Celoppervlakreceptoridentificatie met genoomschaal CRISPR/Cas9 genetische schermen

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een genoom-schaal celgebaseerde screening benadering om extracellulaire receptor-ligand interacties te identificeren.

Samenvatting

Intercellulaire communicatie bemiddeld door directe interacties tussen membraan-embedded celoppervlak receptoren is cruciaal voor de normale ontwikkeling en werking van meercellige organismen. Het detecteren van deze interacties blijft technisch uitdagend, echter. Dit manuscript beschrijft een systematische genoom-schaal CRISPR / Cas9 knock-out genetische screening aanpak die cellulaire trajecten die nodig zijn voor specifieke cel oppervlak erkenning gebeurtenissen onthult. Deze test maakt gebruik van recombinant eiwitten geproduceerd in een zoogdier eiwit expressie systeem als fervent bindende sondes om interactie partners te identificeren in een cel-gebaseerde genetische scherm. Deze methode kan worden gebruikt om de genen te identificeren die nodig zijn voor celoppervlak interacties gedetecteerd door recombinant bindende sondes die overeenkomen met de ectodomains van membraan-embedded receptoren. Belangrijk, gezien de genoom-schaal aard van deze aanpak, het heeft ook het voordeel van niet alleen het identificeren van de directe receptor, maar ook de cellulaire componenten die nodig zijn voor de presentatie van de receptor aan het celoppervlak, waardoor waardevolle inzichten in de biologie van de receptor.

Inleiding

Extracellulaire interacties door celoppervlak receptor eiwitten directe belangrijke biologische processen zoals weefsel organisatie, gastheer-pathogene erkenning, en immuun regulering. Het onderzoeken van deze interacties is van belang voor de bredere biomedische gemeenschap, omdat membraanreceptoren bruikbare doelwitten zijn van systematisch geleverde therapieën zoals monoklonale antilichamen. Ondanks hun belang blijft het bestuderen van deze interacties technisch uitdagend. Dit komt vooral omdat membraan-embedded receptoren amphipathisch zijn, waardoor ze moeilijk te isoleren zijn van biologische membranen voor biochemische manipulatie, en hun interacties worden gekenmerkt door de zwakke interactieaffinities(K_Ds in het μM-mM-bereik)¹. Daarom zijn veelgebruikte methoden ongeschikt om deze klasse van eiwitinteracties^1,2te detecteren .

Een reeks methoden is ontwikkeld om specifiek te onderzoeken extracellulaire receptor-ligand interacties die hun unieke biochemische eigenschappen in aanmerking nemen³. Een aantal van deze benaderingen omvatten het uitdrukken van het gehele ectodomein van een receptor als een oplosbaar recombinant eiwit in zoogdier- of insectcelgebaseerde systemen om ervoor te zorgen dat deze eiwitten posttranslationele wijzigingen bevatten die structureel belangrijk zijn, zoals glycanen en disulfidebindingen. Om de binding met lage affiniteit te overwinnen, worden de ectodomeinen vaak oligomeriseerd om hun bindingsbidheid te vergroten. Fervent eiwit ectodomains zijn met succes gebruikt als bindende sondes om interactiepartners te identificeren in directe recombinante eiwit-eiwit interactie schermen^4,5,6,7. Hoewel in grote lijnen succesvolle, recombinante eiwitgebaseerde methoden vereisen dat het ectodomein van een membraanreceptor wordt geproduceerd als een oplosbaar eiwit. Daarom is het in het algemeen alleen van toepassing op eiwitten die een aaneengesloten extracellulaire regio bevatten (bijvoorbeeld single-pass type I, type II of GPI-verankerd) en is over het algemeen niet geschikt voor receptorcomplexen en membraaneiwitten die het membraan meerdere keren overspannen.

Expressie klonen technieken waarin een bibliotheek van complementaire SMA's (cDNAs) wordt omgezet in cellen en getest op een gain-of-binding fenotype zijn ook gebruikt om extracellulaire eiwit-eiwit interacties te identificeren⁸. De beschikbaarheid van grote collecties gekloonde en gesequencede cDNA-expressieplasmids in de afgelopen jaren heeft methoden vergemakkelijkt waarbij cellijnen die cDNAs-coderingsceloppervlakreceptoren overdrijven, worden gescreend op de binding van recombinante eiwitten om interacties^9,10te identificeren . De cDNA overexpression-gebaseerde benaderingen bieden, in tegenstelling tot recombinante eiwitgebaseerde methoden, de mogelijkheid om interacties in de context van het plasmamembraan te identificeren. Het succes van het gebruik van cDNA-expressieconstructies hangt echter af van het vermogen van de cellen om het eiwit in de juiste gevouwen vorm te overexpresseren, maar dit vereist vaak cellulaire accessoirefactoren zoals transporters, chaperonnes en correcte oligomeric assemblage. Het transfecteren van één cDNA is daarom misschien niet voldoende om een expressie van het celoppervlak te bereiken.

Screening technieken met behulp van cDNA constructies of recombinant eiwit sondes zijn resource-intensieve en vereisen grote collecties van cDNA of recombinant eiwit bibliotheken. Speciaal ontworpen massaspectrometrie gebaseerde methoden zijn onlangs gebruikt om extracellulaire interacties die niet vereisen de montage van grote bibliotheken te identificeren. Deze technieken vereisen echter chemische manipulatie van het celoppervlak, wat de biochemische aard van de moleculen op het oppervlak van de cellen kan veranderen en momenteel alleen van toepassing is op interacties die worden gemedieerd door glycosylated eiwitten^11,12. De meerderheid van de momenteel beschikbare methoden ook sterk richten op de interacties tussen eiwitten, terwijl grotendeels het negeren van de bijdrage van het membraan micro-omgeving, met inbegrip van moleculen zoals glycanen, lipiden, en cholesterol.

De recente ontwikkeling van zeer efficiënte bialleleic targeting met behulp van CRISPR-gebaseerde benaderingen heeft genoom-schaal bibliotheken van cellen zonder gedefinieerde genen in een enkele pool die kan worden gescreend in een systematische en onpartijdige manier om cellulaire componenten die betrokken zijn in verschillende contexten te identificeren, inclusief het ontleden van cellulaire signaleringsprocessen, identificatie van verstoringen die resistentie tegen geneesmiddelen, toxines en ziekteverwekkers verlenen, en het bepalen van de specificiteit van antilichamen^13,14,15,16. Hier beschrijven we een op genoomschaalfelijke CRISPR-gebaseerde knock-outcelscreeningtest die een alternatief biedt voor de huidige biochemische benaderingen om extracellulaire receptor-ligand interacties te identificeren. Deze benadering van het identificeren van interacties bemiddeld door membraanreceptoren door genetische schermen is bijzonder geschikt voor onderzoekers die een gerichte interesse hebben op individuele liganden, omdat het vermijdt de noodzaak om grote bibliotheken van cDNAs of recombinante eiwitten samen te stellen.

Deze test bestaat uit drie belangrijke stappen: 1) Zeer gretige recombinant eiwitbindingssondes bestaande uit de extracellulaire gebieden van een receptor van belang worden geproduceerd en gebruikt in fluorescentie-gebaseerde flow cytometrie gebaseerde bindende testen; 2) De bindende tests worden gebruikt om een cellijn te identificeren die de interactiepartner van de recombinant eiwitsonde uitdrukt; 3) Een Cas9-expressing versie van de cellijn die interageert met het eiwit van belang wordt geproduceerd en een genoom-schaal CRISPR / Cas9-gebaseerde knock-out scherm wordt uitgevoerd (Figuur 1). In dit genetische scherm wordt binding van een recombinant eiwit aan cellijnen gebruikt als meetbaar fenotype waarbij cellen binnen de knock-outbibliotheek die het vermogen hebben verloren om de sonde te binden worden gesorteerd met behulp van op fluorescentie gebaseerde geactiveerde celsorde (FACS) en de genen die het verlies veroorzaakten van het bindende fenotype dat door sequencing is geïdentificeerd. In principe worden de genen geïdentificeerd die de receptor coderen die verantwoordelijk is voor het binden van de fanatieke sonde en die welke nodig zijn voor het display van het celoppervlak.

De eerste stap van dit protocol omvat de productie van enthousiaste recombinante eiwitsondes die het ectodomein van de membraangebonden receptoren vertegenwoordigen. Van deze receptoren is bekend dat ze vaak hun extracellulaire bindingsfuncties behouden wanneer hun ectodomeinen worden uitgedrukt als een recombinant oplosbaar eiwit¹. Voor een eiwit van belang, oplosbare recombinant eiwitten kunnen worden geproduceerd in een geschikte eukaryotische eiwit expressie systeem in elk formaat, op voorwaarde dat het kan oligomerized voor verhoogde binding avidity, en het bevat tags die kunnen worden gebruikt in fluorescentie-gebaseerde flow cytometrie gebaseerde bindende testen (bijvoorbeeld, FLAG-tag, biotine-tag). Gedetailleerde protocollen voor de productie van oplosbare ectodomeinen van membraanreceptoren met behulp van het HEK293-eiwitexpressiesysteem,^evenalsverschillende multimerisatietechnieken en de eiwitexpressieconstructies voor de productie van zowel pentamerische eiwitten als monomeereiwitten zijn eerder beschreven 1^,17. Het protocol hier zal beschrijven de stappen voor het genereren van fluorescerende enthousiaste sondes van monomerische biotinylated eiwitten door ze te conjugating tot streptavidin geconjugeerd tot een fluorchrome (bijvoorbeeld, fycoerythrin, of PE), die direct kan worden gebruikt in celgebaseerde bindende testen en heeft het voordeel van het niet vereisen van een secundaire antilichaam voor detectie. Algemene protocollen voor het uitvoeren van genoom-schaal schermen zijn al beschreven^20,21, dus het protocol vooral gericht op de specifieke kenmerken van het uitvoeren van flow cytometrie-gebaseerde recombinant eiwit binding schermen met behulp van de CRISPR / Cas9 knock-out screening systeem met behulp van de Human V1 ("Yusa") bibliotheek¹⁸.

Protocol

1. Productie en zuivering van gebiotinyleerde his-tagged eiwitten

1. Gebruik een eiwitexpressiesysteem op basis van zoogdieren of insectencellen om oplosbare recombinant Te produceren Met zijn gelabelde biotinylated eiwitten (zie plasmiconstructies in tabel 1).
   OPMERKING: Een gedetailleerd protocol voor de productie van monomerische biotine en zijn gelabelde eiwitten met behulp van het HEK293-celexpressiesysteem wordt beschreven door Kerr et al.¹⁷. Eiwit ectodomains uitgedrukt met behulp van de HEK293 expressie systeem worden uitgescheiden in de cultuur medium.
2. Verzamel de oplosbare eiwitten door de cellen te pelleteren door centrifugatie op 3.000 x g gedurende 20 minuten.
3. Filtreer de supernatant door een 0,22 μm filter en voeg de Ni²⁺-NTA agarose kralen toe aan het gefilterde eiwit supernatant in een 1:1.000 verhouding (d.w.z. 50 μL van 50% agarose drijfmest in 50 mL supernatant). Incubeer 's nachts of ten minste 4-5 uur bij 4 °C op een roterend platform.
4. Was de polypropyleenkolom door 5 mL van zijn zuiveringswasbuffer toe te voegen. Raadpleeg tabel 2 voor alle buffersamenstellingen.
5. Giet het hele kraal-eiwit supernatant mengsel in de kolom. Kralen zullen zich ophopen aan de basis.
6. Was de kralen 2x met 15 mL wasbuffer. Om eiwitverdunning te voorkomen, moet u voorzichtig de resterende wasbuffer uit de kolom halen met een spuit van 5 mL en weggooien.
7. Voeg voorzichtig 300-500 μL van zijn zuivering elution buffer direct aan de kralen en incubbate voor ten minste 1 uur. Verzamel de eluted eiwit door opnieuw zorgvuldig tekening uit de vloeistof met behulp van een 1 mL spuit. Wissel de elutiebuffer om naar de gewenste buffer (bijvoorbeeld normaal gesproken PBS of HBS) met behulp van ontziltingskolommen. Bewaar alle eiwitten op 4 °C tot verder gebruik.

2. Kwantificering en oligomerisatie van monomerisch biotinylated eiwit

OPMERKING: Om de bindingsbividiteit te vergroten, oligomeriseren biotinylated monomerische eiwitten op tetrameric streptavidin-PE voordat ze worden gebruikt in bindende tests. Optimale conjugatieverhoudingen van monomerische eiwitten en tetramerische streptavidin-PE bereiken door een verdunningsreeks biotinylated monomeren te testen tegen een vaste concentratie streptavidin en door empirisch de minimale verdunning vast te stellen waarbij geen overtollige biotinylhoudende monomeren kunnen worden gedetecteerd.

1. Maak ten minste acht seriële verdunningen van biotinylated eiwitmonsters met behulp van een geschikte verdunningsbuffer (PBS of HBS met 1% boviene serumalbumine [BSA]) in een 96 putplaat. Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume van elke verdunning ten minste 200 μL bedraagt.
2. Maak een dubbele plaat van de monsters door het verwijderen van 100 μL uit elke put en de overdracht in een nieuwe 96 put plaat. Neem altijd een controle op. In dit geval zijn de controles tag-only proteïnen (d.w.z., biotinylated Zijn-gelabeld Cd4 domein 3+4 eiwit). Dit zal worden gebruikt als een controle sonde in alle bindende tests.
3. Verdun streptavidin-PE tot 0,1 μg/mL in de verdunningsbuffer.
4. Voeg op slechts één van de platen 100 μL van de verdunde streptavidin-PE toe. De dubbele plaat zal dienen als een controle. Voeg 100 μL verdunningsbuffer toe aan de regelplaat om de volumes te egaliseren.
5. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT). Blokkeer ondertussen de putten van een met streptavidin bedekte plaat met de verdunningsbuffer gedurende 15 minuten.
6. Breng het totale volume van het monster van beide platen over naar afzonderlijke putten van de met streptavidin gecoate platen en broeder gedurende 1 uur bij RT.
7. Was de plaat 3x met 200 μL wasbuffer (d.w.z. PBS of HBS met 0,1% Tween-20, 2% BSA). Voeg 100 μL van 2 μg/mL muis anti-rat Cd4d3+4 IgG (OX68) toe en incubaat voor 1 uur bij RT.
8. Was de plaat 3x met de wasbuffer. Voeg 100 μL van een anti-muis alkalische fosforconjugaaf toe bij 0,2 μg/mL voor 1 h bij RT.
9. Was de plaat 3x met wasbuffer en 1x in verdunningsbuffer.
10. Bereid p-nitrofenylfosfaat voor op 1 mg/mL in de diethanolaminebuffer. Voeg 100 μL in elke put en incubeer gedurende 15 minuten.
11. Neem absorptiewaarden op 405 nm. Gebruik de minimale verdunning waarbij er geen signaal op de plaat is als de juiste verdunningsfactor om tetrameren te creëren (figuur 2).
12. Maak een 10x tetramer kleuroplossing voor alle monsters en controles door 4 μg/mL streptavidin-PE en de juiste biotinylated eiwitverdunning gedurende 30 minuten op te slaan in RT. Bewaar geconjugeerde eiwitten in een licht beschermde buis bij 4 °C tot verder gebruik.

3. Flow cytometrie gebaseerde celbindingstesten

1. Voor aanhangende cellen, verwijder cultuur media en was 1x met PBS zonder divalent cations. Voeg vervolgens celloslatingsoplossingen toe (bijvoorbeeld EDTA). Laat de cellen 5-10 minuten losmaken.
   OPMERKING: Vermijd het gebruik van trypsine-gebaseerde producten als ze kunnen klitten celoppervlak eiwitten.
2. Verzamel losstaande cellen in een buis. Voor cellen die in suspensie groeien (bijvoorbeeld HEK293-cellen), verzamelt u de cellen rechtstreeks van kweekkolven in een buis.
3. Pelletcellen op 200 x g gedurende 5 min. Verwijder de supernatant en zet de pellet opnieuw op in wasbuffer (d.w.z. PBS/1% BSA).
4. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en pas de concentratie aan op 2,5 x 10⁵-1 x 10⁶ cellen/mL. Aliquot 100 μL bereide celmix op een 96 goed U- of V- bodemplaat. Draai de plaat 5 min op 400 x g. Verwijder de supernatant met een meerkanaals pipet.
5. Voeg 100 μL genormaliseerd fluorescerend gelabeld zeer fervent eiwit sondes en controles in de eerder voorbereide platen met cellen en incubeer voor 1 h bij 4 °C. Na 1 uur binden draait u de plaat 5 min op 400 x g.
6. Verwijder de supernatant en voeg 200 μL wasbuffer toe (d.w.z. PBS/1% BSA). Meng goed door pipetting op en neer.
7. Pellet de cellen door centrifugatie op 400 x g gedurende 5 min. Herhaal de wasstap 1x. Verwijder na twee wasbeurten de supernatant volledig en zet de celpellet opnieuw op in 100 μL PBS.
8. Analyseer de cellen op stroom cytometrie. Gebruik de geelgroene laser (d.w.z. 561 nm) om PE-fluorescentie op te sporen.
   1. Analyseer eerst de cellen die zijn gekleurd met de controlesonde. Op basis van de verdeling van PE fluorescentie, teken een poort voor bindende bevolking zodanig dat niet meer dan 1% van de controlecel valt in deze poort.
   2. Analyseer het monster en bepaal de fractie van cellen die in de bindingspoort valt.
      OPMERKING: Cellijnen die een hogere bindingspopulatie weergeven, zijn gewenst voor genetische schermen, omdat ze een hogere signaal-ruisverhouding hebben. Idealiter zou meer dan 80% van de cellen binnen deze poort moeten vallen.

4. Het bepalen van bindende bijdragen van warmtelabiele epitopen en heparan sulfaat sidechains

OPMERKING: De activiteit van veel eiwitten is warmtelabiel, dus verlies van bindende activiteit na warmtebehandeling is bemoedigend. Het wordt aangeraden om de bijdrage te bepalen van negatief geladen glycosaminoglycanen, voornamelijk heparan sulfaat (GS), bij het bemiddelen van de binding van de recombinante eiwitten. Dit komt omdat de binding door GS in de hier beschreven celbindingstest eerder additief kan zijn dan afhankelijk van andere receptoren¹⁹. Dit betekent dat de waargenomen binding volledig kan worden bemiddeld door GS-zijketens van celoppervlakproteoglycanen en niet door een specifieke receptor. Binding aan GS op het celoppervlak is niet noodzakelijkerwijs niet-specifiek, maar eerder een eigenschap van een eiwit, wat handig is om te weten voordat u een volledig genetisch scherm uitvoert.

1. Bereid warmtebehandelde eiwitmonsters voor in bindende tests.
   1. Verhit het genormaliseerde maar ongeconjugeerde monomeereiwit gedurende 10 minuten bij 80 °C.
   2. Verenig het warmtebehandelde eiwit tot streptavidin-PE, uitgaande van dezelfde vervoegingsverhouding als de onbehandelde tegenhanger zoals bepaald door ELISA (zie punt 2).
2. Bereid heparine verstopte eiwitmonsters voor.
   1. Bereid acht 1:3 verdunningen oplosbare heparine in PBS voor met een startconcentratie van 2 mg/mL en het uiteindelijke volume van 100 μL.
   2. Incubeer 100 μL bereide bindingssondes in de heparineverdunningen gedurende ten minste 30 min.
3. Gebruik warmtebehandeld eiwit en het volledige 200 μL heparine/eiwitmengsel in de in punt 3 beschreven bindende tests. Representatieve resultaten zijn opgenomen in figuur 3A,B.

5. Selectie van cellijnen die Cas9 stabiel uitdrukken

OPMERKING: Voordat de cellijn die de sonde van belang bindt kan worden gebruikt in CRISPR-screening, moet het eerst worden ontworpen om de Cas9 nuclease en een zeer actieve kloon geselecteerd¹⁹uit te drukken.

1. Gebruik het volgende algemene lentivirusproductieprotocol om lentivirus te produceren met behulp van de lentivirale constructie voor Cas9-expressie (zie tabel 1).
   1. Cultuur HEK293-FT cellen in DMEM/10% FBS media bij 37 °C en 5% CO₂. Zaad HEK293-FT cellen 1 dag voorafgaand aan de transfectie, zodat ze ~ 80% confluent op de dag van de transfectie.
      OPMERKING: HEK293FT cellen zijn losjes aanhangend; daarom, wanneer ze worden gebruikt voor de productie van lentivirussen, overwegen ze te beplating op kweekkolven bedekt met 0,1% (w / v) gelatine om de hechting te verhogen.
   2. Voer transfecties uit in de ochtend. Voeg transfervector, verpakkingsmix en transfectiereagens toe aan vooraf opgewarmde transfectie compatibele media (bijvoorbeeld Opti-MEM). Meng door de buis 10-15x om te keren. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Raadpleeg tabel 3 voor exacte volumes.
   3. Voeg het transfectiereagens op, zoals voorgesteld door de fabrikant. Meng door snelle vortexing. Incubeer voor 30 minuten bij RT.
   4. Zeer zorgvuldig aspirate het gebruikte medium. Voeg transfectie compatibele media toe aan de plaat.
   5. Voeg de transfectie reagens / DNA complexen dropwise op de zijkant van de plaat en langzaam verspreid door de plaat door te wervelen zeer voorzichtig.
   6. Incubeer bij 37 °C voor 3-5 h en vervang het medium door D10 medium. Incubeer 's nachts.
   7. Vervang de volgende dag in de ochtend het medium door een fris D10-medium. Incubeer 's nachts.
   8. De volgende dag laat in de middag, het verzamelen van de virale supernatant. Filter met een filter van 0,45 μm met eiwitarme binding. Voeg optioneel vers D10-medium toe, broed 's nachts in en herinner de supernatant de volgende dag.
   9. Virussupernatants zijn stabiel bij 4 °C voor slechts voor een paar dagen. Bewaar bij -80 °C voor langdurige opslag.
      OPMERKING: Om een sterk geconcentreerd lentivirale preparaat te genereren, wat wenselijk zou kunnen zijn voor de transductie van moeilijk te transduceren cellen, kunnen supernatants ook worden geconcentreerd door centrifugatie bij 6.000 x g 's nachts bij 4 °C. Markeer de doorschijnende virale pellet met een ethanolbestendige pen en gooi de supernatant weg. Resuspend de pellet in 1/100e van het oorspronkelijke volume voor een 100x toename van de concentratie.
2. Transduceren van de cellen met lentivirussen.
   1. Plaat 1 x 10⁶ cellen per put in een 6 putplaat met 3 mL van geschikte kweekmedia. Sommige cellen worden gemakkelijker getransduceerd dan andere. Voor het eenvoudig om cellen (bijvoorbeeld HEK-cellen) te transduceren, voegt u het lentivirus rechtstreeks toe aan de cellen. Voor moeilijk om cellen te transduceren, kan het nodig zijn om een spinoculatieprotocol te volgen zoals hieronder beschreven.
      1. Aliquot 2 mL van 2-5 x 10⁶ cellen/mL in een 15 mL conische buis.
      2. Voeg lentivirus samen met 8 μg/mL hexadimethrine bromide en incbaat bij RT gedurende 30 minuten.
      3. Centrifuge gedurende 100 min bij 800 x g bij 32 °C. Vervolgens resuspended de cellen in dezelfde media en voeg de cel suspensie in de juiste cultuur kolven met de juiste media.
   2. Laat transducties voor ten minste 24 uur. Verwijder daarna de media die het virus bevatten en voeg vers medium toe.
   3. Na nog eens 24 uur, verander de media naar een die wordt aangevuld met de juiste antibiotica. De Cas9 constructie bevat een blasticidin weerstand cassette voor selectie.
      OPMERKING: De hoeveelheid blasticidin moet worden geoptimaliseerd voor elke cellijn door het uitvoeren van een dosis respons kill curve. Een blasticidinconcentratie tussen 2,5-50 μg/mL moet de meeste niet-getransduceerde cellijnen binnen 10 dagen na transductie doden.
3. Voer selectie uit totdat alle cellen in de controleplaat (d.w.z. niet-getransduceerde cellen die zijn behandeld met dezelfde concentratie van selectieantibiotica) worden gedood.

6. Het selecteren van hoge Cas9-activiteit klonen

OPMERKING: Polyklonale Cas9 kan worden gebruikt om met succes genetische schermen uit te voeren; echter, het selecteren van een kloon met een hoge Cas9 activiteit verbetert de screening resultaten¹⁸.

1. Gebruik beperkende verdunning of eencellige sorteer individuele blasticidin-resistente cellen in putten van drie 96 put platen met kweekmedia aangevuld met blasticidin. Klonen zullen beginnen te ontstaan tussen 2-4 weken. Selecteer 10-20 klonen en uit te breiden in 6 goed platen.
2. Test de klonen voor Cas9 activiteit met behulp van de quick-to-assess GFP-BFP (groene fluorescerende eiwit-blauwe fluorescente eiwit) systeem, dat gebruik maakt van een exogene gen knock-out systeem waarin cellen worden doorgegeven, hetzij met een constructie uitdrukken GFP met een gRNA-targeting GFP of een lege gRNA als een controle¹⁸.
   1. Bestel verslaggever plasmids: GFP-BFP plasmid, Control-BFP plasmid (Tabel 1).
   2. Produceren lentivirus voor zowel de GFP-BFP plasmid en Control-BFP plasmid met behulp van het lentivirus productieprotocol beschreven in punt 5.1.
   3. Transduce elke Cas9-expressing cel lijn kloon met het lentivirus codering van de GFP-BFP systeem en Control-BFP afzonderlijk. Volg het protocol in punt 5.2.
   4. Na 3 dagen van transductie, onderzoeken de GFP-BFP fluorescentie van elke kloon met behulp van stroom cytometrie. Gebruik respectievelijk 488 nm laser en 405 nm laser om GFP en BFP te detecteren.
   5. Kwantificeren van de Cas9 activiteit in elke kloon door het onderzoeken van de verhouding van BFP alleen aan GFP-BFP-dubbele positieve cellen. Hoge activiteit Cas9 cellen moeten idealiter >95% GFP knock-out efficiëntie (figuur 4).

7. Generatie van genoom-brede CRISPR-Cas9 screening knock-out bibliotheek

1. Voor de genoom-brede screening met behulp van de Human V1 bibliotheek¹⁸, bestel het genoom-brede bibliotheek (zie tabel 1) en bereid de plasmid bibliotheek van de bacteriële steek met behulp van het protocol onder "Protocollen voor Bibliotheek Replicatie" in de handleiding van de fabrikant.
2. Gebruik de genoombrede bibliotheekplasmidepreparaat om een lentivirale bibliotheek te produceren die gRNAs codeerde voor gerichte verstoring van menselijke genen met behulp van het lentivirusproductieprotocol beschreven in punt 5.1.
   OPMERKING: Een goede praktijk is het produceren van een enkele batch van lentivirale voorbereiding die is geoptimaliseerd voor transductie om de experimentele consistentie te verbeteren.
3. Gebruik het transductieprotocol in sectie 5.2 om kleinschalige testtransducties uit te voeren om de vereiste hoeveelheid virus voor elke cellijn te bepalen om 30% transductie te bereiken. Gebruik stroomcytometrie om BFP-fluorescentie te beoordelen als een proxy voor transductie-efficiëntie.
4. Om HEK293 cellen te herleiden, voeg je gewoon de vooraf bepaalde lentivirale voorbereiding toe aan 30-50 x 10⁶ cellen gekweekt in normale groeimedia voor ~ 4 uur. Verwijder vervolgens de media met lentivirus en vervang deze door verse groeimedia.
5. Voor andere cellijnen gebruikt u het spinoculatieprotocol in sectie 5.2.1, maar op een grotere schaal, zodat in totaal 30-50 x 10⁶ cellen worden omgezet. Hiervoor, aliquot 2 mL van 5 x 10⁶ cellen /mL in een 15 mL conische buis en ga zoals aangegeven.
6. Selecteer voor aanhangende cellijnen getransduceerde cellen door puromycine 24 uur na transductie toe te voegen.
   OPMERKING: Optimaliseer puromycineconcentraties door een dosisrespons kill curve uit te voeren. Normaal gesproken moeten concentraties tussen 1-10 μg/mL niet-getransduceerde cellen binnen 3-5 dagen doden. Vermijd het gebruik van hogere concentraties puromycine, omdat dit de kans op het selecteren van cellen die zijn omgezet door meer dan onesingle gids RNA (sgRNA) kan verhogen.
7. Voor suspensiecellen worden oogsttransducende cellen (d.w.z. BFP-positieve) cellen 3 dagen na de transmissie met behulp van een celsorteerder en bibliotheken gegenereerd die ten minste 10 x 10⁶ cellen bevatten. Eenmaal geselecteerd met behulp van BFP, groeien de cellen in de media aangevuld met de juiste hoeveelheid puromycine.
   OPMERKING: Vermijd selecties alleen met puromycine voor suspensiecellijnen, omdat het moeilijk is om dode cellen en puin te verwijderen uit suspensiecelculturen die het sorteren van cellen kunnen verstoren.
8. Cultuur mutant bibliotheek voor 9-16 dagen natransductie met regelmatige passage elke 2-3 dagen.

8. Genetische screening op celoppervlakbinding

1. Pellet de mutantcelbibliotheek op 200 x g gedurende 5 minuten en resuspend de cellen in PBS.
2. Verdeel de cellen in twee 15 mL conische buizen met ten minste 50 x 10⁶ cellen in elke buis.
3. Draai een conische buis op 200 x g gedurende 5 minuten, verwijder de supernatant en vries de celpellet op -20 °C. Dit is de controle bevolking en zal later worden verwerkt.
4. Resuspend de pellet in de andere buis in 10 mL PBS/1% BSA. Zet 100 μL cellen opzij als negatieve controle op een 96 putplaat.
5. Voeg de juiste preconjugated recombinant eiwit aan de cel suspensie in de conische buis en negatieve controle eiwitten aan de 96 put plaat.
6. Voer celvlekken uit voor ten minste 1 uur bij 4 °C op een benchtop rotor met zachte rotatie (6 rpm).
7. Pellet de cellen op 200 x g gedurende 5 min, verwijder de supernatant. Voer twee wasstappen uit en zet de cellen opnieuw op in 5 mL PBS.
8. Zeef de cellen al een 30 μm celzeef om celclusters te verwijderen. Analyseer met behulp van een stroomsorteerder.
9. Gebruik het negatieve controlemonster naar gate voor BFP+/PE-cellen.
10. Sorteer het monster en verzamel de BFP+/PE-cellen. De soort poorten zal afhangen van de binding van de cellen aan het eiwit, maar is normaal gesproken 1-5% van de PE negatieve monsters worden verzameld. Een voorbeeld van een sorteerpoort is opgenomen in aanvullende figuur 1.
11. Verzamel 500.000-1.000.000 cellen uit de geselecteerde poort. Gezien het lage aantal cellen, overweeg dan het verzamelen van de monsters in een 1,5 mL centrifugatie buis om verliezen te minimaliseren.
12. Pellet de gesorteerde cellen door centrifugeren op 500 x g gedurende 5 min. Verwijder voorzichtig de supernatant en gooi. Het is mogelijk om de pellet maximaal 6 maanden op -20 °C te bewaren.

9. Genomische DNA-extractie en eerste PCR voor gRNA-verrijking

1. Haal genomisch DNA uit een hoge complexiteit controle bevolking.
   1. Als de controlepopulatie bij -20 °C bevroren was, haal dan de conische buis eruit en voeg PBS toe. Blijf op ijs om de pellet te ontdooien.
   2. Gebruik een commerciële kit (zie tabel van materialen)met behulp van de aanbevelingen van de fabrikant om genomisch DNA te extraheren uit 50 x 10⁶ cellen. Pas de DNA-concentratie aan op 1 mg/mL.
   3. Stel voor elk monster een mastermix voor PCR in die overeenkomt met 72 μg DNA. Aliquot 50 μL per put in 36 putten van een 96 put PCR plaat. De benodigde primersequenties zijn opgenomen in tabel 4. Gebruik de gids in tabel 5 en 6.
   4. Los 5 μL van de PCR op uit 6-12 representatieve monsters op een agarosegel van 2% (w/v). Een enkele duidelijke band op ~ 250 bp moet worden waargenomen. Als de banden zwak zijn, herhaalt u de PCR voor een extra 2-3 cycli.
   5. Gebruik een multichannel pipet om 5 μL PCR-producten van elke put te verzamelen (180 μL in totaal) en ze te bundelen in een reservoir met 900 μL bindingsbuffer uit een commerciële kit (zie Tabel van Materialen).
   6. Zuiver de PCR-producten met behulp van een commerciële PCR-zuiveringskit. Elute DNA in 50 μL elution buffer van een commerciële kit (zie Tabel van Materialen)en meet de DNA-concentratie.
2. Monsters die zijn gesorteerd op het verlies van bindend fenotype zullen waarschijnlijk niet uit een groot aantal onafhankelijke klonen bestaan. Daarom is het niet nodig om PCR uit te voeren met 72 μg DNA. Isoleer het DNA met behulp vaneen geschikte commerciële kit (zie Tabel van materialen ). Stel 3-4 PCR-reacties in met behulp van het eerder beschreven protocol (punt 9.1.3) met 100 ng/μL DNA. Als het gesorteerde celnummer minder dan 100.000 gebruik is, gebruiken ze cellysates in plaats van genomische DNA-preparaten.
   1. Aliquot ongeveer 10.000 cellen/ goed in een 96 goed PCR plaat.
   2. Pellet de cellen in de plaat en verwijder voorzichtig het grootste deel van de supernatant. De pellet zal niet zichtbaar zijn.
   3. Voeg 25 μL water in elke put toe en verwarm de monsters op 95 °C gedurende 10 minuten.
   4. Voeg 5 μL van 2 mg/mL vers verdunde proteinase K toe aan elke put gedurende 1 uur en incubeer bij 56 °C. Verwarm vervolgens het monster 10 minuten bij 95 °C om de proteinase K te inactiveren.
   5. Gebruik 10 μL cellysaatmengsel per PCR-reactie. Lysates moet binnen 24 uur worden gebruikt.

10. Tweede ronde van PCR voor indexbarcoding en sequencing

1. Verdun de producten van de eerste ronde PCR tot 40 pg/μL.
2. Eén PCR per voorbeeld instellen (gebruik de handleiding in de tabellen 7 en 8). Het gebruik van een high-fidelity polymerase is belangrijk om fouten die door de polymerase tijdens sgRNA versterking worden geïntroduceerd te minimaliseren.
3. Los 5 μL PCR-producten op op een agarosegel van 2% (w/v). Een enkele duidelijke band op ~ 330 bps moet worden waargenomen.
4. Zuiver PCR-producten met behulp van paramagnetische kralen door 31,5 μL (0,7x totaal volume) van geresuspended kralen toe te voegen aan de PCR-producten, goed te mengen en gedurende 5 minuten in RT uit te broeden.
5. Plaats de buis 3 min op een magnetisch rek. De kralen moeten worden opgevangen aan de zijkant van de plaat en de oplossing moet duidelijk zijn. Verwijder en gooi de supernatant voorzichtig weg.
6. Voeg 150 μl van 80% vers bereide ethanol toe aan de buis. Incubeer voor 30 s, en verwijder dan voorzichtig en gooi de supernatant.
7. Herhaal stap 13.6, dit keer met 180 μL. Dan drogen de kralen 5 min in de lucht.
8. Haal de buis uit de magneet. Elute DNA-doel van kralen in 35 μL steriele EB-buffer. Incubeer gedurende 3 min, dan zet de buis terug in het magnetische rek voor 3 min.
9. Breng ongeveer 30 μL van het supernatant met de eluted PCR-producten over naar een schone buis.
10. Sequence de monsters op een next-generation sequencing platform. Gebruik voor de HumanV1 gRNA-bibliotheek de aangepaste primer in tabel 4 om 19 bp te rangsqueren.

11. Bio-informatica analyse om de receptor en aanverwante trajecten te identificeren

1. Kaartsequenties van gesorteerde en ongesorteerde populatie naar de referentiebibliotheek met behulp van de telfunctie van MAGeCK. De functie levert een onbewerkt tellingsbestand op(Aanvullende tabel 1).
   OPMERKING: Gedetailleerde instructies over de installatie van MAGeCK en het gebruik van verschillende functies binnen MAGeCK worden beschreven in een eerder gepubliceerd protocol door Wang et al.²⁰.
2. Controleer de technische standaard van de besturingselementbibliotheek die in het scherm wordt gebruikt.
   1. Mediaan normaliseren van de ruwe tellingen en gebruik het ggplot2-pakket in R²¹ of gelijkwaardige software om een empirische cumulatieve dichtheidsfunctieplot van de tellingen in plasmid plot en ongesorteerde monsters te controleren(figuur 5A).
   2. Voer de -testfunctie van MAGeCK uit met tellingen van plasmidepopulatie als "controle" en de tellingen van ongesorteerde controlemonsters als het "test"-monster. De functie levert een gensamenvattingsbestand op(aanvullende tabel 1).
   3. Open het gensamenvattingsbestand en teken de verdeling van log-fold-changes(neg|lfc-kolom) voor eerder gecategoriseerde essentiële en niet-essentiële genen²² (figuur 5B).
   4. Selecteer aanzienlijk uitgeputte genen(neg|fdr < 0,05) en voer trajectverrijkingsanalyse uit met behulp van het enrichr^23-pakket of een gelijkwaardige trajectverrijkingspakketten in R (figuur 5C).
3. Voer de -testfunctie van MAGeCK uit met standaardinstelling. Gebruik ruwe tellingen van ongesorteerd controlemonster als "controle" en telt uit gesorteerd monster als "behandeling" bij het uitvoeren van de analyse.
4. Open het genoverzichtsbestand dat door MAGeCK wordt gegenereerd en rangschik de pos|rank kolom in oplopende volgorde. Gebruik FDR (pos|fdr column) < 0,05 als cutoff voor de identificatie van hits. De receptor wordt meestal hoog gerangschikt, vaak in de eerste positie.
5. Plot de Robust-Ranking-Algorithm (RRA) scores voor positieve selectie(pos|score) in R of een gelijkwaardige software(figuur 5D).
6. Selecteer de genhits en voer trajectverrijkingsanalyse uit met behulp van het verrijkingspakket of een gelijkwaardige padverrijkingspakketten in R om de verrijkte trajecten te identificeren.

Resultaten

Er worden sequencinggegevens verstrekt van twee representatieve knock-outschermen op genoomschaal voor de identificatie van de bindende partner van menselijke TNFSF9 en P. falciparum RH5 uitgevoerd in respectievelijk NCI-SNU-1- en HEK293-cellen (aanvullende tabel 1). Het bindende gedrag van RH5 werd beïnvloed door zowel heparan sulfaat als de bekende receptor BSG²⁴ (Figuur 3C),terwijl TNFRSF9 specifiek gebonden aan de bekende receptor TNFSF9 en verloor niet binding bij preincubatie met oplosbare heparine. Eiwit 3 in figuur 3B vertegenwoordigt TNFRSF9.

Voor beide cellijnen wordt ook de verdeling van gRNA's in de control mutant library na 3 dagen (9, 14 en 16 dagen na de transmissie) verstrekt (Aanvullende tabel 1). Uit de gRNA-distributie bleek dat de complexiteit van de bibliotheek in de loop van het experiment werd gehandhaafd (figuur 5A). Het genetische scherm voor de identificatie van de ligand voor TNFSF9 werd uitgevoerd op dag 14 na de transmissie, terwijl dat voor RH5 werd uitgevoerd dag 9 na de transmissie. De technische kwaliteit van de schermen werd beoordeeld door de verdeling van de waargenomen vouwveranderingen van gRNAs gericht op een referentieset van niet-essentiële genen te onderzoeken in vergelijking met de verdeling voor referentieset van essentiële genen²² (figuur 5B). Bovendien bleek ook dat de verwachte essentiële trajecten werden geïdentificeerd en aanzienlijk verrijkt in de "drop-out"-populatie bij het vergelijken van het controlemonster met de oorspronkelijke plasmidbibliotheek. Een voorbeeld met dag 14 NCI-SNU-1 monster is afgebeeld in figuur 5C.

De verdeling van de gRNAs in de controle versus gesorteerde populatie met behulp van de -testfunctie van MAGeCK (zie Aanvullende tabel 1 voor de gensamenvattingsoutput van MAGeCK) werd gebruikt om de receptor van de fenotypische schermen te identificeren. De gewijzigde RRA-score die MAGeCK in de gen-niveauanalyse heeft gerapporteerd, wordt gecompploiteerd tegen de genen gerangschikt op p-waarden. De RRA-score in MAGeCK biedt een maatstaf waarbij gRNA's consistent hoger worden gerangschikt dan verwacht. In het scherm voor TNFRSF9, de top hit was TNFSF9, dat is een bekende binding partner van TNFRSF9 (Figuur 5D). Daarnaast werden ook een aantal genen met betrekking tot het TP53-traject geïdentificeerd. In het geval van RH5 werd naast de bekende receptor(BSG) en het gen dat nodig is voor de productie van de sulfated GAGs (SLC35B2),ook een aanvullend gen (SLC16A1) geïdentificeerd (figuur 5E). SLC16A1 is een chaperonne die nodig is voor de handel in BSG naar het oppervlak van cellen²⁵. Samen tonen deze resultaten het vermogen van het scherm aan om direct interagerende receptoren te identificeren en de cellulaire componenten die nodig zijn om die receptor in een functionele vorm uit te laten worden uitgedrukt op het oppervlak van de cellen.

Figuur 1: Overzicht van de genetische screeningsbenadering om celoppervlaktereceptoren te identificeren. Deze test bestaat uit drie belangrijke stappen: Ten eerste worden recombinante eiwitten die het ectodomein van celoppervlakreceptoren vertegenwoordigen uitgedrukt in een cellijn die structureel kritische posttranslationele wijzigingen zoals HEK293-cellen kan toevoegen. Monomeric eiwit ectodomains worden oligomerized door vervoeging aan streptavidin-PE om hun bindende heid te verhogen. Ten tweede worden deze enthousiaste sondes gebruikt in cellulaire bindingstesten waarbij heldere kleuring op de cellijnen die worden aangegeven door een prominente verschuiving in PE-fluorescentie (in het groen) in vergelijking met een negatief controle-eiwit (in het zwart) de aanwezigheid van een celoppervlakbindepartner aantoont. Ten derde worden receptorpositieve Cas9-uitdrukkende cellijnen geselecteerd en genoomonderzoek met behulp van gRNAs gericht op de overgrote meerderheid van de eiwitcoderende genen wordt uitgevoerd. Tijdens het genereren van mutantbibliotheken is het gebruikelijk om 30% transductie-efficiëntie te gebruiken, wat is gebaseerd op de Poisson-distributiewaarschijnlijkheid die ervoor zorgt dat elke cel een enkele gRNA ontvangt, zodat het resulterende fenotype wordt toegeschreven aan een specifieke knock-out. De BFP-markering, uitgedrukt door de getransduceerde cellen, wordt gebruikt om cellen te selecteren die gRNAs bevatten met behulp van FACS. Fenotypische schermen worden uitgevoerd tussen 9-16 dagen na de transmissie. Op de dag van het scherm is de totale mutantcelpopulatie verdeeld in twee. De ene helft wordt bewaard als controlepopulatie en de andere helft wordt geselecteerd voor recombinante eiwitbinding. De cellen uit de gemuteerde bibliotheek die niet meer in staat zijn om het recombinant eiwit te binden, worden gesorteerd met behulp van FACS en de verrijking van gRNAs in de gesorteerde versus controlepopulatie wordt gebruikt om genen te identificeren die nodig zijn voor celoppervlakbinding van de gelabelde eg-sonde. Stappen in het protocol die veel tijd vergen, worden aangegeven. Dit cijfer is gewijzigd van Sharma et al.¹⁹. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Vaststelling van de verhoudingen van biotinylated eiwit met streptavidin-PE met behulp van een elisa-gebaseerde methode. Een voorbeeld van streptavidin-PE vervoegingsstrategie die wordt gebruikt om een fervent sonde te genereren uit een biotinylated monomeer eiwit. Een verdunningsreeks van biotinylated monomeren werd geïncubeerd tegen een vaste concentratie streptavidin. De minimale verdunning waarbij geen overtollige biotinylated monomeren kan worden gedetecteerd, werd bepaald door ELISA. ELISA werd uitgevoerd met of zonder een reeks eiwitverdunningen met 10 ng streptavidin-PE. In aanwezigheid van streptavidin-PE werd de minimale verdunning waarbij geen signaal werd geïdentificeerd (omcirkeld zwart) en de hoeveelheid eiwit die nodig is voor de verzadiging berekend om een 10x voorraadoplossing met 4 μg/mL streptavidin-PE te genereren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Representatieve binding van eiwitten aan cellijnen. (A) Eiwitbinding aan cellijnen had een duidelijke toename van de cel-geassocieerde fluorescentie in vergelijking met het controlemonster. Warmtebehandeling (80 °C gedurende 10 min) van recombinant eiwit ingetrokken alle bindende terug naar een negatieve controle, waaruit blijkt dat het bindende gedrag afhankelijk was van correct gevouwen eiwit. (B) Verschillende klassen van eiwitbindend gedrag ten opzichte van celoppervlakken; afhankelijkheid van GAG's. Van links naar rechts kunnen de eiwitten worden ingedeeld in drie soorten: Eiwit type 1 adsorbeert alleen aan GS. Deze eiwitten verliezen hun binding na preincubatie met heparineconcentraties van meer dan 0,2 mg/mL. Eiwit type 2 bindt aan GS in aanvulling op een specifieke receptor. Deze eiwitten verliezen gedeeltelijke binding in de preblocking experimenten. Eiwit type 3 bindt GS niet. Deze eiwitten verliezen geen binding in vergelijking met ouderlijke lijnen. (C) Een voorbeeld van een eiwit (d.w.z. RH5) dat zich op een additief aan GS bindt en een specifieke receptor. Gericht op de receptor (d.w.z. BSG) of enzymen die nodig zijn voor de HS-synthese (bijvoorbeeld SLC35B2, EXTL3) vermindert de binding van RH5 aan cellen ten opzichte van controles slechts gedeeltelijk. Transduceerde polyklonale lijnen kunnen in dergelijke experimenten worden gebruikt om bindend gedrag vast te stellen. Dit cijfer is gewijzigd van Sharma et al.¹⁹. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Het selecteren van klonale cellijnen met een hoge Cas9-activiteit. Genoombewerkingsefficiëntie van zowel polyklonale als gekloonde lijnen van NCI-SNU-1-cellijnen werd beoordeeld aan de hand van het GFP-BFP-reportersysteem, waarbij cellijnen werden getransduceerd met virussen met een gRNA-targeting plasmid gecodeerde GFP of zonder (d.w.z. "leeg"). Een schema wordt afgebeeld. Flow cytometrie werd gebruikt om zowel BFP en GFP expressie te testen na transductie en in vergelijking met niet-geïnfecteerde controle. GFP-expressie werd gebruikt als proxy voor Cas9-activiteit, terwijl BFP-expressie gemarkeerd transduceerde cellen. Het profiel voor niet-geïnfecteerde en lege geïnfecteerde cellen zag er vergelijkbaar uit voor alle klonen. Representatieve profielen worden weergegeven in het linkerpaneel. Alle vijf klonen van de NCI-SNU-1 cellijn vertoonden een hoger verlies van GFP in vergelijking met de polyklonale lijn (rechterpaneel), waarbij kloon 4 de hoogste efficiëntie met de laagste vuurvaste populatie liet zien. Dit cijfer is gewijzigd van Sharma et al.¹⁹. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Representatieve resultaten van genetische schermen voor de identificatie van de partners die het celoppervlak binden. AA) Cumulatieve distributiefunctieplots die de gRNA-overvloed in de plasmidbibliotheek vergelijken met de mutantbibliotheken van HEK-293-E- en NCI-SNU-1-cellen op dag 9, 14 en 16 dagen na de transmissie. Voor een bepaald getal rapporteert de functie cumulatieve dichtheid het percentage gegevenspunten dat onder die drempelwaarde lag. De kleine verschuiving van de gemuteerde celpopulatie in vergelijking met de oorspronkelijke plasmidepopulatie vertegenwoordigt de uitputting in een subset van gRNAs in vergelijking met de plasmid bibliotheek. (B) Verdeling van log-fold veranderingen in genen die eerder zijn gecategoriseerd als essentieel (rood) of niet-essentieel (zwart) in de HEK293 en NCI-SNU-1 cellijnen. De verdeling van vouw-veranderingen voor niet-essentiële genen gecentreerd op ~ 0, terwijl dat voor essentiële genen verschoven naar links naar negatieve vouw veranderingen. (C) Aanzienlijk verrijkte trajecten in genen die uitgeput zijn in NCI-SNU-1 mutantcontrolepopulatie 14 dagen na de transmissie. Verwachte bekende cel-essentiële trajecten werden geïdentificeerd. (D) Robust Rank Algorithm (RRA)-score voor genen die zijn verrijkt in de gesorteerde cellen die de mogelijkheid hadden verloren om de TNFRSF9-sonde te binden. Genen werden gerangschikt op basis van de RRA-score. De bekende interactiepartner TNFSF9 en genen met betrekking tot de TP53-route (in rood gelabeld) werden in het scherm geïdentificeerd. (E) Rank-ordered RRA-scores voor genen die zijn geïdentificeerd uit gRNA-verrijkingsanalyse die vereist is voor RH5-binding aan HEK293-cellen (linkerpaneel). SLC35B2 en SLC16A1 werden geïdentificeerd binnen een false-discovery-rate (FDR) drempel van 5%. Twee extra genen in de HS biosyntheseroute (d.w.z. EXTL3 en NDST1)werden geïdentificeerd binnen FDR van 25%. Schematisch beeld van de algemene GAG biosynthese route met de relevante genen in kaart gebracht aan de overeenkomstige stappen (paneel 2). Genen die nodig zijn voor de inzet voor chondroitinesulfaatbiogenese (d.w.z. CSGALNACT1/2)werden niet in het scherm geïdentificeerd. Dit cijfer is gewijzigd van Sharma et al.¹⁹. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Plasmid naam	Plasmide #	Gebruiken
Eiwit expressie construct: CD200RCD4d3+4-bio-linker-his	Addgene: 36153	Productie van recombinant Protein met CD4d3+4, biotine en 6-his tags.
pMD2.G	Addgene: 12259	VSV-G envelop uiten plasmide; productie van lentivirus
psPAX2 psPAX2	Addgene: 12260	Lentivirale verpakking plasmide, productie van lentivirus
Cas9-construct: pKLV2-EF1a-Cas9Bsd-W	Addgene: 68343	Productie van constitutief uitdrukken cas9 lijn
gRNA-expressieconstructie: pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W	Addgene: 67974	CRISPR gRNA-expressievector met een verbeterde steiger en puro/BFP-markeringen
Human Improved Genome-wide Knockout CRISPR Library	Addgene: 67989	Een gRNA-bibliotheek tegen 18.010 menselijke genen, ontworpen voor gebruik in lentivirus.
GFP-BFP-constructie: pKLV2-U6gRNA5(gGFP)-PGKBFP2AGFP-W	Addgene: 67980	Cas9 activiteitsverslaggever met BFP en GFP.
Lege constructie: pKLV2-U6gRNA5(leeg)-PGKBFP2AGFP-W	Addgene: 67979	Cas9 activity reporter (control) met BFP en GFP.

Tabel 1: Plasmids gebruikt in deze aanpak.

Buffernaam	Onderdelen
HBS (10x)	1,5 M NaCl en 200 mM HEPES in MiliQ water, aanpassen aan pH 7.4
PBS (10x)	80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4 en 2,4 g KH2PO4 in MiliQ water, pas aan op pH 7.4
Natriumfosfaatbuffer (80mM voorraad)	7,1 g Na2HPO4.2H2O, 5,55 g NaH2PO4, aanpassen aan pH 7.4
Zijn zuiveringsbindingsbuffer	20 mM Natriumfosfaatbuffer, 0,5 M NaCl en 20 mM Imidazool, aanpassen aan pH 7.4
Zijn zuivering elution buffer	20 mM Natriumfosfaatbuffer, 0,5 M NaCl en 400 mM Imidazool, aanpassen aan pH 7.4
Diethanolamine buffer	10% diethanolamine en 0,5 mM MgCl2 in MiliQ-water, aanpassen aan pH 9.2:
D10	DMEM, 1% penicilline-streptomycine (100 eenheden/mL) en 10% warmte geïnactiveerd FBS

Tabel 2: Buffers die nodig zijn voor deze studie.

Onderdelen	10 cm schotel	6-well plaat
293FT-cellen	70-80% confluent	70-80% confluent
Transfectie compatibele media (Opti-MEM) (Stap 5.1.2)	3 mL	500 μL
Transfectie compatibele media (Opti-MEM) (Stap 5.1.4)	5 mL	2 mL
Lentivirale transfervector	3 μg	0,5 μg
psPax2 (zie tabel 1)	7,4 μg	1,2 μg
pMD2.G (zie tabel 1)	1,6 μg	0,25 μg
PLUS-reagens	12 μL	2 μL
Lipofectamine LTX	36 μL	6 μL
D10 (Stap 7.1.7)	5 mL	1,5 mL
D10 (Stap 7.1.8 en 7.1.10)	8 mL	2 mL

Tabel 3: Hoeveelheden en volumes reagentia voor het lentivirusverpakkingsmengsel.

Tabel 4: Primer sequenties voor het versterken van gRNA en NGS. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Reagens	Volume per reactie	Mastermix (x38)
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x	25 μL	950 μL
Primer (L1/U1) mix (10 μM per stuk)	1 μL	38 μL
Genomisch DNA (1 mg/mL)	2 μL	72 μL
H2O	22 μL	1100 μL
Totale	50 μL	1900 μL

Tabel 5: PCR voor de versterking van gRNAs uit hoge complexiteitsmonsters.

Cyclusnummer	Denature	Annealing	Extensie
1	98 °C, 30s
2-24	98 °C, 10 s	61 °C, 15 s	72 °C, 20s
25			72 °C, 2 min

Tabel 6: PCR-voorwaarden voor de eerste PCR.

Reagens	Volume per reactie
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	25 μL
Primer (PE1.0/index primer) mix (5 μM per stuk)	2μL
Eerste PCR-product (40 pg/μL)	5 μL
H2O	18 μL
Totale	50 μL

Tabel 7: PCR voor het indexlabelen van sgRNAs van genetische schermen.

Cyclusnummer	Denature	Annealing	Extensie
1	98 °C, 30s
2-15	98 °C, 10 s	66 °C, 15 s	72 °C, 20s
16			72 °C, 5 min

Tabel 8: PCR-voorwaarden voor tweede PCR.

Aanvullende figuur S1: Een gids voor het tekenen van poorten voor het sorteren van de niet-bindend populatie. (A) Een ideale eiwitkandidaat voor screening moet een duidelijke verschuiving van de bindingspopulatie ten opzichte van de controlepopulatie hebben en de binding moet worden gehandhaafd op cellen die geen machines hebben voor HS-biosynthese. Een heparine blokkeren experiment kan worden gebruikt in plaats van het testen op SLC35B2 gerichte cellijnen. (B) Cellen die geen oppervlaktevlekken van het eiwit ectodomain hebben, maar die BFP-fluorescentie uitdrukken uit lentivirale transductie werden verzameld. De weergegeven cellen zijn van een scherm voor de identificatie van receptor voor GABBR2²². Dit cijfer is gewijzigd van Sharma et al.¹⁹. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende figuur S2: Cell surface glycoprotein transcriptomics based PCA plot using RNA-seq data from over 1,000 cancer cell lines. Cellijnen van Cell Model Passport²⁷ werden geclusterd met K-middelen clustering volgens de FPKM-waarden van ~ 1.500 celoppervlak glycoproteïnen. Representatieve cellijnen van elk cluster worden gelabeld. Cluster 5 bestond volledig uit cellijnen van hematopoietische oorsprong (zie ook aanvullende tabel 2). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende figuur S3: Essentiality scores voor KEGG-annotatie eiwit export en N-gebonden glycosylation genen van projectscores. Aangepaste Bayes-essentialiteit scores voor ~ 330 cellijnen (kolommen, niet gelabeld) zijn uitgezet voor genen van eiwit export en N-gebonden glycosylation pathway (X-as). Scores hoger dan 0 vertegenwoordigen een aanzienlijke uitputting in de mutantpopulatie in vergelijking met de oorspronkelijke plasmide bibliotheek. De genen kunnen worden onderverdeeld in drie verschillende clusters die verschillende niveaus van essentie in de cellijnen vertegenwoordigen. Deze clustering kan worden gebruikt om de dag van het sorteren te beslissen. Als het scherm op een laat tijdstip (dag 16) wordt uitgevoerd, is het mogelijk dat genen waarvan bekend is dat ze essentieel zijn voor cellen (clusters 1 en 3) niet worden geïdentificeerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Raw count-bestanden voor en MAGeCK-software die wordt gegenereerd gene_summary bestanden met betrekking tot de representatieve genetische schermen. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Aanvullende tabel 2: Clustering van cellijnen volgens de expressie van celoppervlaktereceptoren. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Discussie

Een CRISPR-gebaseerde screeningstrategie om genen te identificeren die cellulaire componenten coderen die betrokken zijn bij cellulaire herkenning wordt beschreven. Een soortgelijke aanpak met crispr-activering biedt ook een genetisch alternatief om direct interagerende receptoren van recombinanteiwitten te identificeren zonder dat grote eiwitbibliotheken hoeven te worden gegenereerd^26. Echter, een groot voordeel van deze aanpak is dat het van toepassing is op interacties bemiddeld door oppervlaktemoleculen native weergegeven op de cel en is niet afhankelijk van de overexpressie van receptoren, die de bindende avidity van de receptor kan beïnvloeden. In tegenstelling tot andere methoden, daarom, deze techniek maakt geen veronderstellingen met betrekking tot de biochemische aard of celbiologie van de receptoren en biedt een kans om interacties bemiddeld door eiwitten die normaal gesproken moeilijk te bestuderen met behulp van biochemische benaderingen, zoals zeer grote eiwitten, of die het membraan meerdere keren doorkruisen of vormen complexen met andere eiwitten, en moleculen anders dan eiwitten zoals eiwitten zoals glycanen, glycolipids, en fosfolifoïden te bestuderen. Gezien de genoom-schaal aard van de methode, deze aanpak heeft ook het voordeel van niet alleen het identificeren van de receptor, maar ook extra cellulaire componenten die nodig zijn voor de bindende gebeurtenis, waardoor inzicht in de celbiologie van de receptor.

Een van de belangrijkste beperkingen van deze methode bij het gebruik ervan om de receptor van een weeseiwit te identificeren, is de eerste vereiste om eerst een cellijn te identificeren die zich bindt aan het eiwit. Dit is niet altijd eenvoudig en het identificeren van een cellijn die een bindend fenotype weergeeft dat ook tolerant is voor genetische schermen kan de tijdbeperkende stap zijn voor het implementeren van deze test. Sommige cellijnen hebben de neiging om te binden aan meer eiwitten dan anderen. Dit is vooral relevant voor eiwitten die GS binden, omdat deze eiwitten de neiging hebben om zich te binden aan elke cellijn die HS-zijketens weergeeft, ongeacht de oorspronkelijke bindingscontext. Daarnaast hebben we geconstateerd dat upregulatie van syndecanen (d.w.z. proteoglycanen die GS bevatten) in cellijnen leidt tot verhoogde binding van HS-bindende eiwitten²⁶. Dit kan een factor zijn om rekening mee te houden bij het selecteren van de cellijn voor screening. Echter, ook belangrijk op te merken is dat de additieve binding van GS niet interfereert met de binding aan een specifieke receptor. Dit betekent dat als binding wordt nageleefd, het mogelijk is dat het uitsluitend door GS wordt bemiddeld omdat de binding die GS in deze test bemiddeld heeft, eerder additief is dan codeafhankelijk¹⁹. In een dergelijk scenario kan de beschreven heparineblokkeringsbenadering dergelijk gedrag identificeren zonder dat u een volledig genetisch scherm hoeft uit te voeren.

Een nuttige bron voor het kiezen van cellijnen is Cell Model Passport, die genomics, transcriptomics, en cultuur conditie informatie voor ~ 1.000 kanker cellijnen²⁷bevat. Afhankelijk van de biologische context kunnen cellen worden gekozen op basis van hun expressieprofielen. Om de selectie van cellijnen te bevorderen, hebben we ~1.000 cellijnen geclusterd in Cell Model Passport volgens de expressie van ~1.500 vooraf geannoteerde menselijke celoppervlak glycoproteins²⁸ (Aanvullende figuur 2; clusterinformatie voor elke cellijn samen met groeiomstandigheden zijn opgenomen in aanvullende tabel 2). Bij het testen van de binding van een eiwit met onbekende functie, is het nuttig om een paneel van representatieve cellijnen uit elk cluster te selecteren om de kans op het bedekken van een breed scala aan receptoren te vergroten. Gezien een keuze, is het raadzaam om cellijnen die gemakkelijk te cultuur en gemakkelijk te transduceren kiezen. Aangezien deze cellijnen zullen worden gebruikt in genoom-schaal screening, is het beter dat ze gemakkelijk kunnen worden geteeld in grote hoeveelheden en zijn tolerant voor lentivirale transductie, want het is de meest voorkomende methode voor de levering van sgRNA voor CRISPR-gebaseerde genetische screening in de latere stappen.

Over het algemeen worden de fenotypeselecties in één soort uitgevoerd. Dit wordt echter bepaald door de helderheid van de gekleurde celpopulatie in vergelijking met de besturing. Iteratieve selectierondes kunnen worden aangenomen voor scenario's waarin de signaal-ruisverhouding van het gewenste fenotype laag is, of wanneer het doel van het scherm is om mutanten te identificeren die sterke fenotypes hebben. Bij het gebruik van een iteratieve selectiebenadering voor FACS-gebaseerde schermen is het belangrijk om te overwegen dat het sorteerproces celdood kan veroorzaken, voornamelijk als gevolg van de enorme kracht van de sorteerder. Zo zullen niet alle verzamelde cellen worden vertegenwoordigd in de volgende ronde van het sorteren.

De complexiteit van de bibliotheek is een zeer belangrijke factor bij het uitvoeren van succesvolle genetische schermen, vooral voor negatieve selectieschermen, omdat de mate van uitputting in deze schermen alleen kan worden bepaald door resultaten te vergelijken met wat er aanwezig was in de startbibliotheek. Voor negatieve selectieschermen is het gebruikelijk om bibliotheken met een complexiteit van 500-1.000 x te onderhouden. Positieve selectieschermen zijn echter robuuster voor bibliotheekgroottes, omdat in dergelijke schermen naar verwachting slechts een klein aantal mutanten voor een bepaald fenotype zal worden geselecteerd. Daarom kan in het hier beschreven positieve selectiescherm de grootte van de bibliotheek worden verlaagd tot 50-100x complexiteit zonder afbreuk te doen aan de kwaliteit van het scherm. Bovendien is het in deze schermen ook mogelijk om een controlebibliotheek voor een bepaalde cellijn op een bepaalde dag te gebruiken als een "algemene controle" voor alle monsters die op de dag voor die bepaalde cellijn zijn gesorteerd. Dit vermindert het aantal controlebibliotheken dat moet worden geproduceerd en gesequenced.

Een andere belangrijke overweging voor het gebruik van deze aanpak is de beperkingen van verlies-van-functie schermen bij het identificeren van genen die essentieel zijn voor in vitro cel groei. De timing van de schermen is daarbij cruciaal, naarmate hoe langer de gemuteerde cellen in de cultuur worden gehouden, hoe groter de kans dat cellen met mutaties in essentiële genen niet levensvatbaar worden en niet langer vertegenwoordigd zijn in de gemuteerde bibliotheek. De recente genetische schermen uitgevoerd als onderdeel van het Project Score initiatief in meer dan 300 cellijnen tonen aan dat meerdere genen in de KEGG-geannoteerde eiwitafscheiding en N-glycosylation traject vaak worden geïdentificeerd als essentieel voor een aantal cellijnen (Aanvullende figuur 3)²⁹. Hiermee kan bij het ontwerpen van schermen rekening worden gehouden als het effect van genen die nodig zijn voor proliferatie en levensvatbaarheid moet worden onderzocht in het kader van het cellulaire herkenningsproces. In dit geval zou het in het algemeen passend zijn om schermen in een vroeg tijdstip uit te voeren (bijvoorbeeld dag 9 na de transmissie). Als de aanpak echter wordt gebruikt om een paar doelen met sterke grootteeffecten te identificeren in plaats van algemene cellulaire trajecten, kan het passend zijn om schermen op een later tijdstip uit te voeren (bijvoorbeeld dag 15-16 na de transmissie).

De resultaten van de screening zijn zeer robuust; in acht recombinant eiwitbindingsschermen die in het verleden werden uitgevoerd, was de celoppervlakreceptor de hoogste hit in elk geval¹⁹. Bij het gebruik van deze benadering om de interactiepartner te identificeren, moet men daarom verwachten dat de receptor en de factoren die bijdragen aan de presentatie op het oppervlak worden geïdentificeerd met een hoog statistisch vertrouwen. Zodra het scherm is uitgevoerd en een hit wordt gevalideerd met behulp van een enkele gRNA knock-out, verdere follow-ups kunnen worden uitgevoerd met behulp van bestaande biochemische methoden zoals AVEXIS⁴ en directe saturable binding van gezuiverde eiwitten met behulp van oppervlakte plasmon resonantie. De hier beschreven aanpak is toepasbaar voor alle eiwitten waarvoor het mogelijk is om een oplosbare recombinant bindingssonde te genereren.

Samengevat is dit een genoom-schaal CRISPR knock-out benadering om interacties te identificeren bemiddeld door celoppervlakte eiwitten. Deze methode is over het algemeen van toepassing om cellulaire paden te identificeren die nodig zijn voor celoppervlakkenherkenning in een breed scala van verschillende biologische contexten, waaronder tussen de eigen cellen van een organisme (bijvoorbeeld neurale en immunologische herkenning), evenals tussen gastheercellen en pathogene eiwitten. Deze methode biedt een genetisch alternatief voor biochemische benaderingen ontworpen voor receptor identificatie, en omdat het geen voorafgaande veronderstellingen met betrekking tot de biochemische aard of celbiologie van de receptoren vereist, heeft het een groot potentieel om volledig onverwachte ontdekkingen te doen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-muis alkaline fosfatase	Sigma	A4656
Blasticidin	Chem-Cruz	SC-204655
Blood & Cell Culture DNA Maxi Kit	Qiagen	13362
BSA	Sigma	A9647-100G
Diethanolamine	Sigma	398179
DMEM	Gibco	31966-021
Dneasy Blood and Tissue kit	Qiagen	69504
DynaMag-96 Side Magnet	Invitrogen	12331D
HEK293T packaging cells	ATCC	CRL-3216
Heparine	Sigma	H4784-1G
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa	KK2602
Lipofectamine LTX with PLUS reagent	Invitrogen	15338100
MoFlo XDP cell sorter	BD
Ni2+-NTA agarose beads	Jena Bioscience	AC-501-25
OPTI-MEM	Life Technologies	31985-070
OX-68 antilichaam	AbD Serotec	MCA1022R
p-nitrofenylfosfaat	Sigma	1040-506
PD-10 ontzoutingskolommen	GE healthcare	17085101
Polybreen	Millipore	TR-1003-G
Polypropyleen buizen met 5 mL bedvolume	Qiagen	34964
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Roche	3115879001
Puromycine	Gibco	A11138-03
Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix	NEB	M0494L
QIAquick PCR-zuiveringskit	Qiagen	28104
SCFA filter	Nalgene	190-2545
Sony Cell sorter	Sony
SPRI beads (Agencourt AMPure XP beads)	Beckman	A63881
Streptavidine-gecoate microtiterplaten	Nalgene	734-1284
Streptavidine-PE	Biolegend	405204