Strategische screening en karakterisering van de Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex voor succesvolle kristallisatie

Samenvatting

Dit rapport beschrijft de screening van verschillende detergenten voor de voorbereiding van de visuele GPCR, rododenine, en het complex met mini-G_o. Biochemische methoden die de kwaliteit van het complex in verschillende stadia tijdens de zuivering karakteriseren, worden gedemonstreerd. Dit protocol kan worden gegeneraliseerd naar andere membraan eiwitcomplexen voor hun toekomstige structurele studies.

Samenvatting

De sleutel tot het bepalen van kristalstructuren van membraaneiwitcomplexen is de kwaliteit van het monster voorafgaand aan kristallisatie. In het bijzonder is de keuze van het wasmiddel van cruciaal belang, omdat het zowel de stabiliteit als de monodispersitie van het complex beïnvloedt. We hebben onlangs bepaald de kristalstructuur van een actieve toestand van boviene rododenine gekoppeld aan een ontworpen G-eiwit, mini-G_o, op 3.1 Å resolutie. Hier beschrijven we de procedure voor het optimaliseren van de voorbereiding van het rododen-mini-G_o complex. Dark-state rododenwerd bereid in klassieke en neopentylglycol (NPG) detergenten, gevolgd door complexe vorming met mini-G_o onder lichte blootstelling. De stabiliteit van de rododenwerd beoordeeld door ultraviolet zichtbare (UV-VIS) spectroscopie, die de reconstructie van ropsine van de lichtgevoelige ligand, 9-cis retinal monitort. Geautomatiseerde grootte-uitsluiting chromatografie (SEC) werd gebruikt om de monodispersie van rododenen en de rododen-mini-G_o complex karakteriseren. SDS-polyacrylamide elektroforese (SDS-PAGE) bevestigde de vorming van het complex door een 1:1 kiesverhouding tussen rododen en mini-G_o te identificeren na het bevlekken van de gel met Coomassie blauw. Na het kruisvalideren van al deze analytische gegevens, elimineerden we ongeschikte wasmiddelen en gingen we verder met de beste kandidaat-wasmiddel voor grootschalige voorbereiding en kristallisatie. Een bijkomend probleem deed zich voort uit de heterogeniteit van N-glycosylation. Heterologe uitgedrukte rododenine werd waargenomen op SDS-PAGE om twee verschillende N-glycosylated bevolking en die waarschijnlijk crystallogenese zouden hebben belemmerd. Daarom werden verschillende deglycosylation enzymen getest, en endoglycosidase F1 (EndoF1) geproduceerd rotopsin met een enkele soort N-glycosylation. Met deze strategische pijplijn voor het karakteriseren van eiwitkwaliteit werd de voorbereiding van het ropsine-mini-G_o complex geoptimaliseerd om de kristalstructuur te leveren. Dit was slechts de derde kristalstructuur van een GPCR-G eiwitsignaleringscomplex. Deze aanpak kan ook worden gegeneraliseerd voor andere membraaneiwitten en hun complexen om monstervoorbereiding en structuurbepaling te vergemakkelijken.

Inleiding

Het bepalen van kristalstructuren van membraaneiwitten en hun complexen is altijd een uitdaging geweest vanwege problemen bij het verkrijgen van goed diffracting kristallen. In tegenstelling tot oplosbare eiwitten bestaan integrale membraaneiwitten uit een hydrofobe kern die het celmembraan overspant. Om membraaneiwitten uit het celmembraan te verwijderen in waterige buffer, moeten detergenten worden gebruikt om een wasmiddel-eiwit micelle te vormen, waardoor de lipiden rond de hydrofobe kern van membraaneiwitten worden vervangen. Stabiliteit, activiteit en integriteit van membraaneiwitten zijn direct afhankelijk van de chemische en structurele eigenschappen van het wasmiddel¹, en de eigenschappen van het wasmiddel bepalen ook de grootte van de micelle. Een grote wasmiddel micelle kan occlude de hydrofiele oppervlakken van een klein membraan eiwit, waardoor kristallisatie te wijten aan het ontbreken van kristal contacten bij het gebruik van damp diffusie methode. Een kleine wasmiddel micelle is voordelig voor kristallografie, maar korte keten detergenten zijn meestal harder en dus leiden tot destabilisatie en aggregatie van het membraan eiwit. Daarom is vóór kristallisatie een extra wasmiddelscreeningsprocedure onmisbaar, meestal gericht op kortere detergentia die de eiwitstabiliteit nog steeds handhaven.

G eiwitgekoppelde receptoren (GPCRs) zijn integrale membraaneiwitten die zeven transmembraan a-helices bevatten. GPCRs bestaan in twee belangrijke staten, ofwel een inactieve toestand gestabiliseerd door omgekeerde agonisten of antagonisten, of een actieve staat gebonden aan een agonist en gestabiliseerd door een G-eiwit, hoewel het waarschijnlijk is dat een veelheid van substaten bestaan tussen deze twee uitersten. Structuur bepaling van GPCRs aanvankelijk gericht op inactieve staten gebonden aan inverse agonisten en antagonisten als gevolg van hun hogere stabiliteit dan actieve toestanden². Wanneer GPCRs worden geactiveerd op agonist binding, de receptoren zijn zeer dynamisch, en een gespleten vormen van voorbijgaande aard op het cytoplasmatische gezicht van de receptor voor G eiwitkoppeling. Er wordt gedacht dat deze dynamiek is de reden waarom agonist-gebonden GPCRs zijn vaak instabieler dan de inactieve toestand. Daarom wordt het essentieel om te screenen op detergentia die geschikt zijn voor de conformatietoestand van de onderzochte receptor, omdat het waarschijnlijk is dat mildere detergentia nodig zullen zijn voor het bestuderen van een actieve toestand in vergelijking met een inactieve toestand.

In dit rapport gebruiken we de visuele GPCR, runderrocoopine³en het complex met mini-G_o-eiwit ^4,5 voor de experimenten met wasmiddelscreening, die respectievelijk de inactieve toestand en de actieve toestand vertegenwoordigen. De wasmiddelscreening richtte zich op de klassieke alkyl maltoside en glucoside detergenten en de neopentylglycol (NPG) detergenten. In dit verband is een klassiek wasmiddel opgebouwd uit een suikerhoofdgroep en een alkylketen, terwijl de npg-typedetergenten twee identieke klassieke detergentia bevatten die worden gesmolten door een quaternaire koolstof op het raakvlak tussen de suikers en de alkylketens^6,7,8.

Een experimentele workflow werd ontworpen vanaf de zuivering van robeto in verschillende detergenten, gevolgd door de vorming van de rododen-mini-G_o complex en eindigend met de karakterisering van het complex met behulp van verschillende methoden (Figuur 1). Voor de inactieve toestand van rododenwerd de reconstructie van het lichtgevoelige ligand 9-cis retinal gecontroleerd door ultraviolet zichtbaar (UV-VIS) spectroscopie. Het spectrum onthult de fysischchemische toestand van het netvlies en is indicatief voor zijn omgeving in de netvliesbindende zak van rododen. De chromatografie van de grootte werd gebruikt om monodispersity van gezuiverde rododenine evenals vorming van rhodopsin-mini-G_o complex te beoordelen. Als SEC onderscheidt eiwitmoleculen door hun grootte en vorm, geaggregeerde eiwitpopulatie kan worden geïdentificeerd als ze uitsteken in de leegte volume. Om de complexe vorming te bevestigen, werden fracties van SEC beoordeeld door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) om de aanwezigheid van zowel rododenals mini-G_ote bevestigen.

Een andere factor die moet worden overwogen is post-translationele wijzigingen (PTM) op het membraan eiwitten. PTM zoals N-glycosylation worden vaak waargenomen op eukaryotische membraaneiwitten geproduceerd in zoogdier- en insectencelexpressiesystemen. Een beperkte N-glycosylation stam van de menselijke embryonale nier 293 (HEK293) cellen werd ontwikkeld door verwijdering van het gen codering N-acetylglucosaminyltransferase I (GnTI), wat resulteert in homogene N-glycosylation door GlcNAc₂Man₅ op de consensus site Asn-X-Ser / Thr. Hoewel N-glycosylation kan worden voorkomen door het muteren van een aminozuurresidu in de consensussite, kan dit ook de functie van het eiwit of de efficiëntie van het vouwen veranderen. Bij runderropsine leidt mutatie van het N-glycosylated residu Asn15 tot onjuiste vouwen en verminderde G-eiwitactivering^9,10. De rododenine gebruikt in dit rapport werd uitgedrukt in HEK 293 GnTI-tekort cellijn. SDS-PAGE toonde echter de aanwezigheid van twee soorten rododen. Deze heterogeniteit kon kristalvorming voorkomen en daarom werd deglycosylation met peptide-N-glycosidase F (PNGase F) en endoglycosidase F1 (Endo F1) getest. Het deglycosylated product werd gekenmerkt door SDS-PAGE en vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) om het niveau van glycosylation en de homogeniteit ervan te identificeren.

Protocol

OPMERKING: Dit protocol voor wasmiddelscreening is gedetailleerd voor 30 g HEK293 celpellet als uitgangsmateriaal.

1. Materialen, chemicaliën en reagentia

OPMERKING: Alle oplossingen worden bereid met behulp van analytische grade reagentia en ultrazuiver water, dat wordt gezuiverd uit gedeïoniseerd water om een weerstand van 18,2 MΩ·cm bij 25 °C te bereiken.

1. Buffervoorraadoplossingen
   1. Bereid 10x fosfaat gebufferde zoutoplossing (10x PBS).
   2. Bereid HEPES buffer: 1 M, getitreerd tot pH 7.5 met NaOH.
   3. Bereid 5 M NaCl voor.
   4. Bereid 2 M MgCl₂voor.
      OPMERKING: Alle voorraadoplossingen worden door gegeven via een 0,22 μm-filter om hun steriliteit te behouden.
2. Oplossingen voor wasmiddelenvoorraad
   1. Bereid dodecyl maltoside (DDM), 10% (w/v).
   2. Bereid decyl maltoside (DM), 10% (w/v).
   3. Bereid 6-cyclohexyl-hexyl maltoside (Cymal-6), 10% (w/v).
   4. Bereid 5-cyclohexyl-pentyl maltoside (Cymal-5), 10% (w/v).
   5. Bereid nonylglucoside (C9G), 10% (w/v).
   6. Bereid lauryl maltose neopentylglycol (LMNG), 5% (w/v).
   7. Bereid decyl maltose neopentylglycol (DMNG), 10% (w/v) voor.
   8. Bereid cymale-6 neopentylglycol (C6NG), 10% (w/v).
   9. Bereid cymale-5 neopentylglycol (C5NG), 10% (w/v).
   10. Bereid octylglucose neopentylglycol (OGNG), 10% (w/v).
       OPMERKING: Voor 10% wasmiddelvoorraadoplossing lost u 1 g wasmiddelpoeder op in ultrazuiver water met zacht schommelen en pas u het uiteindelijke volume aan op 10 mL. De oplossing voor de wasmiddelenvoorraad moet bij -20 °C worden gehouden voor langdurige opslag en op ijs tijdens het werken.
       LET OP: Gebottelde wasmiddelen worden meestal aanbevolen om op te slaan bij -20 °C vriezer. De flessen met wasmiddelpoeder moeten worden opgewarmd tot kamertemperatuur voordat ze worden geopend. Wasmiddelpoeder is hygroscopisch, dus temperatuurevenwicht voorkomt condensatievorming die het wasmiddel nat maakt.
3. Andere chemische stoffen en reagentia
   1. Bereid 1D4 immunoaffinity agarosehars: 10 mL van de 50% drijfmest.
      OPMERKING: De 1D4 immunoaffinity agarose zijn de agarose kralen gekoppeld aan de monoklonale Rho1D4 antilichaam, die de laatste 9 aminozuren van runderrotopje TETSQVAPA bindt als epitoop. De 1D4 immunoaffinity agarose werkt als affiniteitzuiveringsmateriaal om eiwitten vast te leggen die een C-terminale 1D4-sequentie bevatten. Dit zuiveringsmateriaal kan^wordenbereid^9,11 of gekocht.
   2. Bereid 9-cis retinale oplossing: 1 mM, opgelost in 100% ethanol.
      OPMERKING: Voorkom blootstelling aan licht aan het netvlies tijdens de voorbereiding en opslag.
   3. Bereid 1D4 peptide (sequentie TETSQVAPA): 800 μM, opgelost in water.
4. Buffers
   LET OP: Alle buffers worden gemengd van de voorraadoplossingen tot de gewenste concentratie. Alle buffers worden voor gebruik gekoeld tot 4 °C.
   1. Buffer A voorbereiden: PBS, 0,04% DDM.
   2. Bereid buffer B: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,04% DDM.
   3. Buffer C voorbereiden: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl en wasmiddel bij hun werkconcentratie vermeld in tabel 1.
   4. Bereid buffer D: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl.
   5. Bereid elutiebuffer voor: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 80 μM 1D4 peptide en wasmiddel bij hun werkconcentratie.
   6. Sec-buffer voorbereiden: 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,025% DDM; gefiltreerd door een 0,22 μm-filter.
5. Oplosmiddel voor LC-MS
   1. Bereid oplosmiddel A: acetonitril met 0,1% mierenzuur.
   2. Bereid oplosmiddel B: ultrazuiver water met 0,1% mierenzuur.
   3. Bereid oplosmiddel C: iso-propanol.

2. Celmembraanoplosbaarheid en eiwitextractie

1. Dooi 30 g HEK293 GnTI^- celpellet uitdrukken van de boviene rododensin mutant N2C/M257Y/D282C^3,9 tot kamertemperatuur, voeg 120 mL van 1x PBS buffer met proteaseremmer cocktail en homogeniseren met behulp van een Dounce homogenisator of een elektrische homogenisator (13.000 rpm voor 30 s). Verzamel de gehomogeniseerde celsuspensie in een beker en pas het volume aan op 150 mL.
   LET OP: 30 g celpellet is gelijk aan 3 L celkweek bij 2 x 10⁶ cel/mL dichtheid.
2. Voeg voorzichtig 10% DDM toe aan de gehomogeniseerde cellen om een eindconcentratie van 1,25% te geven. Roer op ijs voor 1 uur.
3. Centrifugeer het cellysaat bij 4 °C en 150.000 x g gedurende 45 min om het onsolubiliseerde puin te verwijderen.
4. Breng de supernatant over op een 500 mL fles en voeg 10 mL van de 1D4 immunoaffinity agarosehars (50% drijfmest) toe. Meng voorzichtig het verzinkte cellysaat en hars gedurende 4 uur of 's nachts bij 4 °C.
5. Laad het lysaat/harsmengsel in een open kolom om de hars te verzamelen.
6. Was de hars met 10 kolomvolumes (CV) van de wasbuffer A.
   OPMERKING: Het kolomvolume is het volume van de verpakte (100%) agarose hars gebruikt. In dit geval is 1 CV 5 mL.
7. Resuspend de hars met 2 CV van Buffer A.
   LET OP: Vanaf stap 2.8 worden stappen die onder schemerige roodlichtconditie moeten worden uitgevoerd, aan het begin van de beschrijving aangeduid met "[Donker]".
8. [Donker] Voeg 9-cis retinal toe aan de opnieuw opgelopen hars tot de uiteindelijke concentratie van 50 μM. Meng voorzichtig bij 4 °C voor 4-16 uur in het donker.
   OPMERKING: Een kortere incubatietijd kan leiden tot onvolledige reconstructie van het netvlies.
9. [Donker] Haal de stroom uit de kolom weg. Was hars met 20 CV Buffer A, gevolgd door 15 CV Buffer B.
10. [Donker] Zet de hars opnieuw op in 2 CV Buffer B en verdeel de harsvering gelijk in 10 10 mL verwijderingskolommen.
11. [Donker] Verwijder de stroom uit de kolom en zet de hars opnieuw op in 1 mL Buffer C. Incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C.
12. [Donker] Herhaal stap 2.11.
13. [Donker] Verwijder de stroom uit de kolom en breveer de hars opnieuw in een elutiebuffer van 0,8 m L voor elke kolom. Meng voorzichtig voor 2 uur.
14. [Donker] Verzamel elutie van de kolom in een buis van 2 mL.
15. [Donker] Resuspend de hars in 0,7 mL elution buffer voor elke kolom. Meng voorzichtig voor 1 uur.
16. [Donker] Verzamel elutie van de kolom in dezelfde buis.

3. UV-VIS spectroscopie

1. Bereid de spectrofotometer voor op het meetbereik van 250-650 nm. Neem de basislijn vast met water of elutiebuffer.
2. [Donker] Laad het geëuleerde eiwit op de kwartscuvette. Meet het spectrum van het eiwitmonster.
3. [Donker] Verlicht het eiwit direct in de cuvette gedurende 2 minuten met licht dat door een 495 nm lang-pasfilter gaat.
4. Meet het spectrum van het verlichte monster.
5. Voer dezelfde meting uit voor alle eiwitmonsters die in de andere 9 detergenten worden gezuiverd, zowel donkere als verlichte toestanden.
6. Plot de curven (absorptie versus golflengte) in x-Y spreidingsdiagram.

4. Geautomatiseerde grootte-uitsluiting chromatografie van rododenine en rododenine-mini-G_o complex

1. [Donker] Concentraat eiwit tot 100 μL door centrifugering met behulp van een spinconcentrator met een moleculaire gewichtscut-off (MWCO) van 30 kDa bij 4 °C. Overgeconcentreerde monsters kunnen worden verdund met behulp van de stroom door van de concentrator of buffer C. Om de concentratie van eiwitmonsters te bepalen, meet u de absorptie op 280 nm met behulp van een spectrofotometer.
   OPMERKING: Vanaf stap 4.2 vereist het experiment geen donkere omgeving en kunnen monsters daarom onder normaal licht worden bereid.
2. Bereid 100 μL rododenbij op 0,7 mg/mL voor elke wasmiddeltoestand.
3. Bereid voor elke wasmiddeltoestand 100 μL rotops (0,7 mg/mL) en mini-G_o^4,12 (0,2 mg/mL). Vul het mengsel aan met 1 mM MgCl₂. Verlicht het mengsel met licht van een 495 nm lang-pas filter en uitbroed en incuberen gedurende 30 min.
4. Monteer een 24 mL gel filtratie kolom met een fractionering strekken bereik van 10-600 kDa van een bolvormig eiwit op een vloeibare chromatografie zuiveraar. Equilibrated de kolom met SEC buffer.
   OPMERKING: De vloeibare chromatografiereiniger is uitgerust met een autosampler, een meervoudige golflengtedetector en een fractieverzamelaar.
5. Breng de monsters over naar de autosamplerflesjes en plaats ze in de monsterlade. Programmeer een methodebestand om sequentiële SEC-uitvoeringen voor elk monster te automatiseren, waarbij de autosampler 77 μL van het monster naar de kolom laadt en de zuiveraar die 24 mL SEC-buffer eluting eluting met een stroomsnelheid van 0,5 mL/min per run. Noteer de absorptie op 280 nm en 380 nm.
6. Verzamel de piekfracties van rododenen en rododenine-mini-G_o complex bij het retentievolume rond 12,9 mL.
7. Analyseer de linker rododenmonsters uit stap 4.2 en de piekfracties van rhodopsine-mini-G_o complex op 4-12% SDS-denaturering gradiëntgels met Coomassie blauwe vlekken.
8. Plot het elutiechromatogram (A₂₈₀ of A₃₈₀ versus retentievolume).

5. Deglycosylation en LC-MS studie

1. Voor LC-MS-studie, alleen gebruik maken van de roipin monster gezuiverd in LMNG wasmiddel.
2. Bereid een mengsel van rhodopsine van 200 μL bij 1 mg/mL en PNGase F¹³ bij 0,01 mg/mL. Meng goed en incubeer op 4 °C 's nachts.
3. Bereid een mengsel van rhodopsine van 200 μL bij 1 mg/mL en Endo F1¹³ bij 0,01 mg/mL. Meng goed en incubeer op 4 °C 's nachts.
4. Analyseer het spijsverteringsresultaat door SDS-PAGE en Coomassie blauwe vlekken.
5. Concentraat onbehandelde en endo F1-behandelde rododenschuren monsters en onderworpen aan SEC zuivering in Buffer D.
   OPMERKING: Dit is om het monster voor te bereiden met een minimale hoeveelheid wasmiddel voor LC-MS studie. Buffer D bevat geen wasmiddel, maar door de trage off-rate van LMNG van een membraaneiwit¹⁴zal robete niet samentrekken.
6. Verzamel de piekfractie bij retentievolume rond 12,9 mL. Concentraat tot 1 mg/mL met behulp van een spinconcentrator (MWCO 30 kDa).
7. Injecteer 10 μg van het eiwit in een kolom Reprosil 200 C18-AQ en los de kolom uit met behulp van de lineaire gradiëntmethode met de oplosmiddelsamenstelling en -instellingen in tabel 2. De stroom is verdeeld naar 25% voor massaspectrometer en 75% voor UV-detectie.

Resultaten

De experimentele workflow voor monstervoorbereiding en -analyse wordt samengevat in figuur 1. Door gebruik te maken van open kolommen voor kleinschalige affiniteitszuivering konden we monsters voorbereiden in veel verschillende wasmiddelenomstandigheden parallel(figuur 1A). Een dergelijke kleinschalige zuiveringsopzet leverde voldoende eiwit op voor verdere analyses met behulp van UV-VIS spectroscopie, SEC en SDS-PAGE (figuur 1B-C).

UV-VIS spectroscopie onthulde rhodopsine stabiliteit
De stabiliteit van de retinale gereconstrueerde rododenwerd beoordeeld aan de hand van de optische absorptie (figuur 2). In de donkere toestand, 9-cis netvlies is covalently gekoppeld aan Lys296 als een protonated Schiff basis. Na verlichting wordt het 9-cis retinale geïmeriseerd tot de all-trans isoform en wordt de Schiff-basisverbinding gedeprotonateerd. Het geprotoneerde 9-cis retinal geeft een absorptiepiek van 488 nm, terwijl het gedeprotoneerde all-trans retinal een piek heeft van 380 nm. De UV-VIS spectra van rododenine in DDM toonde de typische absorptie van 9-cis retinal-gebonden en licht geactiveerde rododenine, waar een blauwe verschuiving van 108 nm met ongeveer dezelfde optische dichtheid duidelijk werd waargenomen (Figuur 2A, linkerbovenpaneel). Wanneer rododenisgestabiliseerd, en vervolgens de bindende zak voor retinale veranderingen, wat resulteert in retinale deprotonatie en eventueel dissociatie. Als dit gebeurt, en dan toont het spectrum de bijdrage van deprotonatie evenals de vrije vorm van retinale¹⁵. Daarom hebben we de efficiëntie van retinale reconstitutie in rododen vastgesteld door de absorptieverhouding tussen het eiwit (280 nm) en het netvlies (488 nm voor protonated 9-cis retinal, 380 nm voor gedeprotoneerd all-trans retinal) (figuur 2B). Rhodopsine monsters gezuiverd in de klassieke detergenten (DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5, C9G) tonen hetzelfde optische profiel. De monsters die in de NPG-detergentia worden gezuiverd (LMNG, DMNG, Cymal-6NG, Cymal-5NG) vertonen echter optische profielen die wijzen op een suboptimale bindingsomgeving voor het netvlies, behalve voor het OGNG-monster, dat hetzelfde optische profiel gaf als het DDM-monster.

De chromatografie van de grootte-uitsluiting toonde steekproefzuiverheid en eiwitmonodispersity aan.
SEC is een efficiënt en robuust analytisch hulpmiddel voor het evalueren van eiwitmonsters tijdens de bereiding en screening. Het valideert de zuiverheid van de monsters van de vorige zuiveringsstap en de monodispersie van de eiwitmoleculen. Voor rhodopsine en het mini-G_o-complex werd de monsterkwaliteit geïnterpreteerd vanaf de absorptiecurven op 280 nm en 380 nm (figuur 3A). De 280 nm sporen toonden de aanwezigheid van eiwitten, en de 380 nm spoor toonde de aanwezigheid van netvlies. Alle signalen die in het leegtevolume (ongeveer 8 mL bij het gebruik van deze kolom) werden weergegeven, werden toegeschreven aan eiwitaggregaten. Uit de resultaten bleek derhalve dat de in de klassieke detergentia bereide monsters in een monodisperse-toestand waren, behalve C9G, waar een deel van het aggregaat verscheen. Monsters die met de detergentia van het NPG-type werden bereid, bevatten daarentegen veel meer aggregaten dan het C9G-monster; LMNG en Cymal-6NG leidden tot de meest geaggregeerde vorming, maar er werden minder aggregaten waargenomen in DMNG en Cymal-5NG. De uitzondering was OGNG, dat een vergelijkbaar profiel vertoonde als DDM. Eiwitaggregaten die bij het lege volume eluting hadden ook een slechtere retinale bezetting, zoals blijkt uit de A₂₈₀/A_{380-verhouding} die was gestegen in vergelijking met de piek bij het retentievolume van ~ 12,9 mL die overeenkomt met 135 kDa. Een ander kenmerk dat we waargenomen was dat zowel rododenen en rododenpsin-mini-G_o eluted rond hetzelfde retentievolume (Figuur 3B). Dit is niet verwonderlijk, want het schijnbare molecuulgewicht van wasmiddelgebonden rododenwassen was 120 kDa en dat van rododen-mini-G_o 144 kDa. We konden daarom geen complexe formatie vaststellen alleen op basis van de SEC-gegevens, dus SDS-PAGE werd gebruikt om de SEC-gezuiverde steekproef verder te analyseren.

SDS-PAGE bevestigde complexe vorming
SDS-PAGE is een standaardmethode om de eiwitcomponenten in een monster te identificeren. Geconcentreerde rododen (voorafgaand aan SEC zuivering) werden geanalyseerd door SDS-PAGE om de zuiverheid te bevestigen, en toonde twee banden in de buurt van 37 kDa en een besmeurde band boven de 50 kDa (Figuur 4A). De lagere twee banden werden later bevestigd om verschillende N-glycosylation staten te hebben. De band boven de 50 kDa werd geïnterpreteerd als geaggregeerde rododenoligomeren veroorzaakt door de SDS-PAGE monsterbuffer omdat deze aggregaten niet werden waargenomen in SEC of andere detectiemethoden. Aangezien SEC-gegevens complexe vorming niet konden bevestigen, werden de SEC-fracties van rododenpsine-mini-G_o-monsters geanalyseerd met behulp van SDS-PAGE. De SDS-PAGINA toonde eiwitbanden van zowel rododenals mini-G_o in alle wasmiddelomstandigheden, wat suggereert dat het complex werd gevormd, ongeacht de keuze van het wasmiddel (figuur 4B).

LC-MS spectrometrie identificeerde het N-glycosylation patroon in ropsine
Rhodopsine monsters van zowel affiniteit zuivering en SEC toonde twee eiwit banden die gemigreerd met een schijnbare moleculaire gewicht van ongeveer 37 kDa op een SDS-PAGE gel, die niet kon worden gescheiden door SEC bij het gebruik van een 24-mL kolom. Verschillende patronen van N-glycosylation op de heterologe uitgedrukte rododenvan HEK 293 GnTI^- cellen was de meest waarschijnlijke verklaring. Daarom werden twee enzymen, PNGase F en Endo F1, getest op hun vermogen om rododentes te deglycosylate. Uit de SDS-PAGE gegevens, Endo F1 verminderde het molecuulgewicht van beide eiwitbanden in een enkel product, terwijl PNGase F spijsvertering gaf nog steeds twee populaties (figuur 5A). De onverteerde en Endo F1-behandelde monsters werden geanalyseerd met behulp van LC-MS spectrometrie om de massa's van verschillende soorten te identificeren. Uit de gegevens bleek dat ropsine geproduceerd in HEK 293 GnTI^- cellen bevatten een of twee N-glycans, met een verschil in massa van 1014±1 Da. Endo F1-behandelde rododenpsin bevatte geen N-glycans en had een massaverschil van 2027±1 Da in vergelijking met rotoofpin met twee N-glycans. Deze resultaten komen overeen met de afwezigheid van het enzym N-acetylglucosaminyltransferase I in de cellijn die wordt gebruikt om rotopsin uit te drukken, wat resulteert in alle N-glycanen met de structuur GlcNAc₂Man₅, (massa 1014 Da).

Figuur 1: Monstervoorbereiding en karakterisering voor het onderzoek naar wasmiddelscreening. (A) Bereiding van rododenmonsters in verschillende detergentia tijdens de zuivering. (B) Methoden die in het protocol worden gebruikt: UV-VIS spectroscopie, size-exclusion chromatografie (SEC), SDS-PAGE en vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (LC-MS). (C) Experimentele workflow voor de karakterisering van rododen, rododen-mini-G_o, en deglycosylation product van rododenine. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: UV-VIS spectroscopie van rododen. (A) UV-VIS spectra van rododen. De spectra van de donkere toestand, 9-cis retinale-gebonden rododenine worden weergegeven in blauwe bochten. Na verlichting wordt het retinale van 9-cis gedeprotoneerd en isomeriseert het tot all-trans retinal, en de spectra van verlichte rododenine worden weergegeven als rode rondingen. De chemische structuur van elk wasmiddel wordt weergegeven als een begin. (B) De verhoudingen van A₂₈₀/A₄₈₈ (blauwe balk) en A₂₈₀/A₃₈₀ (rode balk) tonen de stabiliteit van rhodopsine in de donkere toestand en lichttoestand, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Grootte-uitsluiting chromatografie profielen van rododenen en rododenine–mini-G_o complex gezuiverd in 10 verschillende detergenten. (A) Het linkerpaneel toont de SEC profielen van monsters gezuiverd in de klassieke detergenten. Het rechterpaneel vertegenwoordigt de SEC-profielen van monsters die worden gezuiverd in de NPG-typewasmiddelen. Het profiel van de standaard marker eiwitten wordt weergegeven als overlay samen met het DDM monster. De interpretatie van de piekprofielen wordt getoond voor DMNG, met het ideale scenario (geen aggregaten) gezien voor DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 en OGNG. bB) Het vergrootprofiel van het OGNG-monster in het retentievolume van 12-14 mL. Alle monsters werden geanalyseerd met behulp van een Superdex200 Verhoging 10/300 GL kolom. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: SDS-PAGE analyse van rododenen en rododen/mini-Go complex. (A) Ropsine monsters gezuiverd in detergentia. De besmeurde band boven de 50 kDa wordt toegeschreven aan de geaggregeerde rododenoligomeren veroorzaakt door de SDS-PAGE monsterbuffer. (B) SEC-gezuiverde monsters van rododen/mini-Go complex. Rhodopsin met 1 en 2 N-glycan en mini-G_o zijn afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Identificatie van glycosylation bij rododen. (A) SDS-PAGE analyse van deglycosylated rododenmet PNGase F en Endo F1. (B) LC-MS spectra van rododenzonder (bovenste paneel) en met deglycosylation door Endo F1 (onderste paneel). Voor de voorbereiding van de ropsine-mini-G_o complex voor kristallisatie, kozen we Endo F1 boven PNGase F omdat Endo F1 geleverd een homogene soort rododensoorten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Wasmiddel	Werkconcentratie (%)	Kritische micelleconcentratie (%)
DDM DDM	0.025	0.0087
Dm	0.12	0.087
Cymal-6	0.05	0.028
Cymal-5	0.2	0.12
C9G C9G	0.5	0.2
LMNG	0.01	0.001
DMNG DMNG	0.01	0.0034
Cymal-6NG	0.015	Niet beschikbaar; moet lager zijn dan 0,056
Cymal-5NG	0.02	0.0056
OGNG (OGNG)	0.15	0.058

Tabel 1: Buffer C wasmiddelconcentraties.

Tijd (min)	Oplosmiddel A (%)	Oplosmiddel B (%)	Oplosmiddel C (%)	Stroomsnelheid (ml/min)
0	0	95	5	0.5
1	0	95	5	0.5
5	20	75	5	0.6
25	85	10	5	0.6
26	90	5	5	0.6
30	90	5	5	0.6

Tabel 2: Kolomelutieparameters.

Discussie

Het succes in eiwitkristallisatie is sterk afhankelijk van het eiwitmonster, met name membraaneiwitten en hun complexen als gevolg van de complicatie veroorzaakt door detergentia. Dit rapport toont wasmiddelscreening en evaluatie van de monsterkwaliteit voor GPCR-mini-G eiwitsignaleringscomplexen. Een verscheidenheid van methoden zijn op grote schaal gebruikt om de biochemische eigenschap van membraan eiwitten te bestuderen, bijvoorbeeld, thermostabiliteit test met behulp van tl-kleurstoffen^16,17, bindende test om complexe vorming te detecteren door het meten van de verandering in tryptofaanfluorescentie signaal¹⁸ of de resonantie energie overdracht met biosensoren¹⁹. Echter, de chemische omgevingen die in deze methoden zijn heel anders dan die voor de voorbereiding van een kristallisatie monster, ofwel eiwitten zijn op een duizend-voudige lagere concentratie voor fluorescentie-gebaseerde meting, of eiwitten zijn ingebed in lipide bilagen of in een vaste wasmiddel voorwaarde. In dit protocol worden de gebruikte methoden ook gestandaardiseerd in grootschalige monsterbereiding vóór kristallisatie. Daarom kunnen de geoptimaliseerde parameters eenvoudig worden overgedragen voor kristallisatie-schaal voorbereiding zonder verdere grote screening en optimalisatie.

Het doel van dit protocol is het optimaliseren van de voorbereiding van een stabiel en homogeen GPCR-mini-G eiwitcomplex voor dampdiffusiekristallisatie en structuurbepaling door röntgenkristallografie. Het protocol integreert een reeks methoden om de impact van wasmiddel en deglycosylation tijdens de voorbereiding van het rododen-mini-G_o-complex kwalitatief te evalueren. Rhodopsine in inactieve toestand en licht-geactiveerde toestand gebonden met en zonder de transducine peptide is gekristalliseerd wanneer gezuiverd in de detergentia octyl glucoside (C8G)^20,21,22 en C9G^23,24. Aangezien het rhodopsine-mini-G_o-complex gezuiverd in C8G en C9G geen kristallen opleverde (niet getoonde gegevens), hebben we vervolgens een breder scala aan andere detergentia onderzocht met behulp van de beschreven strategie (figuur 1). Door gebruik te maken van de lichtgevoeligheid van rododen, zouden we heel goed de reconstructie van het netvlies kunnen volgen op andere golflengten dan 280 nm. In zowel UV-VIS spectroscopie als SEC, ontdekten we retinale op ofwel 380 nm of 488 nm. De meeste membraaneiwitten hebben echter niet zo'n handig chromophore om de functionaliteit tijdens de zuivering te volgen. Andere opties zouden zijn om een ligand detecteerbaar te maken door het toevoegen van een licht-detecteerbare chromophore of door gebruik te maken van radioligand-binding en thermische verschuiving assays²⁵.

Rhodopsine heeft een moleculair gewicht van 40 kDa. Als gevolg van de massa van het wasmiddel bindt, zijn schijnbare moleculaire gewicht op SEC is ongeveer 120 kDa. Het is dan ook geen verrassing dat de binding van mini-G_o (24 kDa) niet gemakkelijk werd gedetecteerd op SEC, omdat dit differentiatie van eiwitten met schijnbare massa's van 120 kDa en 144 kDa noodzakelijk zou maken. Analyse van SEC-fracties door SDS-PAGE werd daarom gebruikt om de zuiverheid van de monsters en de complexe vorming te bevestigen. Zelfs als SEC-profielen een duidelijke verschuiving vertonen bij complexe vorming, wordt het nog steeds aanbevolen om SDS-PAGE-analyse uit te voeren om de complexe vorming met de juiste bindende partners te bevestigen in plaats van andere medegezuiverde eiwitverontreinigingen.

Zowel rododenine en mini-G_o werden gezuiverd in milligram hoeveelheden, die het gebruik van lage gevoeligheid detectie van de complexen, zoals UV-VIS absorptie tijdens SEC en Commassie Blauwe vlekken van SDS-PAGE gels toegestaan. Wanneer monsters beperkt zijn, moet meer gevoelige detectie worden gebruikt, zoals een LC-reiniger die is uitgerust met een fluorescentiedetector om tryptofaansignalen van het eiwit (280 nm excitatie, 350 nm emissie) en zilvervlekken voor SDS-PAGE gels te traceren. Een andere benadering zou zijn om een fluorescerend eiwit, zoals groene fluorescentie-eiwit (GFP) te versmelten tot het eiwit van belang, dat ook detectie mogelijk zou maken, zelfs tijdens eiwitexpressie^26, maar het moet worden verwijderd voordat kristallisatie.

Het is essentieel om ervoor te zorgen dat het gezuiverde eiwit ook vrij is van heterogeniteit als gevolg van variabele PTM's. In het hier beschreven geval werden de twee populaties van ropsine waargenomen op SDS-PAGE gels gekarakteriseerd als een of twee N-glycanen. Variabele modificatie van een eiwit zou de vorming van goed diffracting kristallen mogelijk voorkomen, dus hebben we daarom rhodopsinde. De endoglycosidase Endo F1 was het meest effect endoglycosidase getest en behandeling leidde tot een enkele soort van niet-gecosylated receptor, terwijl PNGase F slechts gedeeltelijk verwijderd van de glycanen op rotoropsin en resulteerde in een mengsel van rododenine volledig ongezellig of met een N-glycan bleef. Rhodopsine zonder deglycosylase behandeling is met succes gekristalliseerd^3,,27,28, en de N-glycan op rhodopsin Asn15 is belangrijk om kristal contact te vormen in die gevallen. In het geval van rododen-mini-G_o, is het noodzakelijk om N-glycans door Endo F1 te verwijderen om kristallen te verkrijgen. Er is geen gestandaardiseerde regel om eiwitten van belang te deglycosylate voor kristallisatie, maar verwijdering van heterogene PTM's moet worden overwogen wanneer eiwitten niet kristalliseren na uitgebreide kristallisatie proeven.

De gegevens en methodologie die hier beschreven leidde ons naar OGNG kiezen als de meest geprefereerde wasmiddel voor kristallisatie van de rododen-mini-G_o complex vanwege de kleine micelle grootte en de mogelijkheid om het complex te stabiliseren. We gebruikten Ook Endo F1 om ervoor te zorgen dat de gezuiverde rododenwasseren een homogene soort was. Kristallen werden vervolgens verkregen en we bepaalden de kristalstructuur tot ~ 3.1 Å⁴, dat was slechts de derde kristalstructuur van een GPCR-G eiwit signalering complex^14,29.

Voor membraaneiwitten gebonden met en zonder partnereiwit, moeten ze worden beschouwd als twee verschillende eiwitten. Een eiwit in verschillende functionele toestanden heeft verschillende conformaties en is op verschillende energieniveau. Daarom wordt aanbevolen om het voorbereidingsprotocol voor elke functionele status te optimaliseren, aangezien de parameter voor de inactieve toestand mogelijk niet volledig overdraagbaar is naar de geactiveerde status. Ook, niet te vergeten de verandering in de eiwiteigenschap gecompliceerd door het binden van een partner eiwit. Het protocol maakt gebruik van methoden die zijn gestandaardiseerd voor de voorbereiding van een kristallisatiemonster om inactief membraaneiwit in verschillende detergenten voor te bereiden, gevolgd door eiwitactivering en complexe vorming, en om de eiwitkwaliteit te karakteriseren. Zo kan dit protocol gemakkelijk worden gegeneraliseerd tot andere membraaneiwitten en hun complexen voor structurele studies met kleine modificatie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1D4 peptide	Peptide2.0	Op aanvraag
9-cis retinal	Sigma-Aldrich	R5754
Autosampler A-900	GE Healthcare		Niet langer leverbaar
C9G	Anatrace	N324
cOmplete, EDTA-vrije protease remmercocktail	Roche	5056489001
Cymal-5	Anatrace	C325
Cymal-5NG	Anatrace	NG325
Cymal-6	Anatrace	C326
Cymal-6NG	Anatrace	NG326
DDM	Anatrace	D310
DM	Anatrace	D322
DMNG	Anatrace	NG322
Econo column	Bio-Rad	7372512
Ettan LC	GE Healthcare		Niet langer leverbaar
FRAC-950	GE Healthcare		Niet langer leverbaar
HPLC Water 2795 Separation Module	Waters AG	720000358EN
InstantBlue Protein Stain	Expedeon	ISB1L
LCT Premier mass spectrometer (ESI-TOF)	Waters AG	-
LMNG	Anatrace	NG310
Monitor UV-900	GE Healthcare	18110835
Nanodrop 1000	Witec AG/ThermoFisher		Niet langer leverbaar
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm, 15 well	ThermoFisher	NP0323BOX
NuPAGE MES SDS buffer (20x)	ThermoFisher	NP0002
OGNG	Anatrace	NG311
PAGEr Minigel Chamber	Lonza	59905
Reprosil 200 C18-AQ column	Morvay Analytik GmbH	#s1503
Superdex 200 Increase GL column	GE Healthcare	28990944
Tabletop centrifuge 5424R	Eppendorf	5404000413
Ultracentrifuge Optima XE-100	Beckmann Coulter	A94516
ULTRA-TURRAX T25	IKA WERKE	0003725003
UV-VIS spectrofotometer	Shimadzu	UV-2401PC
Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector	Waters AG	-