In dit protocol presenteren we een experimenteel ontwerp met behulp van een voorwaardelijk knockdown-systeem en een aangepaste bolvormingstest om het effect van clusterin op de stamheid van door de patiënt afgeleide GCSCs te bestuderen. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast om zowel in vitro als in vivo functie van stamheid-geassocieerde genen in verschillende soorten CSCs te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gecombineerde voorwaardelijke knockdown en aangepaste sphere vorming test om een stemness-geassocieerd gen van patiënt-afgeleide maagkanker stamcellen studie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Kanker stamcellen (CSCs) zijn betrokken bij tumor initiatie, ontwikkeling en herhaling na de behandeling, en zijn uitgegroeid tot het centrum van de aandacht van vele studies in de afgelopen decennia. Daarom is het belangrijk om methoden te ontwikkelen om de rol van belangrijke genen die betrokken zijn bij kankercelstamness te onderzoeken. Maagkanker (GC) is een van de meest voorkomende en sterfelijke vormen van kanker. Maagkanker stamcellen (GCSCs) worden beschouwd als de wortel van maagkanker terugval, metastase en resistentie tegen geneesmiddelen. Inzicht in GCS biologie is nodig om de ontwikkeling van gerichte therapieën te bevorderen en uiteindelijk om de mortaliteit bij patiënten te verminderen. In dit protocol presenteren we een experimenteel ontwerp met behulp van een voorwaardelijk knockdown-systeem en een aangepaste bolvormingstest om het effect van clusterin op de stamheid van door de patiënt afgeleide GCSCs te bestuderen. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast om zowel in vitro als in vivo functie van stamheid-geassocieerde genen in verschillende soorten CSCs te bestuderen.
Inleiding
Maagkanker (GC) is een van de meest voorkomende en sterfelijke vormen van kanker1. Ondanks de vooruitgang in gecombineerde chirurgie, chemotherapie en radiotherapie in GC-therapie, blijft de prognose slecht en is de overlevingskans van vijf jaar nog steeds zeer laag2. Recidief en metastase zijn de belangrijkste redenen oorzaak van de sterfgevallen na de behandeling.
Kanker stamcellen (CSCs) zijn een subset van kankercellen die de mogelijkheid om zelf te vernieuwen en het genereren van de verschillende cellijnen die de tumor reconstrueren3bezitten. CsCs worden veronderst....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten met patiënt-afgeleide maagkanker stamcellen hierin beschreven werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie7.
1. Maagkanker stamcelcultuur
- Voorbereiding van GCS's complete cultuurmedium
- Bereid het volledige kweekmedium van GCSCs voor door verse DME/F12-medium toe te voegen met de volgende essentiële ingrediënten: 20 ng/mL EFG, 10 ng/mL bFGF, 1% Insuline/Transferrin/Natriumseleniet, 0,2% glucose, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% Niet-essentieel aminozuur, 10 μM 2-mercaptoethanol, 0,75 mg/mL NaHCO3, 10 μM thioglycerol, 100 IU/mL penicilline en 100 μg/mL strep. Filter en ster....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Maagkanker stamcellen van primaire menselijke maag adenocarcinoom werden gekweekt in serum-vrije cultuur medium. Na 6 dagen breidden cellen zich uit van het eencellige fenotype(figuur 1A) tot grote bollen (figuur 1B).
Om de functie van clusterin in GCSCs te beoordelen, werden shRNA-sequenties tegen clusterin en scrambled gekloond in tet.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
GC is wereldwijd de derde belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen. GCSCs zijn van cruciaal belang bij terugval van maagkanker, metastase en resistentie tegen geneesmiddelen. Met behulp van GCSCs van maagkanker patiënten zal ons toelaten om hun zwakke plek te verkennen en de targeting drugs te ontwikkelen voor de behandeling van GC patiënten.
De bolvorming test is een nuttige methode om kanker stamcel zelfvernieuwing potentieel in vitro te onderzoeken. Resultaten kunnen worde.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Nature Science Foundation van de provincie Guangdong (2018A030310586, 2020A1515010989), de Medical Scientific Research Foundation van de provincie Guangdong (A2019405), de National Natural Science Foundation of China (81772957), de Technologieprogramma van de provincie Guangdong in China (2017B030301016) en de Industry and Information Technology Foundation van Shenzhen (20180309100135860).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
Referenties
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
