Methodenartikel

LarvaSPA, een methode voor het monteren van Drosophila Larve voor lange termijn Time-Lapse Imaging

DOI:

10.3791/60792

⸱

27 februari 2020

 , 
1Weill Institute for Cell and Molecular Biology and Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een methode voor het monteren van Drosophila larven om langer dan 10 uur ononderbroken time-lapse beeldvorming bij intacte levende dieren te bereiken. Deze methode kan worden gebruikt om veel biologische processen dicht bij de larve lichaam wand beeld.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Live imaging is een waardevolle aanpak voor het onderzoeken van celbiologie vragen. De Drosophila larve is bijzonder geschikt voor in vivo levende beeldvorming omdat de larve body wall en de meeste inwendige organen transparant zijn. Echter, continue live beeldvorming van intacte Drosophila larven voor langer dan 30 min is een uitdaging, omdat het moeilijk is om niet-invasief immobilisatieimmobilizing larven voor een lange tijd. Hier presenteren we een larve montagemethode genaamd LarvaSPA die het mogelijk maakt voor continue beeldvorming van levende Drosophila larven met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie voor langer dan 10 uur. Deze methode omvat het gedeeltelijk bevestigen van larven aan de coverslip met behulp van een UV-reactieve lijm en bovendien het beperken van larve beweging met behulp van een polydimethylsiloxane (PDMS) blok. Deze methode is compatibel met larven in ontwikkelingsstadia van tweede instar tot zwervende derde instar. We tonen toepassingen van deze methode bij het bestuderen van dynamische processen van Drosophila somatosensorische neuronen, waaronder dendrietgroei en door verwondingen veroorzaakte dendrite degeneratie. Deze methode kan ook worden toegepast om vele andere cellulaire processen die gebeuren in de buurt van de larve body wall te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Time-lapse live imaging is een krachtige methode voor het bestuderen van dynamische cellulaire processen. De ruimtelijke en tijdelijke informatie die door time-lapse films kan onthullen belangrijke details voor het beantwoorden van celbiologie vragen. De Drosophila larve is een populair in vivo model voor onderzoeken met behulp van live imaging, omdat de transparante carrosserie zorgt voor niet-invasieve beeldvorming van interne structuren1,2. Daarnaast zijn tal van genetische hulpmiddelen beschikbaar in Drosophila om fluorescerende label anatomische structuren en macromoleculen3. Echter, lange termijn time-lapse beeldvorming van Drosophila larven is een uitdaging. In tegenstelling tot stationaire vroege embryo's of poppen bewegen Drosophila-larven voortdurend, waardoor immobilisatie nodig is voor live beeldvorming. Effectieve manieren om levende Drosophila-larven te immobiliseren zijn het monteren in halocarbon olie met chloroform4,verdoven met behulp van isoflurane of Dichlorvos oplossing5, en comprimeren tussen de coverslip en de microscoopdia6. Hoewel sommige van deze methoden zijn gebruikt voor microscopie, geen van hen is effectief voor de lange termijn live imaging. Andere methoden werden ontwikkeld voor beeldvorming body wall neuronen in kruipende larven met behulp van conventionele confocale microscopie of licht-sheet microscopie7,8,9. Deze methoden zijn echter niet ideaal voor het monitoren van cellulaire dynamiek als gevolg van de beweging van de larven.

Er zijn nieuwe methoden ontwikkeld om langdurige time-lapse beeldvorming van Drosophila-larven te bereiken. Met behulp van een polydimethylsiloxane (PDMS) "larve chip" kunnen Drosophila larven effectief worden geïmmobiliseerd door vacuümgegenereerde zuigkracht in een gespecialiseerde microkamer zonder verdoving. Deze methode biedt echter geen hoge temporele resolutie voor celbiologiestudies en heeft strikte beperkingen op diergrootte10. Een andere methode met behulp van een verdovingsapparaat bereikte live beeldvorming van Drosophila larven op meerdere tijdpunten en is toegepast om neuromusculaire knooppunten11,12,13,14,15,16te bestuderen. Deze methode maakt echter ook geen continue beeldvorming langer dan 30 min mogelijk en vereist herhaaldelijk gebruik van desflurane, wat neurale activiteit kan remmen en het onderzochte biologische proces kan beïnvloeden17,18. Onlangs is een nieuwe methode die microfluïdeen en cryoanesthesie combineert gebruikt om larven van verschillende groottes te immobiliseren voor korte tijd (minuten)19. Deze methode vereist echter gespecialiseerde apparaten zoals een koelsysteem en langere perioden van immobilisatie vereisen herhaalde koeling van de larven.

Hier presenteren we een veelzijdige methode om Drosophila larven te immobiliseren die langer dan 10 uur compatibel is met ononderbroken time-lapse beeldvorming. Deze methode, die we "Larva Stabilization by Partial Attachment" (LarvaSPA) noemen, houdt in dat de larvecuticula wordt vastgemaakt aan een coverslip voor beeldvorming in een op maat gemaakte beeldkamer. Dit protocol beschrijft hoe de beeldkamer te maken en hoe larven te monteren in een verscheidenheid van ontwikkelingsstadia. In de LarvaSPA-methode worden de gewenste lichaamssegmenten met behulp van een UV-reactieve lijm op de coverslip aangebracht. Een PDMS-cuboïde oefent bovendien druk uit op de larven, waardoor ontsnapping wordt voorkomen. De lucht en het vocht in de beeldkamer zorgen voor het overleven van de gedeeltelijk geïmmobiliseerde larven tijdens beeldvorming. Voordelen van LarvaSPA ten opzichte van andere technieken zijn het volgende: (1) Het is de eerste methode die het mogelijk maakt voor continue live beeldvorming van intacte Drosophila larven voor uren met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie; (2) De methode kent minder beperkingen op de grootte van de larve; (3) De beeldkamer en PDMS-cuboïden kunnen tegen minimale kosten worden vervaardigd en herbruikbaar zijn.

Naast het beschrijven van de larve montage methode, bieden we verschillende voorbeelden van de toepassing ervan voor het bestuderen van dendriet ontwikkeling en dendriet degeneratie van Drosophila dendritic arborization (da) neuronen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het maken van de beeldkamer

  1. Het metalen frame kan worden opgebouwd uit een aluminium blok in een typische machinewinkel. De specificaties van het frame zijn geïllustreerd in figuur 1A.
  2. Voor de constructie van de beeldkamer sluit u de onderkant van het metalen frame af met een lange afdekslip (22 mm x 50 mm) en UV-lijm(figuur 1A). Genees de UV-lijm met een hand-held UV-lamp.

2. PdMS-cuboïden maken

  1. Bereid de mal voor op PDMS-cuboïden.
    1. Bevestig lagen verpakkingstape aan het binnenoppervlak van een rechthoekige (80 mm x 55 mm) petrischaal of ronde celkweekplaat. Gebruik één laag (0,063 mm dik) voor tweede instar larven, 2 lagen (0,126 mm dik) voor vroege derde instar larven, of drie lagen (0,189 mm dik) voor late derde instar larven (Figuur 1B).
    2. Snijd de tape in stroken van specifieke breedte met een scheermesje: 1,5 mm voor de 1-laags tape en 2 mm voor 2-laags of 3-laags tape. De breedte en dikte van de strip bepalen de grootte van de larven die de uiteindelijke PDMS-cuboïde kan bevatten. Laat ten minste een 5 mm ruimte tussen de twee stroken. Verwijder de tapelagen die de ruimte bedekken (figuur 1B).
    3. Verwijder stof van het binnenoppervlak van de plaat met plakband. De mal is klaar voor gebruik.
  2. Bereid de PDMS-mix voor.
    1. Meng 7 g PDMS-basis en 0,7 g uithardingsmiddel (10:1 verhouding) grondig in een kleine container.
    2. Plaats de container minstens 15 min in een vacuümdesiccator om lucht uit het mengsel te verwijderen.
    3. Giet langzaam ongeveer 5,5 g PDMS-mengsel op de mal om een dikte van 1-2 mm(figuur 1B)te bereiken.
    4. Plaats het PDMS-mengsel gedurende ten minste 15 minuten opnieuw in de vacuümdesiccator om de resterende luchtbellen uit het mengsel te verwijderen. Breek de laatste paar bubbels met een pipet tip.
    5. Verhard de PDMS op een vlak oppervlak in een warmteincubator bij 65 °C gedurende 2 uur.
    6. Gebruik een scheermesje om de genezen PDMS los langs de rand van de mal en los te maken van de mal. Bewaar de PDMS tussen twee stukken grote plakband bij kamertemperatuur.
    7. Snijd de PDMS voor vroege en late derde insterlarven in 8 mm x 2 x 1 mm cuboïden (langs de stippellijnen in figuur 1B)door de groef van de tapestrip (stap 2.1.2) in het midden van de lange zijde van de cuboïde(figuur 1B,C) teplaatsen. Snijd voor tweede instar larven de cuboïde tot 8 mm x 1 mm x 1 mm.

3. Het monteren van larven voor langdurige time-lapse beeldvorming

  1. Bereid de bovenste coverslip voor op montage.
    1. Kies zes PDMS-cuboïden met groeven die overeenkomen met de grootte van de larven. Volg de aanbevolen groef en grootte van PDMS op basis van de stappen 2.1.1, 2.1.2 en 2.2.7.
    2. Verwijder stof van het oppervlak van de PDMS met plakband.
    3. Bevestig vier stukken dubbelzijdige tape (12 mm x 5 mm) op een lange coverslip (22 mm x 50 mm) voor het later bevestigen van PDMS-kuboïden. De ruimten tussen de twee stukken dubbelzijdige tape moeten dezelfde zijn als de breedte van de PDMS-groef.
    4. Breng een kleine druppel (~ 1,2 μL) UV-lijm aan in de groef van elke PDMS-cuboïde en voeg zes kleine druppels UV-lijm toe in de ruimte tussen de dubbelzijdige tape op de coverslip.
  2. Bereid de larven voor op de montage.
    1. Met behulp van een paar tangen, reinig de larven in water om voedsel te verwijderen uit het lichaamsoppervlak.
    2. Plaats schone larven op een klein stukje bevochtigd tissuepapier in een kleine (35 mm) petrischaal zonder deksel. Plaats de kleine petrischaal in een grote (60 mm) petrischaal met een stuk droog tissuepapier. Breng in een chemische kap 8-12 druppels (160-240 μL) isoflurane aan op het droge weefselpapier met behulp van een plastic overbrengende pipet en sluit het deksel van de grote petrischaal.
    3. Wacht 2-3 min tijdens het bewaken van de larven. Haal de larven uit de grote petrischaal zodra hun mondhaken stoppen met bewegen.
  3. Zet de dieren op.
    1. Om beeldstructuren aan de rugzijde van het dier te plaatsen, plaatst u de geïmmobiliseerde larven op de UV-lijm tussen de dubbelzijdige tape op de coverslip met de rugnageldie naar de coverslip gericht is.
    2. Bedek elke larve met een PDMS-blok en plaats de romp van de larve in de groef van de PDMS. Laat het hoofd en de staart van de larve buiten de PDMS-groef. Vermijd het blokkeren van de spiracles van de larve door de lijm.
    3. Druk op de uiteinden van het PDMS-blok op de dubbelzijdige tape zonder kracht op de groef toe te passen. Trek voorzichtig aan de staart van de larve om de nagelriem onder de PDMS plat te maken.
    4. Cure de UV-lijm gedurende 4 min met behulp van een hand-held UV-lamp op de hoge instelling (op ongeveer 0,07 mW/mm2).
      LET OP: Bescherm de ogen met een veiligheidsbril tijdens het gebruik van de UV-lamp.
    5. Draai de coverslip ondersteboven en herhaal stap 3.3.4.
    6. Bevochtig een klein stukje lenspapier (15 mm x 30 mm) met 20 μL–30 μL water. Plaats het bevochtigde lenspapier onder aan de beeldkamer(figuur 1A,D).
    7. Plaats de coverslip op de kamer, zodat de larven zijn geconfronteerd met de binnenkant van de kamer. Sluit beide uiteinden van de coverslip aan het metalen oppervlak met behulp van UV-lijm(figuur 1A,D). De dorsale kant van de larven is klaar voor beeldvorming onder confocale microscoop(figuur 1E).

4. Beeldvorming

  1. Beeldlarven met een aangewezen microscoop. Alle resultaten in dit protocol (Figuur 2, Figuur 3, Video S2, Video S3en Video S4) werden verkregen met behulp van een confocale systeem met een 40x (1.30 NA) oliedoelstelling.

5. Herstel van de beeldkamer en PDMS-cuboïden

  1. Verwijder na beeldvorming de olie op de bovenste coverslip met behulp van een lenspapier. Maak de bovenste coverslip los van het metalen frame door met een scheermesje in de ruimte tussen de coverslip en het metalen frame te snijden. De beeldkamer is klaar voor hergebruik.
  2. Maak de PDMS-cuboïden met tangen los van de bovenste coverslip. Rol de PDMS-cuboïden op plakband om lijmresten en stof te verwijderen. De PDMS-cuboïden zijn klaar voor hergebruik.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De larve imaging kamer is opgebouwd door het lijmen van een op maat gemaakt metalen frame en twee coverslips aan elkaar. Het ontwerp van het metalen frame is gespecificeerd in figuur 1A. Drosophila larven in de kamer worden aan de bovenste coverslip met behulp van UV-lijm en PDMS-cuboïden gehecht. De groef op de PDMS-cuboïde en de dubbelzijdige tape de cuboïde is bevestigd om de ruimte te creëren om de larven vast te houden (Figuur 1B,C). De PDM...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we LarvaSPA, een veelzijdige methode om levende Drosophila larven te monteren voor langdurige time-lapse beeldvorming. Deze methode vereist geen herstellende of opnieuw monterende larven, waardoor ononderbroken beeldvorming mogelijk is. Het is daarom ideaal voor het bijhouden van biologische processen die uren in beslag nemen, zoals dedenrite degeneratie en regeneratie. Deze methode kan ook worden gebruikt voor beeldvorming intracellulaire calciumdynamica en subcellulaire gebeurtenissen zoals mi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Lingfeng Tang voor het opzetten van een eerdere versie van de LarvaSPA methode; Glenn Swan bij Cornell Olin Hall Machine shop voor het maken van eerdere prototypes van de imaging kamer; Philipp Isermann voor het bouwen van metalen frames en het geven van suggesties over het maken van PDMS-cuboïden; Cornell BRC Imaging faciliteit voor toegang tot microscopen (gefinancierd door NIH subsidie S10OD018516); Maria Sapar voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Cornell Fellowship toegekend aan H.J.; een Cornell start-up fonds en NIH subsidies (R01NS099125 en R21OD023824) toegekend aan C.H. H.J. en C.H. bedacht het project en ontwierp de experimenten. H.J. voerde de experimenten uit. H.J. en C.H. schreven het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
6061 Aluminium stavenMcMaster-Carr9246K421
3M dubbelzijdig plakbandTed Pella, Inc.16093
3M Scotch verpakkingstape3M1.88"B x 22.2 Yards
DUMONT #3 PincetFisher Scientific50-241-34
Glazen dekselAzer Scientific1152250
IsofluraanMidwest Veterinary Supply193.33161.3
Leica Confocal MicroscoopLeicaSP8 uitgerust met een resonante scanner
LenspapierBerkshireLN90.0406.24
Petrischalen (middelgroot)VWR25373-085
Petrischalen (klein)VWR10799-192
VeiligheidsmesjeTed Pella, Inc.121-20
Rechthoekige petrischaalVWR25384-322
SYLGARD 184 kit (PBMS kit)Electron Microscopy Sciences24236-10
OverdrachtpipetThermo Fisher Scientific1371126
UV-lijmNorland products#6106, NOA 61Breekindex 1.56
UV-lamp (Workstar 2003)MaxxeonMXN02003
Vacuum-drogerElectron Microscopy Sciences71232
DoekjesKimberly-ClarkKimwipes

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
  2. Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
  3. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
  4. Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
  5. Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191(2014).
  6. Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
  7. He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
  8. Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
  9. Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
  10. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998(2014).
  11. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
  12. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
  13. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
  14. Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
  15. Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249(2010).
  16. Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
  17. Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, Pt 2 489-502 (2004).
  18. Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
  19. Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
  20. Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
  21. Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
  22. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
  23. Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
  24. Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
  25. Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
  26. Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
  27. Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
  28. Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
  29. Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
  30. Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872(2018).
  31. Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Live imagingLarvaSPA methodePDMS kubussenmontage met UV lijmconfocale microscopiedendrietdynamiekneuronale imagingimmobilisatie van larven

Gerelateerde artikelen