Method Article

Karakteriseren single-molecule conformatieveranderingen onder schuifstroom met fluorescentiemicroscopie

DOI:

10.3791/60784

⸱

January 25th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een protocol voor het immobiliseren van enkele macromoleculen in microfluïde apparaten en het kwantificeren van veranderingen in hun conformaties onder schuifstroom. Dit protocol is nuttig voor het karakteriseren van de biomechanische en functionele eigenschappen van biomoleculen zoals eiwitten en DNA in een stroomomgeving.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Single-molecule gedrag onder mechanische verstoring is op grote schaal gekenmerkt om veel biologische processen te begrijpen. Methoden zoals atoomkrachtmicroscopie hebben echter een beperkte tijdelijke resolutie, terwijl Förster resonance energy transfer (FRET) alleen voegformaties kan voorkomen. Fluorescentie microscopie, aan de andere kant, maakt real-time in situ visualisatie van enkele moleculen in verschillende stroomomstandigheden. Ons protocol beschrijft de stappen om conformatieveranderingen van afzonderlijke biomoleculen onder verschillende schuifstromenomgevingen vast te leggen met behulp van fluorescentiemicroscopie. De schuifstroom wordt gemaakt in microfluïde kanalen en wordt aangestuurd door een spuitpomp. Als demonstraties van de methode, von Willebrand factor (VWF) en lambda DNA worden gelabeld met biotine en fluorophore en vervolgens geïmmobiliseerd op het kanaaloppervlak. Hun conformaties worden continu gecontroleerd onder variabele schuifstroom met behulp van totale interne reflectie (TIRF) en confocale fluorescentie microscopie. De omkeerbare ontrafelende dynamiek van VWF zijn nuttig om te begrijpen hoe de functie ervan is geregeld in menselijk bloed, terwijl de conformatie van lambda DNA inzichten biedt in de biofysica van macromoleculen. Het protocol kan ook op grote schaal worden toegepast om het gedrag van polymeren, met name biopolymeren, in verschillende stromingsomstandigheden te bestuderen en om de reologie van complexe vloeistoffen te onderzoeken.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mechanismen voor hoe biomoleculen reageren op omgevingsstimuli zijn op grote schaal bestudeerd. Vooral in een stromingsomgeving reguleren schuif- en verlengingskrachten de conformatieveranderingen en mogelijk de functie van biomoleculen. Typische voorbeelden zijn shear-geïnduceerde ontrafeling van lambda DNA en von Willebrand factor (VWF). Lambda DNA is gebruikt als een instrument om de conformatiedynamiek van individuele, flexibele polymeerketens en de reheologie van polymeeroplossingen1,2,3,4te begrijpen. VWF is een natuurlijke stroomsenso....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van VWF

  1. Reconstrueren menselijk plasma VWF om het voor te bereiden op de etikettering reacties. Voeg 100 μL gedeïoniseerd (DI) water toe aan 100 μg lyofieliseerde VWF om een VWF-voorraadoplossing van 1 mg/mL te creëren.
  2. Dialyze VWF stock oplossing om overtollige glycine te verwijderen, waardoor de biotine en fluorophore etikettering efficiëntie.
    1. Breng 50 μL VWF-voorraadoplossing over in een 0,1 mL dialyse-eenheid met een afsnijding van 10.000 moleculair gewicht en sluit af met een dop. Bewaar de resterende voorraadoplossing op -20 °C. VWF voorraad zal stabiel zijn voor maximaal 1 jaar op -20 °C.
    2. Voer dialyse uit ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het observeren van het dynamische gedrag van biomoleculen zoals VWF en lambda DNA is sterk afhankelijk van het optimaliseren van hun binding aan het apparaatoppervlak. Het uitbroeden van oppervlaktebehandelingen voor de aanbevolen tijden in het microfluïde apparaat is cruciaal voor het verkrijgen van binding met een paar verankeringspunten, zodat moleculen zich vrij kunnen uitbreiden en ontspannen bij het veranderen van stroom. Als de eiwitten of DNA te sterk gebonden zijn met meerdere koppelingen, zullen ze zich uitstre.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen van conformatieveranderingen met één molecuul met behulp van fluorescentiemicroscopie zoals beschreven in deze methode, is het van cruciaal belang om het molecuul voor de juiste hoeveelheid tijd uit te broeden, de niet-specifieke interacties met het oppervlak te minimaliseren en stel microscoopinstellingen vast die het bleken van foto's verminderen. Het vermogen van het molecuul om vrij te veranderen bevleesdheid is gerelateerd aan het aantal biotine-streptavidin interacties g.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een National Science Foundation subsidie DMS-1463234, National Institutes of Health subsidies HL082808 en AI133634, en Lehigh University interne financiering.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 Labeling KitInvitrogenA30006
Bio-Spin P-6 Gel ColumnsBio-Rad7326221
BiotinSigma-AldrichB4501Use as free biotin in Step 5.6
Biotin-14-dCTPAAT Bioquest17019
BSA-BiotinSigma-AldrichA8549
CoverslipsVWR48393-195No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP SetInvitrogen10297018
Float Buoys for Mini Dialysis DeviceThermo Scientific69588
Klenow Fragment (3'→5' exo-)New England BioLabsM0212SUse for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2
Lambda DNANew England BioLabsN3011S
Mini Dialysis DeviceThermo Scientific6957010K MWCO, 0.1 mL volume
NEBuffer 4New England BioLabsB7004S
NHS-PEG4-BiotinThermo Scientific21330
Protocatechuate 3,4-DioxygenaseSigma-AldrichP8279
Protocatechuic acidSanta Cruz Biotechnologysc-205818
Silicone Elastomer Kit for PDMS FabricationThe Dow Chemical Company4019862
StreptavidinSigma-Aldrich85878
The Blocking SolutionCANDOR Bioscience110 050Use as casein blocking solution throughout protocol
Vinyl Cleanroom TapeFisher Scientific19-120-3217
von Willebrand Factor, Human PlasmaMillipore Sigma681300
YOYO-1 DyeAAT Bioquest17580
0.25 mm Inner Diameter TubingCole-ParmerEW-06419-00
25 Gauge NeedleThomas ScientificJG2505X

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C.,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyShear FlowSingle MoleculeMicrofluidic ChannelsTotal Internal ReflectionConfocal MicroscopyVon Willebrand FactorLambda DNABiotin StreptavidinSyringe Pump

Related Articles