Gecombineerde voorwaardelijke knockdown en aangepaste sphere vorming test om een stemness-geassocieerd gen van patiënt-afgeleide maagkanker stamcellen studie

Samenvatting

In dit protocol presenteren we een experimenteel ontwerp met behulp van een voorwaardelijk knockdown-systeem en een aangepaste bolvormingstest om het effect van clusterin op de stamheid van door de patiënt afgeleide GCSCs te bestuderen. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast om zowel in vitro als in vivo functie van stamheid-geassocieerde genen in verschillende soorten CSCs te bestuderen.

Samenvatting

Kanker stamcellen (CSCs) zijn betrokken bij tumor initiatie, ontwikkeling en herhaling na de behandeling, en zijn uitgegroeid tot het centrum van de aandacht van vele studies in de afgelopen decennia. Daarom is het belangrijk om methoden te ontwikkelen om de rol van belangrijke genen die betrokken zijn bij kankercelstamness te onderzoeken. Maagkanker (GC) is een van de meest voorkomende en sterfelijke vormen van kanker. Maagkanker stamcellen (GCSCs) worden beschouwd als de wortel van maagkanker terugval, metastase en resistentie tegen geneesmiddelen. Inzicht in GCS biologie is nodig om de ontwikkeling van gerichte therapieën te bevorderen en uiteindelijk om de mortaliteit bij patiënten te verminderen. In dit protocol presenteren we een experimenteel ontwerp met behulp van een voorwaardelijk knockdown-systeem en een aangepaste bolvormingstest om het effect van clusterin op de stamheid van door de patiënt afgeleide GCSCs te bestuderen. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast om zowel in vitro als in vivo functie van stamheid-geassocieerde genen in verschillende soorten CSCs te bestuderen.

Inleiding

Maagkanker (GC) is een van de meest voorkomende en sterfelijke vormen van kanker¹. Ondanks de vooruitgang in gecombineerde chirurgie, chemotherapie en radiotherapie in GC-therapie, blijft de prognose slecht en is de overlevingskans van vijf jaar nog steeds zeer laag². Recidief en metastase zijn de belangrijkste redenen oorzaak van de sterfgevallen na de behandeling.

Kanker stamcellen (CSCs) zijn een subset van kankercellen die de mogelijkheid om zelf te vernieuwen en het genereren van de verschillende cellijnen die de tumor reconstrueren³bezitten. CsCs worden verondersteld verantwoordelijk te zijn voor kanker terugval en metastase vanwege hun mogelijkheden van zelfvernieuwing en zaaien van nieuwe tumoren, evenals hun weerstand tegen traditionele chemo- en radiotherapieën⁴. Daarom bieden het richten van CCS en eliminatie van CSC's een spannend potentieel om de behandeling te verbeteren en de mortaliteit van kankerpatiënten te verminderen.

CsCs zijn geïsoleerd van vele soorten vaste tumoren⁵. In 2009 werden maagkankerstamcellen (GCSCs) geïsoleerd van menselijke maagkankercellijnen oorspronkelijk beschreven door Takaishi et al.⁶. Chen en collega's identificeerden en gezuiverd ANGCS's uit menselijke maag-adenocarcinoom (GAC) tumorweefsels⁷. Deze bevindingen bieden niet alleen de mogelijkheid om de biologie van CSCs te bestuderen, maar bieden ook een groot klinisch belang.

Een bijzonder kenmerk van csc's is hun vermogen om een bol⁸te vormen . Enkele cellen zijn verguld in niet-loodbare omstandigheden bij een lage dichtheid, en alleen de cellen bezeten met zelfvernieuwing kan uitgroeien tot een solide, bolvormige cluster genaamd een bol. Zo is de bolvorming test is beschouwd als de gouden standaard test en op grote schaal gebruikt om stamcel zelfvernieuwing potentieel in vitro te evalueren.

RNA interferentie (RNAi) is een krachtig onderzoeksinstrument om de genfunctie te bestuderen door de knockdown van een specifiek gen⁹. Echter, lange termijn stabiele gen knockdown technologieën hebben bepaalde beperkingen, zoals de uitdaging van het verkennen van de functie van een gen dat essentieel is voor de overleving van cellen. Voorwaardelijke RNAi-systemen kunnen nuttig zijn voor de downregulatie van gewenste genen op een temporele en/of speciale gecontroleerde manier door de toediening van een inducerende agent. De tetracycline (Tet)-inducible systemen zijn een van de meest gebruikte voorwaardelijke RNAi systemen¹⁰. De Tet-inducible systemen kunnen leiden tot doelgenuitschakeling door het beheersen van de expressie van shRNA op toevoeging van een exogene aansporing (bij voorkeur doxycycline, Dox). De Tet-inducible systemen kunnen worden onderverdeeld in twee soorten: Tet-On of Tet-Off systemen. De expressie van shRNA kan worden ingeschakeld (Tet-On) of uitgeschakeld (Tet-Off) in aanwezigheid van de inducer. In het Tet-ON-systeem zonder aansporing, bindt de constitutief uitgedrukte Tet-onderdrukker (TetR) zich aan de Tet-responsieve element (TRE) sequentie met een Tet-responsieve Pol III-afhankelijke promotor voor shRNA-expressie, waardoor de expressie van de shRNA wordt onderdrukt. Terwijl op toevoeging van Dox, is de TetR afgezonderd uit de buurt van de Tet-responsieve Pol III-afhankelijke promotor. Dit vergemakkelijkt de expressie van de shRNA en leidt tot gen knockdown.

Het hier beschreven protocol maakt gebruik van een functioneel tetracycline-induceerbaar shRNA-systeem en een aangepaste bolvormingstest om de functie van clusterin in door patiënten afgeleide GCSCs¹¹te bestuderen. We gebruiken het beschreven protocol om de effecten van clusterin in CSCs zelfvernieuwing te bestuderen. Deze methode is ook van toepassing op andere soorten kankercellen.

Protocol

Alle experimenten met patiënt-afgeleide maagkanker stamcellen hierin beschreven werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie⁷.

1. Maagkanker stamcelcultuur

1. Voorbereiding van GCS's complete cultuurmedium
   1. Bereid het volledige kweekmedium van GCSCs voor door verse DME/F12-medium toe te voegen met de volgende essentiële ingrediënten: 20 ng/mL EFG, 10 ng/mL bFGF, 1% Insuline/Transferrin/Natriumseleniet, 0,2% glucose, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% Niet-essentieel aminozuur, 10 μM 2-mercaptoethanol, 0,75 mg/mL NaHCO₃, 10 μM thioglycerol, 100 IU/mL penicilline en 100 μg/mL strep. Filter en steriliseer met een filter van 0,22 μm.
      LET OP: GCS complete cultuur medium wordt aanbevolen opgeslagen bij voorkeur niet meer dan twee weken bij 4 °C.
2. Herstel van GCSCs en cultuur
   OPMERKING: GCSCs werden verkregen als volgt: Tumormonsters werden onderworpen aan mechanische en enzymatische dissociatie. Eencellige suspensies werden verkregen door te filteren met nylon net van goed verspreide suspensie. De resulterende kankercellen werden gekweekt in GCSCs Complete Culture Medium, en sommige cellen groeiden uit tot sferen. Deze bollen werden vervolgens onderworpen aan enzymatische dissociatie, en GCSCs kan worden verkregen door cytofluorometrische sortering van de celpopulatie bevlekt met CD44/CD54 markers. De gedetailleerde protocol en functionele testen van de GCSCs zijn gemeld⁷.
   1. Pre-warme GCSCs completen cultuurmedium op 37 °C voor niet meer dan 30 minuten.
   2. Ontdooi GCSCs uit vloeibare stikstofopslag en ontdooien cryovials snel in een waterbad van 37 °C. Blijf de flesjes wervelen tot de hele inhoud volledig smelt.
      OPMERKING: Ontdooi bevroren cellen snel (<1 min) in een waterbad van 37 °C.
   3. Breng de volledige inhoud van de cryovials over in een 15 mL centrifugebuis met 10 mL GCS complete kweekmedium. Centrifuge op 800 x g gedurende 5 minuten op RT.
   4. Aspirate de supernatant zorgvuldig en schort de cel pellet in 10 mL van verse GCS's compleet medium. Plaats de celsuspensie in een petrischaaltje van 100 mm. Kweek de plaat bij 37 °C in een 5% CO₂ incubator en voeg op de derde dag 5 mL vers compleet medium toe.
3. Subcultuur van GCSCs tumorsferen
   OPMERKING: GCSCs van de tumorsferen centrum hebben alleen voldoende voedingsstoffen voordat de bollen grootte groeit tot 80-100 μm in diameter. Zodra donkere en lage refractiviteitsbollen verschijnen (ongeveer 6 dagen cultuur), is het noodzakelijk om de tumorsferen te subcultuur.
   1. Schud de schotel zachtjes en breng de GCS's tumorsfeer cultuur medium (het medium en de niet-aanhangende tumorsferen) in een steriele 15 mL centrifuge buis. Voor grotere middelgrote volumes kunnen grotere centrifugebuizen nodig zijn.
   2. Centrifuge op 600 x g gedurende 5 minuten en voorzichtig ontdoen van de supernatant. Na centrifugatie zal een off-white pellet zichtbaar zijn.
   3. Voeg 2 mL celdissociatieoplossing toe om de pellet opnieuw op te stellen voor mechanische en enzymatische dissociatie bij 37 °C. Voorzichtig pipet op en neer 10 keer elke 2-3 min in de spijsvertering procedure om de bollen uit elkaar te breken totdat de tumorsferen worden verspreid in een cel suspensie. Dit totale dissociatieproces wordt aanbevolen om minder dan 15 min te zijn.
      OPMERKING: Voer een visuele controle uit onder de microscoop om te bevestigen dat er geen grote bollen of celaggregaten overblijven.
   4. Voeg 10 mL verse voorverwarmde GCS complete cultuurmedium (5x het volume van de celloslatingsoplossing) toe om de spijsverteringsprocedure te beëindigen en centrifuge bij 800 x g bij RT gedurende 5 minuten.
   5. Gooi de supernatant weg en verhoog de cellen met 1 mL verse voorverwarmde GCSCs complete kweekmedium. Zaad een passend aantal cellen in een nieuw petrischaaltje van 100 mm met 10 mL verse voorverwarmde GCS's volledige kweekmedium en incubaat bij 37 °C, 5% CO₂.
   6. Refeed tumorsferen culturen na 3 dagen door het toevoegen van 5 mL van verse voorverwarmde complete medium. Na 6 dagen, passagecellen wanneer tumorsferen groeien tot 80-100 μm in diameter.
4. Cryopreservatie van GCSCs
   OPMERKING: Cryopreserve GCS-cellen niet door direct medium toe te voegen aan tumorsferen. GCSCs tumorsferen moeten worden verteerd in enkele cellen, zodat celbeschermende agent kan elke cel in te voeren om de lange termijn stabiele opslag van cellen te garanderen. Zorg ervoor dat de cellen zich in een gezonde situatie bevinden en zonder besmetting.
   1. Oogst GCSCs tumorsfers. Centrifuge op 600 x g gedurende 5 minuten.
   2. Gooi de supernatant weg en voeg 2 mL celdissociatieoplossing toe om GCSCs-tumorsferen bij 37 °C te scheiden. Beëindig de spijsverteringsprocedure door 10 mL GCS complete kweekmedium toe te voegen.
   3. Centrifuge op 800 x g gedurende 5 minuten en verzamel enkele GCSCs.
   4. Schorsen CSCs met serum-vrij cryopreservative medium. De aanbevolen uiteindelijke concentratie is 5 x 10⁵ - 5 x 10⁶ cellen/mL.
   5. Doe de celsuspensie in 1 mL aliquots in gemarkeerde cryogene flesjes.
   6. Plaats onmiddellijk de cryovials die de cellen in een isopropanolkamer bevatten en bewaar ze op -80 °C. Breng de flacons de volgende dag over op vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

2. Generatie van inducible knockdown GCS-lijnen

LET OP: Recombinant lentivirussen zijn aangewezen als Level 2 organismen door het National Institute of Health and Center for Disease Control. De werkzaamheden met betrekking tot lentivirus vereisen het behoud van een bioveiligheidsniveau niveau 2-faciliteit, aangezien de virale supernatants die door deze lentivirale systemen worden geproduceerd, potentieel gevaarlijk recombinantvirus kunnen bevatten.

1. Generatie van lentivirusdeeltjes
   1. Synthetiseer 2 lentivirale vectoren die inducible shRNA dragen gericht op menselijke clusterin en een niet-targeting controle lentiviral vector (GV307) van GeneChem op basis van het ontwerp van Tabel 1 (GV307 vector bevat: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycine).
   2. Zaad 4 x 10⁶ 293T lenti-virale verpakkingscellen in een petrischaaltje van 100 mm met 10 mL DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum.
   3. Incubeer 293T cellen 's nachts bij 37 °C, 5% CO₂. Zorg ervoor dat 293T celdichtheid is ongeveer 50-80% confluent de dag van transfectie.
   4. Breng het verlaagde serummedium op kamertemperatuur en bereid buis A en buis B zoals beschreven in tabel 2.
   5. Breng Tube A in Buis B, meng goed, en incubeer de complexen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om lipide-DNA complexen voor te bereiden.
   6. Verwijder 5 mL medium, voordat u lipide-DNA-complex toevoegt, waardoor er in totaal 5 mL overblijft.
   7. Voeg 5 mL lipid-DNA complex in de cultuur schotel dropwise en zachtjes wervelen de schotel om het complex te verdelen.
      LET OP: Doe voorzichtig vloeistof tegen de afwaswand om storende 293T-cellen te voorkomen.
   8. Kweekschaal voor 24 uur bij 37 °C, 5% CO₂.
   9. Verwijder na 24 uur na de transfectie het transfectiemedium voorzichtig en vervang voorzichtig door 10 mL voorverwarmde DMEM aangevuld met 10% FBS. Incubeer voor 24 uur bij 37 °C, 5% CO₂.
      LET OP: Alle supernatant en tips moeten worden behandeld met 10% bleekmiddel voorafgaand aan verwijdering.
   10. Ongeveer na 48 uur na de transfectie, oogst 10 mL lentivirus-bevattende supernatants.
       LET OP: Alle celkweekvaten en -tips moeten vóór verwijdering met 10% bleekmiddel worden behandeld.
   11. Filter de lentivirale supernatant met behulp van een 0,45 μm poriefilter om cellulair vuil te verwijderen.
       LET OP: Alle filters en spuiten moeten worden behandeld met 10% bleekmiddel voorafgaand aan verwijdering.
   12. Breng verduidelijkt supernatant over naar een steriele container, voeg Lenti-X Concentrator (1/3 volume verduidelijkt supernatant) toe om te mengen door zachte inversie.
   13. Incubeermengsel bij 4 °C 's nachts.
   14. Centrifugemonsters bij 1.500 x g gedurende 45 minuten bij 4 °C. Na centrifugatie, en off-white pellet zal zichtbaar zijn. Verwijder voorzichtig supernatant, waarbij u ervoor zorgt dat de pellet niet wordt verstoord.
       LET OP: Alle supernatant en tips moeten worden behandeld met 10% bleekmiddel voorafgaand aan verwijdering.
   15. Voorzichtig resuspend de pellet in 1 mL van DMEM aangevuld met 10% FBS als virus voorraad, op te slaan op -80 °C.
2. Generatie van stabiele transfected cellijnen
   1. Zaad 6 x 10⁶ GCSCs in een petrischaaltje van 100 mm met 10 mL DMEM aangevuld met 10% FBS voor 24 uur bij 37 °C, 5% CO₂ (70-80% samenvloeiing voorafgaand aan infectie).
   2. Aspirate het medium in de schotel, voeg de geconcentreerde lentivirale deeltjes verdund met 4 mL van volledige DMEM medium met polybrene reagens (5 μg/mL) in de schotel. Incubeer voor 18 uur bij 37 °C, 5% CO₂.
      OPMERKING: De optimale concentratie van polybrene is afhankelijk van het celtype en moet mogelijk in verschillende concentraties worden getest om de effectieve concentraties te bepalen. Anders kan het empirisch worden bepaald, meestal in het bereik van 2-10 μg/mL. Alle buizen en tips moeten worden behandeld met 10% bleekmiddel voorafgaand aan verwijdering.
   3. Verander het medium, vervang het medium door 10 mL DMEM met 10% FBS medium en incubaat voor 24 uur bij 37 °C, 5% CO₂.
      LET OP: Alle medium en de tips moeten worden behandeld met 10% bleekmiddel voorafgaand aan verwijdering.
   4. Aspirate de supernatant met celpuin, vervangen door verse DMEM aangevuld met 10% FBS medium met puromycine (2,5 μg/mL) en incubaat voor 24 uur bij 37 °C, 5% CO₂. Vervang vervolgens verse DMEM aangevuld met 10% FBS-medium met puromycine (5 μg/mL) en incubeer bij 37 °C, 5% CO₂ voor extra 24 uur.
   5. Spoel de aanhangende GCSCs twee maal af met 5 mL DPBS zonder calcium en magnesium.
   6. Dissociate GCSCs met 1 mL voorverwarmde celdissociatieoplossing en incubeer 2-3 min bij 37 °C.
   7. Voeg 5 mL verse voorverwarmde GCS complete kweekmedium toe aan de celsuspensie.
   8. Doe 3 mL in een 15 mL centrifugale buis (buis A) voor cryopreserving de cellen, en de andere 3 mL in een 15 mL centrifugaal buis (buis B) voor inducerende door doxycycline.
   9. Centrifugebuis A en buis B bij 800 x g gedurende 5 minuten.
   10. Resuspend de pellet van buis A met 1 mL serum-vrij cryopreservatiemiddel, breng de flacon naar -80 °C 's nachts, en verwijder het in vloeibare stikstof opslag.
   11. Aspirate de supernatant en resuspend de cellen van buis B in 1 mL van verse voorverwarmde GCSCs complete cultuurmedium. Zaad een passend aantal cellen in een nieuw petrischaaltje van 10 mm van 10 mL verse voorverwarmde GCS's compleet kweekmedium met doxycycline (Dox) (2,5 μg/mL) en incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C, 5% CO₂.
       LET OP: De optimale concentratie van Dox kan variëren tussen de cellijnen. Elke cellijn moet worden getest in verschillende Dox-concentraties om de effectieve concentraties voor KD en toxiciteit op de cellen te bepalen.
   12. Bevestig een stabiele onderdrukking van clusterin in GCSCs door westerse blotting.

3. De vormingstest van de bol

1. Ontdooi de bevroren inducible knockdown GCSCs lijnen (zie stap 1.2).
2. Bepaal de levensvatbare celdichtheid van een monster van 10 μL met behulp van een geautomatiseerd celloket.
3. Pas het volume aan met voorverwarmde GCS complete kweekmedium om een concentratie van 2 x 10⁴ levensvatbare cellen/mL te verkrijgen.
4. Doe in 3 nieuwe 96-well ultra-low-attachment cultuurplaat putten (0,1 mL /well) elke groep.
5. Incubeer de cellen in een couveuse bij 37 °C met 5% CO₂. Bolvorming moet plaatsvinden binnen 3-10 dagen. Monitor en opname de visualisatie van tumorsferen vorming om de 2 dagen.
   OPMERKING: Het medium wordt niet aanbevolen om te worden veranderd in geval van verstoring van de tumorsferenvorming. Deze tumorsferen moeten gemakkelijk worden onderscheiden van enkele en geaggregeerde cellen.
6. Bepaal de resultaten van tumorsfeervorming door de grootte van de gevormde tumorsferen te evalueren met behulp van beeldvormingssoftware.

Resultaten

Maagkanker stamcellen van primaire menselijke maag adenocarcinoom werden gekweekt in serum-vrije cultuur medium. Na 6 dagen breidden cellen zich uit van het eencellige fenotype(figuur 1A) tot grote bollen (figuur 1B).

Om de functie van clusterin in GCSCs te beoordelen, werden shRNA-sequenties tegen clusterin en scrambled gekloond in tet...

Discussie

GC is wereldwijd de derde belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen. GCSCs zijn van cruciaal belang bij terugval van maagkanker, metastase en resistentie tegen geneesmiddelen. Met behulp van GCSCs van maagkanker patiënten zal ons toelaten om hun zwakke plek te verkennen en de targeting drugs te ontwikkelen voor de behandeling van GC patiënten.

De bolvorming test is een nuttige methode om kanker stamcel zelfvernieuwing potentieel in vitro te onderzoeken. Resultaten kunnen worde...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
2-Mercaptoethanol	Gibco	2068586
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate	Gibco	10569044
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190250
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia	Gibco	10099141
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061
Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X	Gibco	41400045
lentiviral vector	GeneChem	GV307
Lenti-X Concentrator	Takara	631232
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	Gibco	11140050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLHV033RB
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes	Thermo Scientific	5000-1020
Nunc Cell Culture/Petri Dishes	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
pHelper 1.0 (gag/pol component)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (VSVG component)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase Cell Dissociation Solution	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5	Invitrogen	15567027
ZEISS Inverted Microscope	ZEISS	Axio Vert.A1