelding op zoals in 6.2.7.
      OPMERKING: Het segmenteren van het weefsel in Stroma en Parenchyma met behulp van APP 2 duurde 4 uur in het gepresenteerde analysestation. Het gebied van het verwerkte weefsel was 3,2 cm².
4. Identificeren en kwantificeren foxp3^hiCD4 + cellen met behulp van de door de gebruiker gedefinieerde protocol APP 3 (Tabel 1).
   LET OP: APP 3 werkt aan de vooraf gedefinieerde ROIs Stroma en Parenchyma.
   1. Open de module Beeldanalyse en importeer de afbeelding met de ROI's Stroma en Parenchyma zoals in 6.3.1 en 6.3.2. Open APP 3 met het dialoogvenster APP-selectie zoals in 6.2.3.
   2. Voorbeeld van APP 3-verwerking in een geselecteerd gezichtsveld dat is verrijkt met FoxP3^hiCD4+-cellen. Als de resultaten bevredigend zijn, voert u APP 3 op de volledige afbeelding uit. Als de output van APP 3, alle individuele FoxP3^hiCD4 + objecten zullen worden gelabeld en hun weefsel coördinaten opgeslagen. Dichtheden van FoxP3^hiCD4+ objecten in de ROIs Stroma en Parenchyma worden bepaald. Exporteer de resultaten in 6.2.6.
   3. Voer weefsel heatmapping van FoxP3^hiCD4 + gelabeld objecten uit.
      1. Open het door de gebruiker gedefinieerde protocol FoxP3^hiCD4+ MAP met het dialoogvenster APP-selectie zoals in 6.2.3.
         OPMERKING: FoxP3^hiCD4+ MAP gebruikt de coördinaten van FoxP3^hiCD4+ gelabelde objecten voor het genereren van heatmaps voor dichtheid. Het identificeren en tellen van FoxP3^hiCD4+ gelabelde objecten met behulp van APP 3 nam 25 minuten in het beschreven beeldanalysestation. Het gebied van het verwerkte weefsel was 3,2 cm².
      2. Voer FoxP3^hiCD4+ MAP uit door op de knop Uitvoeren te drukken. De warmtemap van het weefsel exporteren door op Bestand te klikken | Uitvoer | Werkgebied.
         OPMERKING: Het in kaart brengen van FoxP3^hiCD4+ gelabelde objecten met FoxP3^hiCD4+ MAP nam 5 minuten in het beschreven beeldanalysestation.
5. Identificeren en kwantificeren van CD8+, CD68+, MPO+, αSMA en CD34 + objecten met behulp van de door de gebruiker gedefinieerde protocollen APP 4, APP5, APP6, APP7 en APP 8 , respectievelijk (tabel 1) zoals gedaan in de afdeling 6.4 tot en met 6.4.3.2 het laden van de APP van belang in elk geval.
   OPMERKING: APP's 4 tot 8 werken aan de vooraf gedefinieerde ROIs Stroma en Parenchyma.

Results

Overzicht van de strategie voor het visualiseren, kwantificeren en in kaart brengen van celpopulaties die van belang zijn voor de TME
Om celpopulaties van belang (COI's) in verschillende weefselcompartimenten (CC's) te kwantificeren en hun ruimtelijke organisatie te karakteriseren, ontwierpen we een workflow die betaalbare en gebruiksvriendelijke technieken integreert en de positionele informatie maximaliseert die kan worden verkregen uit kostbare FFPE klinische specimens (figuur 1). Ten eerste werden de ffpe-secties van seriële hele weefsel gekleurd voor visualisatie van COI's (bijvoorbeeld immuuncellen) en tv's (bijvoorbeeld stroma versus parenchyma) (figuur 1, stap 1). Het aantal opeenvolgende secties dat moet worden gekleurd, moet tot een minimum worden beperkt dat visualisatie mogelijk maakt van de cellen van belang of weefselkenmerken die nodig zijn voor het aanpakken van de onderzoeksvraag. Hoe kleiner het aantal seriële secties, hoe hoger de weefselarchitectuur gelijkenis en concordantie over aaneengesloten secties. Bovendien kan de multiplexing mogelijkheid worden uitgebreid door hergebruik van fluorescerende gekleurde secties door middel van strippen en reprobing technieken¹⁹.

Zodra de kleuringstappen waren gedaan, werd een hele diascanner gebruikt om de beelden te digitaliseren. Afbeeldingen die zijn verkregen uit seriële secties werden op geautomatiseerde wijze uitgelijnd en geconsolideerd in een virtuele multiplex-dia(figuur 1, sectie 2). Vervolgens werd een ROI voor het weefsel afgebakend met een door de gebruiker gedefinieerd protocol dat weefselgeassocieerde pixels (TAP's)(figuur 1, stap 3) identificeerde. Vervolgens werd het ROI-weefsel gesegmenteerd in TAC's gedefinieerd als extra ROI's. (Figuur 1, stap 4). Vervolgens gedetecteerde en gekwantificeerde door de gebruiker gedefinieerde protocollen in verschillende TV's(figuur 1, stap 5). Ten slotte werden weefselheatmaps van COI's gegenereerd op basis van hun dichtheden en hun weefselcoördinaten (figuur 1, stap 6).

Figuur 1: Schematische weergave van de strategie voor het visualiseren, kwantificeren en in kaart brengen van immuuncellen in de TME. (1) Seriële hele weefsel secties werden gekleurd voor etikettering COI's en TV's. Gekleurd hele weefsel secties werden gedigitaliseerd met behulp van een hele diascanner. (2) Beelden verkregen uit seriële secties werden gekoppeld, uitgelijnd en medegeregistreerd op een geautomatiseerde manier met behulp van een Tissuealign analyse module. Een samengesteld beeld werd gegenereerd uit de hoge precisie uitlijning van individuele beelden. (3) Een door de gebruiker gedefinieerd protocol werd gebruikt voor geautomatiseerde detectie van weefselgeassocieerde pixels (TAP's) in de samengestelde afbeelding. (4) Het weefsel werd gesegmenteerd in TV's (bijvoorbeeld stroma en parenchyma) gedefinieerd als ROI's. (5) Gebruikersprotocollen werden gebruikt voor de geautomatiseerde detectie en kwanting van COI's in verschillende TV's. (6) Weefselheatmaps van COI's werden gegenereerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Imaging COI's en TV's
Drie seriële FFPE hele weefsel secties van resected tumor van een onderwerp met HBV-geassocieerde hepatocellulaire carcinoma werden gekleurd in een of meer rondes van vlekken als in figuur 2A. Sectie I was bevlekt met H&E om de weefselarchitectuur, celmorfologie, te tonen, en klinisch relevante parameters zoals type maligniteit, tumorrang, en algemene beoordeling van immune infiltratie (Figuur 2C)te bepalen. In aaneengesloten sectie II werden twee rondes mIF gebruikt voor het labelen van leverparenchymale en niet-parenchymale cellen (figuur 2A). In de eerste ronde werden normale en tumorvaten gevisualiseerd met cd34-kleuring van endotheelcellen. Bovendien werden epitheliale cellen (hepatocyten en cholangiocyten) geïdentificeerd met behulp van cytokeratine 8/18, en fibrogene geactiveerde leverstellaatcellen werden geïdentificeerd als alfagladde spieractin positieve (αSMA+) cellen (figuur 2C). Na beeldverwerving werden weefselsecties ontdaan en gereprobeded met antilichamen tegen macrofagen (CD68) en myofibroblasten (desmin). Om beter te karakteriseren de tumor immuun infiltreren, aangrenzende seriële sectie III werd gekleurd met behulp van twee rondes van mIF voor de cellulaire markers CD3, CD4, CD8, forkhead box P3 (FoxP3), en myeloperoxidase (MPO). In alle gevallen werd DAPI gebruikt als een nucleaire tegenvlek. Ten slotte werd sectie III bevlekt met PSR-vlek en tegengehouden met snel groen om fibrillar collageen te visualiseren en het weefsel te segmenteren in stroma en parenchyma(figuur 2C).

Een hele diascanner uitgerust met een 20X objectieve lens werd gebruikt om gekleurde secties te digitaliseren en om virtuele dia's te maken. Zes beelden werden verkregen uit de drie seriële secties (figuur 2B) en de virtuele dia's vervolgens geanalyseerd met behulp van de VIS-software volgens de schematische weergave in figuur 1.

Beeldanalyse
De beeldanalyse bestond uit vijf stappen: 1) weefseluitlijning; 2) weefseldetectie; 3) weefselsegmentatie; 4) geautomatiseerde kwants; en 5) het in kaart brengen van weefselwarmte. Alle protocollen voor beeldanalyse zijn ontwikkeld met behulp van de module Auteur van de beeldanalysesoftware en worden in de tekst APP genoemd.

Uitlijning van het weefsel
Zes virtuele dia's uit drie seriële secties, verspreid over 11 markers plus H&E- en PSR-vlekken, werden in de Tissualign-module van de beeldanalysesoftware geladen. Vervolgens werden de afbeeldingen op een geautomatiseerde manier gekoppeld, uitgelijnd en medegeregistreerd, waardoor een virtuele samengestelde afbeelding van 11 plex plus H&E en PSR werd gemaakt, met alle lagen van de afzonderlijke afbeeldingen(figuren 2A–C). De uitlijning was nauwkeurig in het geval van afbeeldingen afkomstig van aangrenzende seriële secties, met overeenkomstige weefselstructuren die bij uitlijning op een homologe manier zijn geplaatst en gerangschikt(figuur 2C en figuur S1A). Bovendien was de uitlijning nauwkeurig op het individuele celniveau voor afbeeldingen die afkomstig zijn van dezelfde sectie(figuur S1B). De tijd voor automatische uitlijning is afhankelijk van het aantal, de grootte, de complexiteit en de gelijkenis van de afbeeldingen die moeten worden uitgelijnd. De uitlijning van de bovengenoemde zes virtuele glijbanen duurde 15 min in ons VIS-station.

Figuur 2: Kleuring van seriële weefselsecties en beelduitlijning. (A) Samenvatting van kleuringen gedaan op drie seriële secties voor visualisatie van COI's en TV's. Nummers tussen haakjes geven beeldaanduiding. Voor de secties II en III werden weefsels gestript en gereprobeded met een tweede cocktail van antilichamen. BB) Overzicht van zes afzonderlijke hele weefselbeelden voor en na weefseluitlijning (respectievelijk links en rechts). Schaalbalk = 3.500 μm. (C) Ingezoomde weergave van uitgelijnde afbeeldingen. Schaalbalk = 80 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Weefseldetectie
Zodra de beelden werden gekoppeld en uitgelijnd, hebben we geprobeerd om de TAP's te identificeren (Figuur 3A). Om een APP te ontwerpen voor de geautomatiseerde detectie van TAP's (APP 1, Tabel 1),hebben we gebruik gemaakt van twee eigenschappen die TAP's onderscheiden van pixels die niet zijn gekoppeld aan weefsel. Ten eerste is het DAPI-signaal (blauwe band) beperkt tot de kernen, die zich uitsluitend in het weefsel bevinden, wat betekent dat alle DAPI+-pixels een subset van TAP's zijn. Ten tweede, TAP's hebben een hogere autofluorescentie signaal in de groene en gele banden in vergelijking met pixels niet geassocieerd met het weefsel. Daarom hebben we APP 1 ontwikkeld voor weefseldetectie(tabel 1),dat de TAP's detecteert op basis van het uitgangssignaal in deze kanalen met behulp van eenvoudige drempelstechnieken. Drempelwaarden voor de blauwe, groene en gele banden werden zo ingesteld dat TAP's achtergrondintensiteitwaarden boven de drempelwaarden hadden, terwijl pixels die niet aan het weefsel zijn gekoppeld, onderstaande waarden hadden. APP 1 voor weefseldetectie werd toegepast op afbeelding IIA, die lagen bevat in de blauwe, groene en gele kanalen(figuur 3A). Als uitgangen van APP 1, een helder groen masker werd vastgesteld op de top van de TAP's, en een ROI genaamd "Tissue" werd afgebakende (output, figuur 3A). Bovendien werd het gebied van het weefsel bepaald als een kwantitatieve outputvariabele. Omdat APP 1 de pixels die niet aan het weefsel zijn gekoppeld, niet in het ROI-weefsel verwerkt, zijn ze uitgesloten van latere analyse op basis van deze ROI(figuur 3A). De nauwkeurigheid van APP 1 bij het identificeren van TAP's wordt weergegeven in figuur 3A.

Weefselsegmentatie en afbakening van ROI's voor tv's
Vervolgens gingen we over tot het definiëren van verschillende compartimenten in het ROI-weefsel door het weefsel te segmenteren in stroma versus parenchyma. We gebruikten de PSR gekleurd beeld (IIIC, Figuur 2C), waar de stroma kan worden gedefinieerd als het gebied in verband met de afzetting van fibrillar collageen (rode band), de parenchyma als het gebied waar fibrillar collageen zijn afwezig, en de snelle groene tegenvlekken kleurstof heerst (groene band) (Figuur 3B). We hebben APP 2 (Tabel 1) gemaakt om de tcs Stroma en Parenchyma digitaal af te sluiten. Dit APP werkt op het vooraf gedefinieerde ROI Tissue (output, figuur 3A)en maakt gebruik van representatieve stroma- en parenchyma-gebieden voor het trainen van het classifier-gereedschap dat is geïntegreerd in de module Beeldanalyse. De getrainde Classifier wijst de pixels toe aan een stroma of een parenchyma-label (respectievelijk zalm en groen, figuur 3B). Bij de classificatie van pixels voerde APP 2 morfologische bewerkingen uit met als doel het definiëren van de ROIs Stroma en Parenchyma(figuur 3B en tabel 1). De prestaties van APP 2 bij het classificeren van pixels en het genereren van de respectieve ROI's worden weergegeven in figuur 3B. Daarnaast kwantificeert APP 2 het gebied van de stroma en het parenchyma. Ten slotte, hoewel de segmentatie wordt gedaan met behulp van de PSR gekleurde sectie, de geschetste stroma en parenchyma regio's kunnen worden overgedragen naar een afbeelding uitgelijnd op de PSR-afbeelding.

Figuur 3: Geautomatiseerde weefseldetectie/segmentatie en generatie van de respectieve ROI's. (A) Image IIA werd gebruikt om de TAP's te identificeren (linkerafbeelding, schaalbalk = 6.000 μm). Een helder groen masker werd toegewezen aan de TAP's met behulp van APP 1(Tabel 1) het genereren van een ROI genaamd Tissue (output 1). Rechts, instel toont ingezoomde weergave die de precisie van APP 1 demonstreert bij het detecteren van TAP's. Schaalbalk = 350 μm. (B) Het ROI Tissue (uitgang 1) wordt gesegmenteerd in stroma en parenchyma met behulp van APP 2. De afbeelding aan de linkerkant toont een weergave van de ROI Tissue gesegmenteerd in ROI stroma (zalm) en ROI parenchyma (groen). Schaalbalk = 4.500 μm. Aan de rechterkant, ingezoomde weergaven van de set voor ROI Tissue, de oorspronkelijke PSR kleuring (afbeelding IIIC), en de ROIs stroma en parenchyma. Schaalbalk = 250 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Geautomatiseerde kwantificatie van COI's
Vervolgens zijn we overgegaan tot het identificeren, lokaliseren en kwantificeren van COI's in de ROIs Stroma en Parenchyma. APP's 3 tot en met 8 (tabel 1) zijn gemaakt om respectievelijk de volgende COI's te lokaliseren en te tellen: CD4+FoxP3+, CD8+, CD68+, MPO+, αSMA+, en CD34+- cellen. APP 3 is ontworpen om CD4+FoxP3+-cellen (afbeelding IIIA, figuur 2C)te lokaliseren en te tellen als surrogaatmarkeringen van regelgevende T-cellen (Tregs). Dit protocol detecteert colokalisatie van het signaal van de nucleaire transcriptiefactor FoxP3 (rode band) en de DNA-etiketteringskleurstof DAPI (blauwe band). Gezien het feit dat onlangs geactiveerdE T-cellen upregulate FoxP3, te verrijken voor Tregs stellen we drempels voor het vooraf selecteren van alleen heldere FoxP3 + cellen (FoxP3^hi). Vervolgens, van alle vooraf geselecteerde DAPI + FoxP3^hi cellen, alleen degenen die werden omringd door heldere ringvormige CD4-signalen (groene band) werden geëtiketteerd en geteld als FoxP3^hiCD4 + cellen (roze label, figuur 4A). De dichtheid van FoxP3^hiCD4+ cellen in de ROIs Stroma en Parenchyma werd bepaald als kwantitatieve uitgangsvariabelen van APP 3 (Figuur 4A).

Apps 4 tot 6 zijn ook ontworpen voor de detectie van CD8+-, CD68+- en MPO+-cellen. Deze ASP's hebben hetzelfde basisontwerp voor het detecteren en kwantificeren van COI's. In het bijzonder worden COI's geïdentificeerd op basis van de signaalintensiteit van de specifieke biomarker van de celpopulatie, waarna verschillende postprocessing-morfologische stappen worden uitgevoerd om individuele cellen af te definiëren(tabel 1). De afzonderlijke cellen of COI's worden geëtiketteerd, geteld en hun weefselcoördinaten geregistreerd. Apps 4 t/m 6 bepalen ook de dichtheid van de COI's in de ROIs Stroma en Parenchyma (figuur 4B–D).

De kwaliteit van onze DAPI-kleuring was niet goed genoeg voor het integreren van kernensegmentatie in APP's 3 tot 6, dus we kunnen er niet voor zorgen dat alle individueel gelabelde objecten individuele cellen zijn. Om deze reden hebben we de dichtheid van cellen uitgedrukt in tellingen van gelabelde objecten/mm² (figuur 4). Celaggregaten werden echter met succes gescheiden in afzonderlijke cellen in de nabewerkingsstappen die in APP's 3 tot 6 zijn ingebouwd, en uitgebreide visuele inspectie toonde aan dat de meeste gelabelde objecten overeenkwamen met afzonderlijke cellen.

Voor het detecteren van αSMA+ en CD34+ gebied ontwikkelden we respectievelijk APPs 7 en 8(tabel 1). Beide APP's detecteren het specifieke signaal op basis van drempels en bepalen het percentage positieve gebied in de ROIs Stroma en Parenchyma (figuur 4E–F).

Een van de meest interessante mogelijkheden van het genereren van virtuele multiplex dia's is de analyse van colocalisatie expressie. We genereerden APP 10 om colokalisatie tussen αSMA en desmin te detecteren, twee markers die mede tot uitdrukking komen door myofibroblasten in de lever. APP 10 gebruikt drempels voor het vinden van pixels die positief zijn voor αSMA, desmin en αSMA plus desmin (tabel 1). Als kwantitatieve uitgangsvariabelen bepaalt APP 10 het αSMA+-gebied, het desmin+-gebied en het gebied van colocaliseerde expressie van deze twee markeringen (figuur S3).

Figuur 4: Identificatie en kwantificering van COI's in de TAC's stroma en parenchyma. (A–F) Geautomatiseerde detectie en kwantificering van CD4+FoxP3+, CD8+, CD68+, MPO+, αSMA+, en CD34+ COI's in de ROIs Stroma en Parenchyma met behulp van respectievelijk de protocollen 3, 4, 5, 6, 7 en 8 (Tabel 1). Links worden de originele afbeeldingen weergegeven, in het midden de verwerkte beelden en rechts de kwantificeringen. Voor figuren 4A–D, schaalbalk = 40 μm. Voor figuren 4E en F, schaalbalk = 350 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Als alternatief voor het kwantificeren van de COI's in de TAC's Stroma en Parenchyma, hebben we de dichtheid van immuuncellen in de verschillende kwaadaardige knobbeltjes genoemd 1 tot 4 (Figuur 5A, H, en I). De ROI voor elke knobbel werd handmatig afgebakend zoals aangegeven in figuur 5A. Onderscheidende weefsel immuunsignatuur kenmerkte elke knobbel, verder onthullen de intrinsieke heterogeniteit van de TME.

Tissue Heatmaps
Zoals hierboven vermeld, bewaren APP's 3 tot 8 de weefselcoördinaten van elk afzonderlijk gelabeld object. Deze functie maakt het mogelijk de geautomatiseerde generatie van weefselkaarten waar regio's met een hoge dichtheid van een bepaalde celpopulatie worden weergegeven als hotspots (rood) en regio's met een relatief lage dichtheid als koude vlekken (donkerblauw). Tussenliggende dichtheidswaarden worden toegewezen kleuren volgens de kleurschaal weergegeven in figuur 5. Weefsel heatmaps werden gegenereerd door APPs die de beelden verdeeld in cirkels van 50 μm diameter en toegewezen een kleur volgens de relatieve dichtheid van een bepaalde COI binnen de cirkel. Zoals weergegeven in figuur 5B-G, waren de positioneringspatronen en intensiteitsverdeling van de verschillende COI's in de TME zeer gevarieerd. Bovendien was op het niveau van de individuele knobbeltjes de indeling van verschillende populaties in het weefselgebied uniek (Figuur S2A–C). Om een voorbeeld te geven van de kracht van deze techniek en om de ruimtelijke organisatie van hotspots van verschillende populaties in dezelfde knobbel te visualiseren, werden de hotspots van individuele celtypen handmatig geëxtraheerd en samen in kaart gebracht op de omtrek van knobbel 2 (Figuur S2, Figuur Den Figuur E).

Figuur 5: Weefselheatmaps van COI's in de TME. (A) Picrosirius Rode kleuring met locatie van knobbeltjes 1, 2, 3 en 4. (B–G) Tissue heatmaps voor cd4+FoxP3+, CD8+, CD68+, MPO+, CD34+, en αSMA+ COI's, respectievelijk. Donkerblauw geeft een relatief lage dichtheid aan en rood geeft een relatieve hoge dichtheid aan. Tussenliggende dichtheidswaarden worden toegewezen kleuren op basis van de getoonde kleurschaal. (H en I) Kwantificering van COI's in knobbeltjes 1, 2 en 3 + 4 georganiseerd per celtype en per knobbel, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullend figuur S1: Validatie van weefseluitlijning. (A) CD34-kleuring (in het rood) gedaan op sectie II (ingang 1) wordt gebruikt voor het genereren van een CD34-masker in het groen (uitvoer 1). Het groene masker (uitvoer 1) is bedekt met de H&E-afbeelding van de uitgelijnde seriële sectie I (invoer 2). Het samenvoegbeeld toont perfecte correspondentie van vasculaire structuren. Schaalbalk = 50 μm. (B) Afbeelding IIIA met de samenvoeging van DAPI, CD4 en FoxP3 (input 1) werd gebruikt om een label te genereren voor CD4+FoxP3+ cellen (uitvoer 1 in magenta). Uitvoer 1-label is overgebracht naar uitgelijnde afbeelding IIIB (invoer 2) en toont perfecte correspondentie tussen de paren FoxP3/DAPI en CD4/CD3 in de samenvoegafbeelding. Schaalbalk = 15 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende figuur S2: Ingezoomde weergave van weefselheatmaps. (A–C) Weefselheatmaps voor CD4+FoxP3+, CD8+, CD68+, en MPO+ cellen in knobbeltjes 1–4. Schaalbalken in knobbeltjes 1, 2 en 3 + 4 vertegenwoordigen respectievelijk 1.500 μm, 700 μm en 500 μm. (D) Overzicht van nodule 2 met zwarte vaste lijn. (E) Hot spots voor CD4+FoxP3+, CD8+, CD68+, en MPO+ cellen in nodule 2 werden geëxtraheerd en samen in kaart gebracht op de nodule 2 omtrek gedefinieerd in D. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende figuur S3: Colocalisatie Analyse. (A) Links en midden staan afbeeldingen van αSMA-label in groen en desmin label in rood respectievelijk. Aan de rechterkant is een αSMA/desmin dubbel positief gebied in geel. (B) Kwantificering van αSMA+ gebied, desmin + gebied, en αSMA/desmin double positive area. Schaalbalk = 150 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

App	Purpose	Indeling	Indeling	Stappen na verwerking	Uitvoervariabelen
		Methode	Functies
			(pixelwaarde)
1	Weefseldetectie	Drempel	KanaalDAPI (150)	o Objecten labelen met colocaliseerde bovendrempelwaarden voor de 3 kanalen	o ROI Tissue
			Kanaal FITC/A488 (120)	o Positief object 5 pixels sluiten	o Weefselgebied
			Kanaal TRITC/A568 (40)	o ROI Tissue maken
2	Weefselsegmentatie	Besluit Bos	RGB-R mediaan	o Vulgaten	o ROI Stroma
			RGB-G mediaan	o ROI Stroma maken	o Stroma Gebied
			RGB-B mediaan	o ROI Creëren Parenchyma	o ROI Parenchyma
			IHS-S mediaan		o Parenchyma-gebied
			H&E Eosin mediaan
3	Cd4+ FoxP3+-cellen lokaliseren en kwantificeren	Drempel	KanaalDAPI (>600)	o Labelobjecten met colokalisatie van DAPI en Cy5/A647, omgeven door FITC/A488-signaal	o Tellingen en dichtheid van CD4+FoxP3+ cellen in ROIs Stroma en Parenchyma
			Kanaal FITC/A488 poly smoothing (>850)	o Objecten wissen kleiner dan 7 μm2	o Coördinaten van afzonderlijke CD4+FoxP3+-cellen
			Kanaal Cy5/A647(>800)
4	Cd8+ cellen lokaliseren en kwantificeren	Drempel	Kanaal DAPI (<1200)	o Positieve objecten wissen kleiner dan 15 μm2	o Tellingen en dichtheid van CD8+ cellen in ROIs Stroma en Parenchyma
			Kanaal Cy5/A647 mediaan (>80)	o Positieve objecten 2 pixels sluiten	o Coördinaten van afzonderlijke cellen
				o Afzonderlijke objecten
5	Cd68+ cellen lokaliseren en kwantificeren	Drempel	Kanaal FITC/A488 (>200)	o Positieve objecten wissen kleiner dan 20 μm2	o Tellingen en dichtheid van CD68+ cellen in ROIs Stroma en Parenchyma
				o Verwijden positieve objecten 3 pixels	o Coördinaten van afzonderlijke CD68+-cellen
				o Afzonderlijke objecten
6	MPO+-cellen lokaliseren en kwantificeren	Drempel	KanaalDAPI (>400)	o Objecten wissen kleiner dan 5 μm2	o Tellingen en dichtheid van MPO+ cellen in ROIs Stroma en Parenchyma.
			Kanaal TRITC/A568 (900-4000)	o 3 pixels positieve objecten verwijden	o Coördinaten van individuele MPO+-cellen.
				o Afzonderlijke objecten
7	ΑSMA+ gebied lokaliseren en kwantificeren	Drempel	Kanaal TRITC/CF568 (>1050)	o Positieve objecten wissen kleiner dan 25 μm2	o Tellingen en dichtheid van αSMA+ gebied in ROIs Stroma en Parenchyma
				o 3 pixels positieve objecten verwijden	o Coördinaten van αSMA+-pixels
8	Cd34+-gebied lokaliseren en kwantificeren	Drempel	Kanaal DAPI (<5000)	o Positieve objecten wissen kleiner dan 25 μm2	o Tellingen en dichtheid van cd34+ gebied in ROIs Stroma en Parenchyma
			Kanaal Cy5/A647 mediaan (>120)	o 3 pixels positieve objecten verwijden	o Coördinaten van CD34+ pixels
9	Maak weefselheatmaps voor een bepaalde celpopulatie	Objectheatmap	Objectheatmap		o Heatmap
			Tekenradius 50 μm	---
10	Colokalisatie tussen αSMA en Desmin kwantificeren	Drempel	KanaalTRITC (CF568) (>1050)	o Labelobjecten met bovendrempelwaarden voor TRITC (CF568)	o Colocalized expression of αSMA and Desmin kwantificeren
			Kanaal Cy5 (A647) (>1000)	o Labelobjecten met bovendrempelwaarden voor Cy5 (A647)
				o Labelobjecten met colokalisatie van bovendrempelwaarden voor TRITC (CF568) en Cy5 (A647)
				o Positieve objecten wissen kleiner dan 25 μm2

Tabel 1: Algemene parameters die worden gebruikt voor het ontwerp van APP's die worden gebruikt voor beeldanalyse. De parameters die in deze tabel worden opgegeven, worden aangepast aan de unieke kenmerken van de afbeeldingen die in deze analyse worden gebruikt (bijvoorbeeld achtergrond, artefacten, enz.) en zijn mogelijk niet van toepassing op andere afbeeldingen. Omdat de genoemde nabewerkingsstappen zijn gedefinieerd voor de specifieke beelden die in deze studie worden geanalyseerd, zijn ze opzettelijk niet gedetailleerd. De gebruiker moet de APPs aanpassen aan de te analyseren afbeeldingen.

Sectie/kleuring	Primair antilichaam	Secundair antilichaam
Afdeling II/1Kleuring	Muis IgG2a anti-menselijke αSMA Muis IgG1 anti-menselijke CD34 Konijn anti-menselijke Cytokeratine 8/18	Geit anti-muis IgG2a CF568 Rat anti-muis IgG1 A647 Ezel anti-konijn A488
Afdeling II/2nd Kleuring	Konijn anti-menselijke Desmin Muis anti-menselijke CD68	Ezel anti-konijn A647 Ezel anti-muis DyLight 755
Afdeling III/1Kleuring	Muis anti-menselijke CD4 Konijn anti-menselijke FoxP3 Geit anti-menselijke MPO	Ezel anti-muis A488 Ezel anti-konijn A647 Ezel anti-geit A568
Afdeling III/2nd Kleuring	Konijn anti-menselijke CD3 Muis anti-menselijke CD8	Ezel anti-muis DyLight 755 Ezel anti-konijn A647

Tabel 2: Primair-secundaire antilichaamparen voor mIF.

Discussion

Eenvoudige, toegankelijke en eenvoudig uit te voeren multiplexing technieken die ruimtelijke resolutie van immuuncellen in weefselsecties mogelijk maken zijn nodig om het immuunsysteem landschap in kaart te brengen bij kanker en andere immunologische aandoeningen. Hier beschrijven we een strategie die op grote schaal beschikbare etikettering scan- en digitale analysetechnieken integreert om de multiplexingcapaciteit en multidimensionale beoordeling van beeldvormingstesten uit te breiden^12,13,17,19. De kleuring van drie seriële secties voor verschillende markers, en het hergebruik van secties door middel van strippen en slijpen technieken, stelde ons in staat om 11 parameters te visualiseren in aanvulling op H & E en PSR vlekken. Zes beelden uit deze secties werden op een geautomatiseerde manier uitgelijnd met behulp van de weefseluitlijningsmodule. De uitlijning was nauwkeurig op het individuele celniveau voor afbeeldingen die afkomstig zijn van dezelfde sectie en zeer concordant voor afbeeldingen afkomstig van naburige secties. Virtuele multiplexing stelde ons in staat om te bepalen hoe markers gevisualiseerd in een sectie ruimtelijk betrekking hebben op markers gevisualiseerd in een andere aaneengesloten sectie. Terwijl sommige van de kleuringen gelabeld COI's, anderen geëtiketteerd TCs, waardoor we COI's kwantificeren in de verschillende tv's. Het gebruik van softwaretools voor de geautomatiseerde kwanting van COI's heeft de verwerking van beelden sterk vereenvoudigd en versneld. Bovendien werd digitale analyse toegepast op hele weefselsecties in plaats van op geselecteerde gezichtsvelden, wat resulteerde in een onbevooroordeelde weergave van de TME. Bovendien, omdat de weefselcoördinaten van COI's werden geregistreerd, was het mogelijk om weefselheatmaps te genereren.

Er zijn verschillende gebieden in dit protocol waar het oplossen van problemen mogelijk nodig is. Ten eerste kan slecht antigeen ophalen de kwaliteit van mIF beïnvloeden, daarom moet het type antigeenterugwinningsbuffer en de duur worden geoptimaliseerd voor de specifieke test/biomarker-omstandigheden die worden gebruikt. Ten tweede moet het gebruikte type blokkeringsoplossing worden aangepast aan de weefsels/antigenen/soorten primaire en secundaire antilichamen. In onze handen, de toevoeging van 10% totaal serum van de soort waar het weefsel afkomstig is van geblokkeerde Fc receptoren, en dus verminderd niet-specifieke antilichaam binding. Toevoeging van 10% van het serum van de soort waarin de secundaire antilichamen werden gekweekt, zou de directe niet-specifieke hechting van secundaire antilichamen aan de weefselsectie minimaliseren. Ten derde is validatie van de specificiteit van de primaire en secundaire antilichamen met behulp van de juiste positieve en negatieve controles van essentieel belang. Ten vierde, verhoogde autofluorescentie in sommige kanalen en verspreiding van DAPI op primaire antilichaam strippen zijn ook gemeenschappelijk. Om de verbeterde autofluorescentie aan te pakken, gebruikten we primaire /secundaire antilichaamparen waarbij het specifieke signaal intensiteitswaarden had die ten minste 5x hoger waren dan de achtergrond. Ten slotte kunnen sommige hoge affiniteitsantilichamen niet worden geëlueerd met regelmatige stripprocedures. In dit geval raden we aan om dergelijke antilichamen te gebruiken in de laatste ronde van etikettering. De gebruiker kan hebben om verschillende kleuring sequenties proberen om de optimale configuratie voor de antilichamen van belang te vinden. De efficiëntie van het strippen moet worden bevestigd alvorens over te gaan tot een tweede of derde etiketteringsronde.

De belangrijkste beperking en uitdaging van deze strategie is het vinden van de juiste combinaties van primaire en secundaire fluorescerende antilichamen voor de markers van belang. Het vinden van primaire antilichamen die in verschillende soorten of met verschillende isotypes worden opgeheven die gelijktijdig zouden kunnen worden gebruikt, wordt beperkt door wat commercieel beschikbaar is. De meeste hele schuifscanners zijn uitgerust met lampen en filters die beeldvorming maximaal vijf kanalen mogelijk maken, en secundaire antilichamen in de juiste soorten en rechterfluorophore zijn niet altijd beschikbaar. We hebben deze beperkingen gedeeltelijk overwonnen met behulp van seriële kleuringen en sequentiële etikettering. Verschillende antilichaam combinaties kunnen nodig zijn om te worden getest om te komen tot de beste combinatie voor de markers van belang. Een andere beperking is de kwaliteit van de DAPI-kleuring, omdat strippen en terugdoening niet altijd het uitvoeren van kernensegmentatie mogelijk maken.

De weefsel align module vereist minimale training en geen programmeervaardigheden van gebruikers. De software maakt het theoretisch mogelijk om een onbeperkt aantal afbeeldingen uit te lijnen. Echter, precieze uitlijning is afhankelijk van de verwantschap van secties, waar nauwere secties die meer histologisch concordant zijn nauwkeuriger uitgelijnd. We gebruikten de author module van VIS voor het genereren van de APPs. Basiskennis van beeldanalyse is nodig voor het maken van APP's, maar dit is ook het geval bij het gebruik van een andere beeldanalysesoftware. De unieke voordelen van VIS in vergelijking met andere beeldanalysesoftware omvatten geautomatiseerde uitlijning van afbeeldingen van secties die zijn voorbereid met behulp van verschillende methoden (bijvoorbeeld IF, histochemie, IHC). Dit maakt colokalisatie studies van meerdere markers van belang met behulp van virtuele multiplexing. Bovendien maakt het flexibele en gebruiksvriendelijke ontwerp van APP's gebruikersspecifieke aanpassingen mogelijk. Geautomatiseerde kwantificering en mapping, en de mogelijkheid van het verwerken van hele weefselsecties, bespaart tijd en vermindert bias in vergelijking met handmatig tellen door visuele inspectie.

Deze strategie is een zeer nuttig onderzoeksinstrument voor weefselimmunologie in de context van kanker en auto-immuniteit, maar blijft ongevalideerd voor klinisch gebruik. Met extra standaardisatie en validatie kan het in de toekomst worden gebruikt voor meerdere toepassingen (bijvoorbeeld om het immuunlandschap bij kanker in kaart te brengen om de respons op immunotherapeutische middelen te voorspellen en te monitoren). Het kan ook worden aangepast aan verschillende ontstekingsaandoeningen (bijvoorbeeld inflammatoire darmziekte) om pathologische evaluatie te combineren met prognostische biomarkers.

De belangrijkste kritieke stappen in dit protocol zijn de efficiëntie/specificiteit van de etikettering en de robuustheid van de ontworpen APP's voor het beoogde gebruik of biomarker. Daarom is regelmatige validatie door visuele inspectie, vooral bij het ontwerpen van een nieuwe APP, essentieel. Het efficiënte gebruik van meerdere rondes van strippen en afweeren of verschillende soorten vlekken op dezelfde sectie zijn kritische componenten en kan weefsel of sectie specifiek zijn. Het is van cruciaal belang om de efficiëntie van dergelijke processen te verifiëren voordat u verdergaat met een analyse van grote batchprocessen.

Samengevat bieden we een strategie die de kwantitatieve en ruimtelijke informatie maximaliseert die kan worden verkregen uit waardevolle klinische weefselmonsters. De middelen, apparatuur en kennis die nodig zijn om deze methodologie te implementeren zijn breed toegankelijk. We stellen deze methodologie voor als een nuttige gids voor het plannen van tests gericht op het identificeren, kwantificeren en in kaart brengen van immuuncelpopulaties in de TME.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0)
Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS
Bovine serum albumin (BSA)	Multicell	800-095-EG
Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM)	Newcomersupply	5300KIT
Cover slides	Fisherbrand	12-545E 22*50
Direct Red 80	Sigma Aldrich	365548
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663
Ethanol 100%
Electric pressure cooker	Salton
Eosin	Leica Biosystems	3801600	CAUTION, eye irritation
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252	CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion
FFPE section (4μm) slides
Glycine 0,1 M in PBS
Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength	Ricca Chemical Company	3535-32
Holder (EasyDip Staining Jar Holder)	Newcomersupply	5300RK
Human Serum	Gemini	22210
Humidity chamber	Millipore Sigma	Z670138-1EA
Pap pen	abcam	ab2601
PBS
PBS-Tween 20 (0.1% v/v)
Permount Mounting Media	Fisher Chemical	SP15-500
Picric Acid 1.3 %	Sigma Aldrich	P6744	CAUTION, skin and eye irritation
Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution
Primary Antibody Anti-αSMA	Mouse IgG2a 1A4	Sigma A2547	Dilution 1/100
Primary Antibody Anti-CD34	Mouse IgG1 HPCA1/763	Novus Biologicals NBP2-44568	Dilution 1/250
Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18	Rabbit EP17/EP30	Agilent IR09461-2	Ready to use
Primary Antibody Anti-CD68	Mouse KP1	Abcam ab955	Dilution 1/200
Primary Antibody Anti-Desmin	Rabbit Polyclonal	Invitrogen PA5-16705	Dilution 1/200
Primary Antibody Anti-CD4	Mouse N1UG0	Affymetrix 14-2444	Dilution 1/250
Primary Antibody Anti-FoxP3	Rabbit 1054C	R & D MAB8214	Dilution 1/100
Primary Antibody Anti-MPO	Goat Polyclonal	R & D Systems AF3667	Dilution 1/250
Primary Antibody Anti-CD3	Rabbit SP7	Abcam ab16669	Dilution 1/200
Primary Antibody Anti-CD8	Mouse C8/144B	Invitrogen 14-0085-80	Dilution 1/200
Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488	Polyclonal	Invitrogen A-21202	Dilution 1/500
Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488	Polyclonal	Invitrogen A-21206	Dilution 1/500
Secondary Antibody Donkey anti-goat A568	Polyclonal	Invitrogen A-11057	Dilution 1/500
Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647	Polyclonal	Invitrogen A-31573	Dilution 1/500
Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647	RMG1-1	Biolegend 406618	Dilution 1/500
Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568	Polyclonal	Sigma Aldrich SAB4600315	Dilution 1/500
Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755	Polyclonal	Invitrogen SA5-10171	Dilution 1/500
Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755	Polyclonal	Invitrogen SA5-10043	Dilution 1/500
SDS	BioShop	SDS001,500	CAUTION, oral skin and eye toxicity
Shandon multi-program robotic slide stainer	LabX	11384903
Shandon Xylene Substitute,	Thermo Fisher Scientific	CA89413-336	CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled
Shaking water bath
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	S36938
Sodium Citrate Dihydrate	Millipore Sigma	1545801	CAUTION, eye irritation
Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration)
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-50ML
Tris-HCl	BioShop	77-86-1
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
VIS Software	Visiopharm
Whole slide scanner Olympus BX61VS	Olympus		Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine® Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)
Xylene	Sigma Aldrich	214736-4L	CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled
Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v)
2-mercaptoethanol	Sigma	M6250	CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood