Kraaktemporale parameters van cellulaire exocytose in micropatterned cellen kwantificeren

Summary

Live beeldvorming van lysosomale exocytose op micropatterned cellen maakt een ruimtelijke kwantificering van dit proces mogelijk. Morfologie normalisatie met behulp van micropatronen is een uitstekend hulpmiddel om algemene regels over de ruimtelijke verdeling van cellulaire processen te ontdekken.

Abstract

Live beeldvorming van het pHluorine gelabeld Oplosbare N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-geassocieerd membraaneiwit 7 (VAMP7) door totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM) is een eenvoudige manier om de afscheiding uit het lysosomale compartiment te verkennen. Gebruikmakend van de celcultuur op micropatronen om de celvorm te normaliseren, werden verschillende statistische instrumenten gebruikt om een ruimtelijke analyse van secretoire patronen uit te voeren. Met behulp van Ripley's K-functie en een statistische test op basis van de dichtstbijzijnde buurafstand (NND), hebben we bevestigd dat afscheiding van lysosomen geen willekeurig proces is, maar significante clustering vertoont. Van nota, onze analyse toonde aan dat exocytose gebeurtenissen ook geclusterd in niet-hechting gebieden, wat aangeeft dat hechting moleculen zijn niet de enige structuren die kunnen leiden tot secretoire hot spots op het plasmamembraan. Toch ontdekten we dat celhechting de clustering verbetert. Naast nauwkeurig gedefinieerde lijm- en niet-belangrijke gebieden, maakt de cirkelvormige geometrie van deze micropatronen het gebruik van polaire coördinaten mogelijk, waardoor analyses worden vereenvoudigd. We gebruikten Kernel Density Estimation (KDE) en de cumulatieve distributiefunctie op polaire coördinaten van exocytosegebeurtenissen om verrijkte gebieden van exocytose te identificeren. In ringvormige micropatronen vond clustering plaats aan de grens tussen de lijm en niet-aangrenzende gebieden. Onze analyse illustreert hoe statistische instrumenten kunnen worden gebruikt om ruimtelijke verdelingen van diverse biologische processen te onderzoeken.

Introduction

Exocytose is een universeel cellulair proces waarbij een blaasje samensmelt met het plasmamembraan en de inhoud ervan vrijgeeft. De blaas kan ofwel volledig samensmelten met het plasmamembraan (volledige fusie) of een fusieporie creëren die gedurende een beperkte tijd open blijft (kiss-and-run)¹. Zo komen nieuw gesynthetiseerde eiwitten vrij in het extracellulaire medium van akelige die afkomstig zijn van het Golgi-complex. Deze biosynthetische, anterograde route is primordiale, vooral in meercellige organismen, om signaal peptiden afscheiden (bijvoorbeeld hormonen, neurotransmitters) en extracellulaire matrix componenten (bijvoorbeeld collageen), evenals om transmembrane eiwitten te verhandelen naar het plasmamembraan. Bovendien kunnen afscheidingen optreden van verschillende endosomosomen: 1) recycling endosomes om transmembranen te hergebruiken; 2) multivesiculaire instanties (MVB's) om exosomen vrij te geven; en 3) lysosomen voor het vrijkomen van proteolytische enzymen. Endosomale afscheiding is aangetoond dat het belangrijk is voor neurite uitgroei, pseudopodia vorming, plasma membraan reparatie, en ATP-afhankelijke signalering².

Om exocytose op eencellig niveau te bestuderen, zijn verschillende technieken toegepast. Patch-klem zorgt voor de detectie van enkele exocytose gebeurtenissen met een hoge temporele resolutie in een breed scala van levende cellen³. Deze methode geeft echter geen informatie over de lokalisatie van exocytosegebeurtenissen, noch uit welk compartiment het voorkomt. Elektronenmicroscopie maakt directe visualisatie van exocytische gebeurtenissen met hoge ruimtelijke resolutie mogelijk, en in combinatie met immunolabeling geeft informatie over de specificiteit van de betrokken compartimenten en moleculen. Een nadeel van deze aanpak is het gebrek aan informatie over de dynamiek van het proces, evenals het onvermogen om high-throughput studies uit te voeren. Lichte microscopie benaderingen zoals totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM), die gebruik maakt van de evanescente veld om fluoroforen te verlichten in de buurt van de coverslip (100 nm), biedt een goede temporele en ruimtelijke resolutie om exocytose gebeurtenissen te bestuderen. Deze methode is echter alleen compatibel met aanhangende cellen en kan alleen worden toegepast op het ventrale/inferieure deel van cellen.

Van belang, het plasmamembraan onthult significante heterogeniteit op basis van lijmcomplexen die alleen aanwezig zijn in gebieden met beperkte toegang. Deze heterogeniteit beperkt bijvoorbeeld de opname van verschillende liganden⁴. Ook is onlangs gemeld dat afscheiding van het Golgi-complex is geconcentreerd op "hot spots" in het plasmamembraan⁵. Bovendien is het bekend dat bepaalde ladingen worden afgescheiden door focal-adhesie-geassocieerde exocytose⁶. Er moet dus bijzondere aandacht worden besteed aan de vraag of exocytosegebeurtenissen willekeurig in de ruimte worden verspreid, of dat ze geconcentreerd zijn op specifieke gebieden van het plasmamembraan. Verschillende statistische instrumenten op basis van de K-functie van Ripley zijn voorgesteld om deze vragen te onderzoeken^7,8,9. Onze aanpak combineert deze tools met micropatronen om celvorm en plasmamembraan heterogeniteit te controleren. Deze techniek biedt niet alleen een middel om onderscheid te maken tussen lijm- en niet-belangrijke gebieden, maar maakt ook vergelijking tussen verschillende cellen en omstandigheden mogelijk en verhoogt de kracht van statistische analyses.

Hier maken we gebruik van een verscheidenheid aan statistische instrumenten om de ruimtelijke verdeling van exocytosegebeurtenissen te bestuderen uit het lysosomale compartiment dat wordt bewaakt door TIRFM live celbeeldvorming van VAMP7-pHluorine in ringvormige micropattern-genormaliseerde hTert-RPE1-cellen. Er werd bevestigd dat afscheiding van lysosomen geen willekeurig proces^8,9 is en dat exocytosegebeurtenissen clustering vertonen. Van nota, vonden we dat exocytose gebeurtenissen zijn ook geclusterd in niet-belangrijke gebieden, wat aangeeft dat hechting moleculen zijn niet de enige structuren die secretoire hot spots kan induceren op het plasmamembraan. Niettemin, celhechting heeft versterkt clustering. Consequent identificeerde onze analyse verrijkte gebieden van exocytose die zich op de grens tussen de lijm en niet-aangrenzende gebieden bevonden.

Protocol

1. Bereiding van micropatronen

1. Transfectie van cellen
   1. Een dag voor de transfectie, zaad 2,5 x 10⁶ hTERT-RPE1 cellen in een put van een 12 put plaat (2 x 2 cm) in 1 mL van medium.
   2. Bereid op de dag van de overbesmetting het transfectiemengsel met VAMP7-pHluorin plasmid (100 μL buffer, 0,8 μg DNA, 3 μL transfectiemengsel). Incubeer gedurende 10 minuten.
      OPMERKING: VAMP7 is een lysosomale v-SNARE, gefuseerd met een luminale pHluorin-tag. De pHluorine sonde wordt gedoofd door lage pH, maar tijdens exocytose protonen worden vrijgegeven en pHluorine begint het uitzenden van een signaal^10,11.
   3. Voeg de transfectiemix toe aan de cellen in hun medium.
   4. Verander het medium 4 uur na het toevoegen van de transfectie mix op de cellen.
   5. Gebruik de cellen voor experimenten tijdens de volgende 24-48 uur.
2. Micropatroonvoorbereiding (fotolithografiemethode)
   1. Was de coverslips (25 mm diameter) in ethanol en laat ze 5 minuten drogen.
   2. Activeer coverslips door verlichting onder diepe UV gedurende 5 minuten.
   3. Maak een vochtige kamer door een papieren handdoek waarop een paraffinefilm is geplaatst grondig te bevochtigen. Voeg druppels (30 μL voor 22 mm coverslip) van Poly-L-Lysine-graft-Polyethyleen Glycol (PLL-g-PEG) oplossing (0,1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH = 7.4) en plaats coverslips met het geactiveerde oppervlak erop. Sluit de vochtige kamer met een top en incubeer coverslips voor 1 uur.
   4. Was coverslips 2x in PBS en 1x in gedestilleerd water en laat ze drogen.
   5. Was het kwartsfotomasker met gedestilleerd water en vervolgens met ethanol of propanol. Droog het fotomasker met gefilterde luchtstroom.
      OPMERKING: Het quartz fotomasker is aan de ene kant bekleed met antireflecterend chroom dat gaten in de vorm van micropatronen bevat. In dit protocol wordt een fotomasker gebruikt met ringvormige micropatronen van 37 μm. Wanneer diepe UV op het fotomasker schittert, kan het licht alleen door deze gaten¹²gaan.
   6. Stel het fotomasker (met chroom gecoate kant) gedurende 5 minuten bloot aan diepe UV om het oppervlak schoon te maken.
   7. Voeg kleine waterdruppels (10 μL voor een 20 mm coverslip) toe aan de met chroom bedekte kant van het fotomasker. Plaats de coverslip met hun PLL-g-PEG-behandelde kant op de druppel en droog het extra water. Zorg ervoor dat er zich geen luchtbellen vormen tussen het masker en de coverslips.
      LET OP: De capillaire kracht van het water zal de coverslips immobiliseren.
   8. Stel het fotomasker 5 minuten bloot aan diepe UV met de niet-chroom gecoate zijkant omhoog (de covers zijn bevestigd aan het onderste oppervlak).
      LET OP: Het licht kan alleen door de gaten gaan en het PLL-g-PEG-behandelde oppervlak van covers onder het fotomasker aanpassen.
   9. Verwijder de covers van het fotomasker door overtollig water toe te voegen.
      LET OP: Coverslips moeten snel wegdrijven.
   10. Incubeer de coverslips in een oplossing van extracellulaire matrixeiwitten (50 μg/mL fibronectin, 5 μg/mL fluorescerende fibrinogen verdund in water) op paraffinefilm in een vochtige kamer (zoals in stap 1.2.3) gedurende 1 uur onder een laminaire stroomkap om besmetting te voorkomen.
       LET OP: Het experiment kan op dit punt worden onderbroken door de coverslips in PBS op 4 °C op te slaan.
3. Celzaaien op micropatronen
   1. Gebruik een magnetische coverslip houder die past bij de grootte van de micropatterned coverslips om de coverslips te monteren. Verwarm op de dag van de verwerving de afdekkenhouder tot 37 °C om thermische schokken voor de cellen tijdens volgende stappen te voorkomen.
   2. Bereid het patroonmedium voor door DMEM/F12 medium aan te vullen met 20 mM HEPES en 2% penicilline/streptomycine.
   3. Plaats coverslips in de houder met de micropatterned side up en voeg patroonmedium toe zodra de coverslip zich op de houderbasis bevindt. Voeg de afdichting toe en immobiliseer met het magnetische apparaat. Vul de coversliphouder met het patroonmedium en sluit deze met het glazen deksel.
      LET OP: Wees er snel bij, laat de afdekplaten niet drogen. Was de coversliphouder niet met ethanol tussen de experimenten door, omdat de afdichting mogelijk wat ethanol vasthoudt, wat kan reageren met PLL-g-PEG en kan leiden tot celstress. Was de coverslip houder alleen met zeepwater. Bovendien kan het gewricht worden geïncubeerd in het patroonmedium bij 37 °C gedurende 1 uur om het restproduct te verdunnen.
   4. Verzamel transfected hTERT-RPE1 cellen door trypsinisatie (0,5 mL voor een 12 putplaat) en voeg 1 mL van 10% FBS DMEM/F12 medium toe.
   5. Voeg 0,5 x 10⁶ transfected hTERT-RPE1 cellen toe aan de coversliphouder en sluit deze opnieuw af. Incubeer gedurende 10 minuten in de couveuse.
   6. Was de coverslip houder 5x met patroon medium om nonattached cellen en resterende FBS te verwijderen door het toevoegen van het patroon medium met een pipet en aspirating het medium met een andere pipet om een wasstroom te creëren. Houd altijd een klein volume patroonmedium in de coversliphouder om te voorkomen dat de cellen op de micropatroondekslip worden gedroogd, wat zal leiden tot celdood.
   7. Incubeer in de couveuse voor 3 uur om volledige cel verspreiding mogelijk te maken.

2. Verwerving van exocytosegegevens

1. Beeldvorming van exocytosegebeurtenissen
   1. Plaats coversliphouder onder een TIRM. Het signaal moet worden gedetecteerd door een gevoelige camera ingesteld met de beste imaging formaat beschikbaar.
      OPMERKING: In dit experiment werden een 100x lensdoelstelling en een EMCCD-camera met 512 x 512 pixeldetectiegebied gebruikt, wat leidde tot een pixelgrootte van 160 nm.
   2. Zoek naar een cel die VAMP7-pHluorine uitdrukt die volledig is verspreid(figuur 1A).
      OPMERKING: Cellen die VAMP7 uitdrukken zijn duidelijk herkenbaar, omdat ze een groen signaal vertonen.
   3. Verander de hoek van de laser tot een TIRF-hoek die de visualisatie van VAMP7-pHluorine exocytose-gebeurtenissen mogelijk maakt. Voer een acquisitie van 5 minuten uit op een frequentie die compatibel is met de exocytosesnelheid en -tijdschaal (meestal 3 Hz, figuur 1D)met behulp van de microscoopsoftware.
      LET OP: hTERT-RPE1 cellen hebben een lysosomale secretoire snelheid van ongeveer 0,3 Hz op micropatronen. Lysosomale exocytose heeft een typische duur van 1 s. Het wordt gekenmerkt door een piekintensiteit gevolgd door een exponentieel verval. De verspreiding van de sonde moet op dit moment duidelijk zijn(figuur 1B, C).
   4. Voor elke cel, ook het uitvoeren van een overname van het micropatroon met behulp van de microscoop software (Figuur 1A).
2. Verwerving van exocytosecoördinaten
   1. Open de verkregen film met ImageJ/FIJI. Bestand gebruiken | Invoer | Afbeeldingsvolgorde. Vind exocytose gebeurtenissen door het oog. Een exocytose gebeurtenis wordt gekenmerkt door het verschijnen van een helder signaal dat zich naar buiten verspreidt(figuur 1).
   2. Gebruik het puntgereedschap om het midden van de exocytische gebeurtenis te markeren. Analyse gebruiken | Meet om X- en Y-coördinaten te meten, evenals de temporele coördinaat (segmentnummer). Voer deze metingen uit voor alle exocytose-gebeurtenissen van de film.
   3. De resultaten opslaan (Resultaten | Dossier | Opslaan als). Maak een tekstbestand voor elke geanalyseerde cel met de naam "Resultaten(cell_name).txt" dat de coördinaten slice, X-coördinaten en Y-coördinaten bevat voor alle exocytosegebeurtenissen in die volgorde.
      
      Het tekstbestand zou er als volgt moeten uitzien:
      ID X Y Feret's diameter Radius
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      LET OP: Zorg ervoor dat alle komma's worden vervangen door punten.
   4. Meet het midden en de diameter van elke cel met behulp van het "Oval Tool". Plaats een perfecte cirkel (gebruik geen ovaal) en gebruik "Measure" om de X- en Y-coördinaten en Feret's diameter te verkrijgen. Sla de identiteit (ID), X- en Y-coördinaten van elke cel, de diameter van Feret en de straal (diameter/2) op in een tekstbestand met de naam "Sferische parameter.txt".
      
      Het tekstbestand zou er als volgt moeten uitzien:
      ID X Y Feret's diameter Radius
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
      
      LET OP: Zorg ervoor dat alle komma's worden vervangen door punten.
   5. Meet de dikte van de micropatternring (hechtingslengte) met het rechte gereedschap en sla de cel-ID, celradius (uit het bestand: "Sferische parameter.txt") en hechtingslengte op in een tekstbestand met de naam "Pattern parameter.txt". Bereken de genormaliseerde hechtingslengte door de hechtingslengte te delen door een celstraal.
      LET OP: Zorg ervoor dat alle komma's door punten worden vervangen.
      
      Het bestand moet er als volgt uitzien:
      Id-celstraalhechtlengte Genormaliseerde hechtingslengte
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0,295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0,304347826

3. Ruimtelijke analyse met één cel

1. R-pakket en installatie
   OPMERKING: Het R-pakket voor deze analyse maakt gebruik van het Spatstat-pakket¹³ om de tweedimensionale (2D)-dichtheid en de K-functie van Ripley te berekenen. De code is open-source en maakt gebruik van tekstbestanden die eerder zijn beschreven.
   1. Download en installeer R van https://www.r-project.org/ (versie 3.5.2 werd gebruikt in deze analyse).
   2. Download het pakket (en de demo dataset) van: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
   3. Installeer het pakket op R Studio met "Tools" met "Installatiepakketten". Selecteer 'Pakketarchiefbestand (.zip; .tar.gz)voor de categorie "Installeren vanaf:" en kies het pakketbestand. Druk opInstalleren.
   4. Laad het pakket met de functie "library("ExocytoseSpatialAnalysis")" door deze opdracht in de R-studio te schrijven en opEnterte drukken.
   5. Voer het pakket uit met de functie "ESA()door deze opdracht in R studio te schrijven en opEnter tedrukken.
      OPMERKING: Er wordt een gebruikersinterface geopend.
   6. Selecteer de map voor de gegevensset (.txt-bestanden) en een map voor uitvoerplots.
      OPMERKING: Parameters van de analyse (zie tekst hieronder) kunnen worden gewijzigd via een gebruikersinterface.
   7. Dit script start en voert de analyse automatisch uit. Het biedt .pdf-bestanden van overeenkomstige plots en .txt-bestanden met numerieke resultaten.

Results

De spatiotemporale kenmerken van exocytose-voorvallen werden geanalyseerd op lysosomen gevisualiseerd door VAMP7-pHluorine^10,11 in hTert-RPE1 cellen. hTert-RPE1-cellen zijn niet-getransformeerde cellen die goed tot micropatronen worden gebruikt en die op grote schaal zijn gebruikt in eerdere micropatronen^4,14. VAMP7 is een lysosomale v-SNARE¹⁵ die werd gelabeld met de super eclipti...

Discussion

We monitorden exocytosegebeurtenissen uit het lysosomale compartiment door TIRFM live celbeeldvorming van VAMP7-pHluorine in ringvormige micropattern-genormaliseerde cellen en voerden een rigoureuze statistische analyse uit van de ruimtelijke parameters van exocytosegebeurtenissen. In dienst van de getransformeerde Ripley's K-functie en een statistische test op basis van de dichtstbijzijnde afstand van de buren, bevestigden we dat afscheiding van lysosomen geen willekeurig proces is^8,,<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamlide Magnetic Chamber	Chamlide
DMEM/F12	Gibco	21041-025
Fibrinogen	Molecular Probes, Invitrogen	F35200
Fibronectin bovine plasma	Sigma	F1141
HEPES (1M)	Gibco	15630-056
hTert RPE1 cell line	https://www.atcc.org
ImageJ	http://rsbweb.nih.gov/ij/	n/a	Authored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagent	Polyplus	114-07
Penicilin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Photomask	Delta Mask
PLL-g-PEG solution	Surface Solutions	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software	https://www.r-project.org/	n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X)	Gibco	12605-010
UV ozone oven	Jelight Company Inc	342-220
VAMP7-pHFluorin plasmid	n/a	n/a	Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.