In Vitro Gerichte Evolutie van een beperking Endonuclease met strengere specificiteit

Samenvatting

De endonucleases van de beperking met nieuwe opeenvolgingsspecificiteit kunnen van enzymen worden ontwikkeld die een gedeeltelijk gedegenereerde opeenvolging erkennen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat we met succes gebruikt om de volgorde specificiteit van NlaIV enzym te veranderen. De belangrijkste ingrediënten van het protocol zijn de in vitro compartimentering van de transcriptie/vertaalreactie en selectie van varianten met nieuwe sequentiespecifiekekenmerken.

Samenvatting

Beperking endonuclease (REase) specificiteit engineering is uiterst moeilijk. Hier beschrijven we een multistep protocol dat helpt bij het produceren van REase-varianten die een strengere specificiteit hebben dan het ouderlijke enzym. Het protocol vereist de oprichting van een bibliotheek van expressie selectie cassettes (EsCs) voor varianten van de REase, idealiter met variabiliteit in posities die waarschijnlijk dna-binding beïnvloeden. De ESC wordt aan de ene kant geflankeerd door een sequentie voor de gewenste beperkingssiteactiviteit en een biotine-tag en aan de andere kant door een beperkingssite voor de ongewenste activiteit en een primerannealing-site. De SER's worden getranscribeerd en vertaald in een water-in-olie emulsie, in omstandigheden die de aanwezigheid van meer dan een DNA-molecuul per druppel onwaarschijnlijk maken. Daarom wordt het DNA in elk cassettemolecuul alleen onderworpen aan de activiteit van het vertaalde, gecodeerde enzym. REase varianten van de gewenste specificiteit verwijderen de biotine tag, maar niet de primer annealing site. Na het breken van de emulsie worden de DNA-moleculen onderworpen aan een biotine pulldown, en alleen die in de supernatant worden behouden. Deze stap zorgt ervoor dat alleen SER's voor varianten die de gewenste activiteit niet hebben verloren, behouden blijven. Deze DNA-moleculen worden vervolgens onderworpen aan een eerste PCR-reactie. Decolleté in de ongewenste volgorde snijdt de primer binding site voor een van de primers. Daarom versterkt PCR alleen SPC's van druppels zonder de ongewenste activiteit. Vervolgens wordt een tweede PCR-reactie uitgevoerd om de beperkingssite opnieuw in te voeren voor de gewenste specificiteit en de biotinetag, zodat de selectiestap kan worden herhaald. Geselecteerde open leesframes kunnen worden overuitgedrukt in bacteriële cellen die ook de cognate methyltransferase van de ouderlijke REase uitdrukken, omdat de nieuw ontwikkelde REase zich richt op slechts een subset van de methyltransferase doellocaties.

Inleiding

Sequentie specificiteit engineering is zeer uitdagend voor klasse II REases. In deze klasse van endonucleases zijn sequentieherkenning en katalyse nauw met elkaar verweven, waarschijnlijk als een evolutionaire bescherming tegen het creëren van een endonuclease van bredere specificiteit dan zijn cognate methyltransferase, die gastheer-DNA zou beschadigen. Gerichte evolutie van nieuwe bijzonderheden in cellen wordt verder bemoeilijkt door de noodzaak om gastheer-DNA te beschermen tegen de nieuw ontworpen endonuclease-activiteit. Daarom zijn er slechts een paar succesvolle pogingen van REase engineering gemeld en ze allemaal gebruik maken van de unieke kenmerken van een bepaald enzym^{1,2,3,4,5,6,7}.

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor specificiteit engineering die kan worden gebruikt om endonuclease varianten die smallere specificiteit dan een ouderlijk enzym dat is gebaseerd op onze succesvolle engineering van een NlaIV endonuclease⁸te genereren. Voor een dergelijk enzym met een willekeurige herkenningssequentie kan extra specificiteit worden ingevoerd voor basissen in de flanken. Voor ouderlijke enzymen die gedeeltelijk gedegenereerde sequenties herkennen (zoals NlaIV met zijn GGNNCC-doel), kan ook extra specificiteit worden geïntroduceerd binnen de herkenningsreeks. Aangezien extra specificiteit waarschijnlijk eiwit-DNA contacten vereist, moeten de nieuw erkende bases binnen de voetafdruk van de ouderlijke endonuclease op DNA liggen. In principe kunnen selectieschema's worden opgezet voor elke gewenste specialisatie van de herkenningsreeks. Echter, de meeste REases die palindromische en bijna palindrische doelsequenties herkennen zijn functionele dimers die slechts een halve locatie van het palindroom herkennen. Daarom is het onwaarschijnlijk dat de selectie van nieuwe specifieke kenmerken die de symmetrie van eiwitnucleïneinteracties schenden, zal werken. Voor de dimeric NlaIV, bijvoorbeeld, de GGNNCC sequentie kan theoretisch worden beperkt tot GGATCC, maar vernauwing van de specificiteit tot GGAACC zal naar verwachting moeilijker zijn. Onze regeling omvat zowel positieve als negatieve selectie.

Het proces is efficiënter wanneer negatieve selectie ook wordt gebruikt om de specificiteiten te verwijderen die in staat zijn om alle andere sequenties dan de gewenste smallere specificiteit te splijten. Selectie voor GGATCC kan bijvoorbeeld worden gecombineerd met antiselectie tegen GGBVCC (waarbij B een andere basis dan A is en V een andere basis dan T). Wanneer sommige van de mogelijke doelsequenties niet worden gedekt, hangt de uitkomst van het selectieexperiment af van de effectiviteit van positieve en negatieve selectie. In ons NlaIV-werk hebben we gekozen voor GGATCC, en tegen GGSSCC (waar S G of C is), en kregen we een specificiteit die, het negeren van symmetriebrekende doelen, kan worden omschreven als GGWWCC (waar W A of T is), wat suggereert dat in dit specifieke geval negatieve selectie meer belangrijker dan positieve selectie.

Onze aanpak begint met het maken van een expression selection cassette (ESC). Het ESC is gestructureerd in secties. Op de binnenkant kern sectie, zijn er varianten van de open leesframe (ORF) van de REase, onder T7 promotor controle. Dit kerngedeelte van de ESC mag geen cognate site bevatten voor de engineered REase. De kern is ingeklemd tussen twee cognate sites voor wild type REase: een splitsing site voor de ongewenste activiteit (teller geselecteerde volgorde, GGSSCC in dit voorbeeld) en een splitsing site voor de gewenste activiteit (geselecteerde volgorde, GGATCC in het voorbeeld). De laatste stap van de voorbereiding van de ESC in PCR voegt biotine dicht bij de gewenste activiteit aan het 5'-einde en creëert een verscheidenheid aan tegengeselecteerde sequenties (GGSSCC in het voorbeeld). De selectiestrategie is gebaseerd op het gebruik van zorgvuldig ontworpen primers in het ESC-reamplification-protocol na een in vitro transcriptie/vertaal-/selectieprotocol (figuur 1A). De ESC-bibliotheek wordt uitgedrukt in een in vitro gecompartimenteerde transcriptie vertaling water-in-olie emulsie^9,10,11. Binnen elke druppel beïnvloedt de specificiteit van het uitgedrukte enzym de toestand van de ESC (figuur 1B, stap I). Voor de beschreven regeling verwijdert de gewenste decolletéactiviteit van het vertaalde eiwit de biotinetag van het DNA, maar heeft het geen invloed op het andere ESC-einde met de door de teller geselecteerde sequentie. Wanneer de emulsie wordt verbroken, worden biotinylated fragmenten verwijderd door streptavidine affinity pulldown, zodat alleen fragmenten van druppels met de gewenste activiteit overblijven (Figuur 1B,stap II). Met deze stap worden inactieve REase-varianten verwijderd. De supernatant fractie van de pull-down stap wordt vervolgens versterkt door PCR. In de eerste PCR reactie primers F2 en R1 worden gebruikt(Figuur 1A,B, stap III). Primer F2 bindt zich aan de ESC-sectie tussen de geselecteerde volgorde en het molecuuluiteinde. Daarom worden Ser's die varianten uitdrukken die in staat zijn om de geselecteerde volgorde van de teller te splijten (en daarom de bindingsplaatsen voor primers F2 en R1 in twee verschillende DNA-moleculen te scheiden) niet versterkt en worden ze dus uit de bibliotheek verwijderd. De primer R1 bindt tussen de geselecteerde site en de kern van het ESC, zodat deze niet wordt beïnvloed door de splitsingsstatus van de geselecteerde site en de decolletésite herstelt voor de gewenste activiteit (GGATCC). De cyclus wordt afgesloten door een tweede PCR (met primers F1 en R2) die biotine toevoegt aan het 5'-uiteinde dicht bij de geselecteerde site en herstelt ontworpen variatie op de geselecteerde teller plaats dicht bij het andere uiteinde van de ESC (Figuur 1B, stap IV). Het resulterende DNA mengsel is klaar voor een nieuwe selectieronde.

Het succes van het selectieprotocol hangt sterk af van de juiste keuze van de nieuwe, strengere doelherkenningsvolgorde en van een zorgvuldig ontwerp van de mutagenesestrategie en de effectieve uitvoering ervan. Omdat het veel gemakkelijker is om te verbeteren op lichte reeds bestaande voorkeuren van de REase dan om ze te overwinnen, raden we aan om te beginnen met een kinetische studie van eventuele reeds bestaande voorkeuren. De noodzaak van zorgvuldig mutagenese ontwerp vloeit voort uit de beperkte omvang van een gemuteerde bibliotheek die kan worden verwerkt door het gepresenteerde protocol (10⁹ klonen in een enkel experiment). Daarom kunnen alle 20 mogelijke aminozuursubstituties effectief in slechts een paar posities worden getest (zie Bespreking). Willekeurige mutagenese, zoals foutgevoelige PCR (EP-PCR) gepresenteerd als een alternatieve methode, zal leiden tot diepgaande onderbemonstering van de bestaande complexiteit. Als er informatie beschikbaar is over mogelijke aminozuurposities die betrokken zijn bij contacten met DNA (of zelfs in de nabijheid van de gedegenereerde nucleotiden in een cognate sequentie) beschikbaar is, moet het zeker worden gebruikt om een paar aminozuren te selecteren voor oligonucleotide geleide verzadigingmutagenese (protocolstappen 1.6-3.10).

Protocol

1. Voorbereiding van de SER's

1. Kloonmethyltransferase van het restrictie-modificatiesysteem dat moet worden ontworpen in een laag kopieernummer plasmide (bijvoorbeeld pACYC184 of pACYC174 of derivaten daarvan).
   LET OP: De bacterieel gastheerstam moet methylatie kunnen verdragen die door het gekloonde enzym wordt geïntroduceerd en een induceerbare expressie van T7 RNA polymerase kunnen bieden. Gebruik van de ER2566 stam (met McrA, McrBC, en MRR mutaties) wordt aanbevolen.
2. Bevestig dat het recombinante plasmient-DNA wordt beschermd tegen decolleté door de cognate endonuclease door 0,5 μg plasmid-DNA te behandelen met 10 eenheden cognate REase in buffer en temperatuur aanbevolen door de enzymleverancier gedurende 2 uur.
3. Bereid competente cellen van deze stam voor.
   LET OP: Elke methode kan worden gebruikt. Het NlaIV engineering project maakte gebruik van een eenvoudige calciumchloride methode¹².
4. Bouw recombinant plasmide met de ORF voor de REase onder controle van de T7 promotor uit een andere uitsluitingsgroep en met een andere selectie marker dan degene die het methyltrasferase gen in stap 1.1. Vectoren pET28 en pET30 kunnen worden gebruikt.
5. Verwijder alle herkenningsplaatsen voor het gemanipuleerde enzym uit het gedeelte van de recombinante plasmide tussen de T7-promotor en de stopcodon van het enzym ORF door stille mutaties in te voeren (figuur 2,tabel 1A).
   OPMERKING: Als meer dan één dergelijke locatie moet worden verwijderd, zijn meerdere mutatierondes nodig (stappen 1.5.1–1.5.7).
   1. Gebruik een inside-out PCR-reactie die het plasmide over de volledige lengte versterkt met ontworpen variaties die aan de 5' uiteinden van de primers (Tabel 2A)worden geïntroduceerd.
   2. Verwijder het sjabloon-DNA door 10 U DpnI endonuclease toe te voegen aan de 50 μL van de PCR-reactie en in te broeden gedurende 2 uur bij 37 °C.
   3. Los de producten op met agarose gel elektroforese. Knip de band die overeenkomt met de volledige lengte plasmide en zuiveren met een commerciële kit.
   4. Voeg 10x ligatiebuffer (tot een 1x concentratie) toe en vul aan met ATP (tot 1 mM). Voeg 10 U van T4 polynucleotide kinase toe en incubeer gedurende 20 min bij 37 °C. Activeer het enzym door het enzym gedurende 10 min bij 70 °C te verwarmen.
   5. Voeg PEG 4000 tot 5% toe, vul opnieuw aan met ATP (tot 1 mM) en voeg 5 U van T4 DNA ligase toe. Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur (RT).
   6. Transformeer in een competente bacteriële stam die cognate methyltransferase draagt (stap 1.1).
   7. Isoleer het plasminiet-DNA op kleine schaal en bevestig de introductie van sequentieveranderingen door dideoxy sequencing.
6. Unieke beperkingsplaatsen in de buurt van de sequentie(s) die het doelwit zijn van oligonucleotide geleide mutagenese (figuur 2, tabel 1B). Volg de stappen 1.5.1–1.5.7 voor elke site.
   LET OP: Deze stap wordt alleen uitgevoerd wanneer een gerichte mutagenese wordt gebruikt. Als u willekeurige mutagenese doet, slaat u stap 2-3 over en gaat u in plaats daarvan verder met sectie 3. In het gepresenteerde voorbeeld werden alle locaties stroomopwaarts van de beoogde regio's geïntroduceerd, maar ze kunnen ook stroomafwaarts worden ingevoerd.
7. Ontwerpprimers voor de versterking van de ESC (tabel 1C).
   1. Ontwerp een omgekeerde primerbinding stroomafwaarts van de endonuclease ORF die de geselecteerde herkenningssite (R1) en de kortere versie (R2) introduceert die buiten de geselecteerde NlaIV-sequentie bindt en biotine aan het 5'-einde bevat (zie figuur 1).
   2. Ontwerp een forward primer (F1) binding aan de ESC stroomopwaarts van de T7 promotor. Deze inleiding moet ook tegengeselecteerde variant(s) van de oorspronkelijke herkenningsreeks introduceren (d.w.z. het maximum aan sequentievariaties dat door het oorspronkelijke enzym wordt herkend, met uitzondering van de geselecteerde omgekeerde sequentie).
      LET OP: Een kortere versie van deze primer (F2) die de volgorde distaal aan de tegengeselecteerde volgorde dekt zal later worden gebruikt in de selectieve PCR (stap 5.9).

2. Split-and-mix synthese van mutagene primers

LET OP: Deze stap wordt alleen gebruikt voor projecten waarvoor subverzadigingmutagenese op meer dan één locatie nodig is. Een synthesizer met meerdere synthesekolommen is vereist. Wijs kolommen toe voor synthese van gerandomiseerde NNS codon drieling en wilde type codon drieling volgens de mutagenese frequenties. Als er bijvoorbeeld zeven synthesekolommen met een gelijk volume beschikbaar zijn en een mutagenesesnelheid van 0,3 wenselijk is op een bepaalde locatie, voegt u gerandomiseerde NNS-codons toe in ~ 0,3 x 7 of twee kolommen en wilde typecodons in ~ 0,7 x 7 of vijf kolommen (figuur 3).

1. Beslis over sites voor subverzadiging mutagenese. Kies mutagenese frequenties op basis van het hypothetische belang van de sites (dat wil zeggen, hoe belangrijker de site, hoe hoger de frequentie), het houden van grenzen aan de algehele complexiteit van de bibliotheek in het achterhoofd (zie Discussie).
2. Synthetiseer oligonucleotiden in alle kolommen, tot de triplet onmiddellijk voorafgaand aan de tweede subverzadiging mutagenese site tellen van de 3'-end. Verwijder de 5'trityl beschermende groep niet bij de laatste synthesecyclus (gebruik de trityl-on optie op de synthesizer). De beschermgroep wordt aan het begin van de volgende synthesecyclus verwijderd (stap 1 in figuur 3).
3. Open de synthesekolommen. Verzamel gecontroleerde porieglas (CPG) synthese ondersteuning in een droge 1,5 mL buis en meng door vortexing. Herverdeling van de gemengde CPG hars in nieuwe synthese kolommen. Vermijd de invoering van vochtigheid, omdat het de totale opbrengst zal verminderen (stappen 2 en 4 in figuur 3).
4. Doorgaan synthese, te beginnen met de subverzadiging mutagenese site triplet. Wijs kolommen toe aan gerandomiseerde NNS-drieling of wilde typedrieling volgens de gewenste mutagenesefrequentie (zie opmerking hierboven). Als er extra subverzadigingsplaatsen aanwezig zijn, gaat u alleen verder naar de triplet voorafgaand aan de volgende subverzadigingsmutagenesesite. Nogmaals, laat een 5'trityl groep op aan het einde (5'-trityl-on optie op de synthesizer) (stap 3 in figuur 3). Ga dan verder met stap 2.3.
5. Als er niet meer subverzadiging sites aanwezig zijn stroomafwaarts, vul de synthese, waardoor een 5'trityl groep aan het einde (5'-trityl-on optie op de synthesizer) (stap 5 in figuur 3).
6. Debescherm en zuiver de oligonucleotide bibliotheek volgens de instructies van de fabrikant van de zuiveringscartridge.
   LET OP: Oligonucleotiden die vrijkomen door onteigening tegen de CPG kunnen ook worden gezuiverd in de omgekeerde fase high performance liquid chromatografie (HPLC) met trityl-on gevolgd door een handmatige trityl groep verwijdering (1 uur behandeling met 80% azijnzuur bij RT) en een tweede HPLC zuivering.
7. Controleer de kwaliteit van de oligonucleotidebibliotheek in een urerea-PAGE gel.

3. Variantbibliotheken genereren

LET OP: Gebruik de recombinante plasmide van stap 1.6.

1. Genereer de bibliotheken door oligonucleotide gerichte mutagenese.
   OPMERKING: Gebruik ook het EP-PCR-protocol (stap 3.2).
   1. Versterk een sectie van de T7-promotor tot de unieke beperkingsenzymsite die de met mutagenese gerichte sequentie flankeert (in het geval van NlaIV: SalI, EcoRI of Eco52I) (Tabel 1B-C, Tabel 2B, figuur 4). Versterk het tweede deel van de unieke beperking enzym site aan de 3 'einde van de ESC.
   2. Meng afzonderlijk 5 μL van de PCR-reacties (vanaf stap 3.1.1) met 8 μL water, 1,5 μL van 10x-beperkingsenzymbuffer en 5 eenheden van de juiste beperkingsenzymen (SalI, EcoRI of Eco52I) en incubeer bij de juiste temperatuur gedurende 2 uur.
   3. Los de producten van beide reacties op met behulp van agarose gel elektroforese. Knip de verwachte grootte banden en zuiveren met een commerciële kit.
   4. Loop tot 1/3 van de gezuiverde producten in een agarose gel en meet de concentratie van elke gezuiverde band door densitometry.
   5. Stel de ligatie van twee delen van de SER's in een 1:1 kiesverhouding met 1x ligase buffer en 1 U van T4 DNA ligase en incubeer voor 2 uur bij RT.
   6. Los de reactieproducten op in de agarosegel. Knip de verwachte grootte producten en zuiveren met een commerciële kit.
   7. Versterk de gezuiverde ligatieproducten in een PCR-reactie met primers F1 en R2(tabel 1C en tabel 2A). Voer niet meer dan 20 versterkingscycli uit.
   8. Fractioner de PCR-reacties in een agarosegel. Knip de producten uit en zuiver met een commerciële kit.
   9. Voer een 5 μL aliquot van de gezuiverde bibliotheek uit de vorige stap in de agarose gel en meet de concentratie door densitometry.
   10. Kloon een klein monster van de bibliotheek (tot 5 μL) en sequentie >15 klonen om de mutatiefrequentie en -verdeling te controleren (tabel 3). Ga naar stap 4.
       LET OP: Als alternatief kan een hoge doorvoersequencing van de kleine steekproef van de SER's worden gebruikt.
2. EP-PCR uitvoeren.
   1. Versterk de ESC uit de plasmide verkregen in stap 1.5.7 met primers F1 en R1. Voer 20 cycli uit met Taq I polymerase(tabel 1B).
   2. Gel zuivert het PCR-product.
   3. Stel EP-PCR in met 2 ng gezuiverd PCR-product uit de vorige stap en voer 15 cycli EP-PCR(Tabel 1C)uit met F1- en R1-primers.
   4. Gel zuivert het product en kwantificeert het door geldenitometry.
      LET OP: Vanwege de lage concentratie van het gezuiverde EP-PCR productgebruik ongeveer 1/3 voor kwantificering.
   5. Kloon een kleine steekproef van de bibliotheek (tot 1/5) en reeks >15 klonen om de mutatiefrequentie en -verdeling te controleren (tabel 4).
      LET OP: U ook een hoge doorvoersequencing uitvoeren van de kleine steekproef van de SER's.

4. Uitvoeren van gecompartimenteerde In Vitro Transcriptie-vertaling Reactie

1. Test endonuclease expressie en enzymatische activiteit in in vitro transcriptie-vertaling.
   1. Bereid een kort (200-500 bp) substraat voor met één herkenningsplaats voor de endonuclease die zich dicht bij het midden van het molecuul bevindt, zodat de decolletéreactie gemakkelijk kan worden gedetecteerd.
      LET OP: De eenvoudigste manier om het substraat voor te bereiden is door PCR-versterking van een geschikt fragment van elk DNA-molecuul. Het substraat kan worden gelabeld of fluorescerend gelabeld om de decolletédetectie te vereenvoudigen.
   2. Stel 50 μL van een transcriptie-vertaling reactie met 0,5 μg van wild type ESC volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Voeg magnesiumzout (MgCl₂, MgSO₄en magnesiumacetaat kan worden getest) toe aan 1,5 mM en de juiste hoeveelheid substraat uit de vorige stap (ten minste 0,5 μg in geval van ongelabeld DNA).
      LET OP: Elke transcriptie/vertaalkit die geen nuclease bevat die door magnesium wordt geactiveerd, kan worden gebruikt. Sommige kitleveranciers gebruiken nucleases om DNA-contaminatie tijdens de productie te verwijderen en vervolgens chelators toe te voegen als nuclease-remmers. Dergelijke kits zijn niet compatibel met deze methode.
   3. De transcriptie-vertaalreactie uitbroeden volgens de instructies van de fabrikant. Breng vervolgens het reactiemengsel gedurende 2 uur over op de optimale temperatuur voor het beperkingsenzym.
   4. Het decolleté van het substraat in een agarosegel analyseren, gevolgd door passende detectie (bijvoorbeeld DNA-kleuring, fluorescentievisualisatie of autoradiografie) (Figuur 5).
      LET OP: Ten minste gedeeltelijke decolleté van het substraat is noodzakelijk alvorens verder te gaan met de compartimentering. Als dit niet wordt bereikt, is verdere optimalisatie van de magnesiumchemische vorm of de concentratie ervan noodzakelijk.
2. Bereid een olie-oppervlakteactieve mengsel door 225 μL span 80 en 25 μL Tween 80 tot 5 mL minerale olie toe te voegen in een conische buis van 15 mL. Meng grondig door de buis 15x zacht om te keren.
3. Breng voor elke bibliotheek 950 μL van het olie-oppervlakteactieve mengsel over naar een 2 mL ronde cryogene flacon, label met een bibliotheeknaam en overdracht naar ijs. Doe een kleine cilindrische roerstaaf (5 x 2 mm²⁾in elke flacon.
4. Bereid een in vitro transcriptie-vertaling reactiemengsel (50 μL voor elke bibliotheek) volgens de suggesties van de fabrikant. Vul het mengsel aan met magnesiumchloride tot een eindconcentratie van 1,5 mM (zie stap 4.1.4).
5. Geef 50 μL aliquots in 1,5 mL buizen op ijs.
6. Voeg 1,7 fmole van de bibliotheek (vanaf sectie 3) toe aan het reactiemengsel op ijs.
   LET OP: Gebruik geen hogere hoeveelheid expressiebibliotheek voor selectie-efficiëntie. Het is van cruciaal belang om de frequentie van waterige druppels met meer dan één DNA-molecuul te minimaliseren.
7. Bereid water-in-olie emulsie achtereenvolgens voor elke bibliotheek.
   1. Zet een kleine beker (of grote fles beker) gevuld met ijs op een magnetische roerr met de roersnelheid ingesteld op 1.150 rpm.
   2. Breng een cryogene flacon met 950 μL olie-oppervlakteactieve mengsel en een kleine roerstaaf van stap 4.3 over naar een ijskoud bekerglas op de magneetroerer. Controleer of de roerstaaf draait.
   3. Voeg vijf 10 μL aliquots van de in vitro bibliotheek-transcriptie-vertaling mengsel over een periode van 2 min in 30 s intervallen en blijven roeren voor een extra minuut. Breng de flacon met de emulsie over in een ijscontainer. Ga verder met de volgende bibliotheek vanaf stap 4.7.2.
   4. Immers de bibliotheken zijn verwerkt start de incubatie van alle bibliotheken volgens de aanbevelingen van de kit fabrikant.
8. Breng de flacons op de optimale temperatuur voor de ontworpen endonuclease voor een extra 2 uur en zet ze vervolgens op ijs voor ten minste 10 min.

5. Verdere verwerking van bibliotheken en selectie

1. Breng de emulsies van de cryogene flacons over in koude buizen van 1,5 mL, voeg 1 μL van 0,5 M EDTA toe en centrifugeer ze op 13.000 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
2. Verwijder de bovenste oliefase met een pipet. Als een olie-water interfase niet zichtbaar is, de buis gedurende ten minste 5 min in -20 °C uitbroeden om de waterige fase te bevriezen, pijp dan onmiddellijk de vloeibare oliefase uit.
3. Voeg 100 μL van 10 mM Tris HCl pH 8.0 toe en voer onmiddellijk extractie uit met 150 μL fenol:chloroform (1:1 v/v) door korte vortexing gevolgd door fasescheiding door 30 s centrifugatie bij 13.000 x g. Verzamel de bovenste waterige fase.
4. Precipitate het DNA neer door 0,1 vol (15 μL) van 3 M natriumacetaat (pH = 5,2), 2,5-5 μg glycogeen en 2,5 vol (375 μL) ethanol toe te voegen. Incubeer bij -20 °C gedurende 1 uur en centrifugeer gedurende 15 min bij 13.000 x g, 4 °C. Gooi de supernatant weg en was de pellet kort met 1 mL koude 70% ethanol.
5. Droog de DNA/glycogeenpellet in een speedvac of luchtdroog voor >5 min.
6. Los de pellet op in 50 μL van 10 mM Tris-HCl (pH = 7,5). Voeg 5 μL streptavidinmagnetische kralen bereid volgens de instructies van de fabrikant toe en meng gedurende 1 uur bij RT, bij voorkeur in een carrouselmixer of door zachte vortexing.
7. Scheid de kralen op een magnetische standaard en verzamel de vloeistof verrijkt met DNA zonder biotine.
8. Concentraat het DNA door ethanolneerslag (stappen 5.4–5.5).
9. Los het geconcentreerde DNA van de vorige stap op in 5 μL water en gebruik als sjabloon in een PCR-reactie met F2- en R1-primers(tabel 1A).
   LET OP: Om problemen met sjabloonverontreiniging te voorkomen en PCR-artefacten te minimaliseren, gebruikt u Taq polymerase (niet Pfu of Phusion) en voert u 18-20 cycli uit met de verlengingstijd die evenredig is aan de sjabloongrootte (1 kb = 1 min) (zie tabel 2B).
10. Fractioneer het PCR-product in een agarosegel en knip het verwachte formaatproduct uit. Sommige uitstrijkjes geven aan dat er producten van verschillende grootte zijn (zie figuur 6). Zuiver het DNA van de gelplaat met een commerciële kit.
11. Voer een tweede PCR-reactie uit met maximaal 50 ng DNA van stap 5.10 en primers F1 en R2 met hetzelfde protocol als in stap 5.9. Ga verder met productzuivering zoals beschreven in 5.10. Gezuiverd DNA na kwantificering door agarose gel densitometry (niet UV-spectroscopie) kan worden gebruikt in de volgende ronde van in vitro selectie (stap 4.6).

6. Schermvarianten voor gewijzigde reeksspecificiteit

1. Geselecteerde varianten klonen.
   1. Vergiet het product vanaf stap 5.10 tot 2 uur met 10 U van beperkingsenzymen die geschikt zijn voor het klonen van de ORF in de expressievector (voor NlaIV: NcoI en XhoI) in de door de enzymverkoper aanbevolen temperatuur en buffer. Los de producten op met agarosegelelektroforese en isoleer het verwachte groottefragment.
   2. Bereid de plasmidevector (bijvoorbeeld pET28) voor door een dubbel decolleté met dezelfde enzymen als in stap 6.1.1 en gel zuiverhet product met een commerciële DNA-gelzuiveringskit.
   3. Schat de concentraties vector en insert door densitometry met agarose gel elektroforese.
   4. Stel een ligatie in met 1-5 U van T4 DNA ligase en vector:insert molaire ratio 1:3–1:5 in 1x ligase buffer aanbevolen door de enzymleverancier. Incubeer gedurende 2 uur bij RT en introduceer in geschikte gastheerbacteriën (vanaf stap 1.3) door transformatie of elektroporatie¹².
   5. Selecteer extransforman ten op LB-platen die het juiste antibioticum (50 μg/mL kanamycine voor pET28- of pET30-vectoren) en 1% glucose bevatten.
2. Express eiwitvarianten.
   1. Inenting enkele kolonies van de transformatie (tot 24 klonen kunnen gemakkelijk worden verwerkt in een enkele run) in 2 mL lb met kanamycine (50 μg/mL) en 1% glucose en groeien 's nachts bij 37 °C met schudden.
   2. Inent 15 mL van warm (37 °C) LB met 100 μg kanamycine en geen glucose met 0,75 mL van de nachtcultuur en incubeer bij 37 °C met krachtig schudden.
      LET OP: Er kunnen centrifugebuizen van 50 mL of 100 mL Erlenmayer kolven worden gebruikt.
   3. Voeg 176 μL glycerol toe aan 1 mL nachtcultuur (eindconcentratie van glycerol = 15%) meng grondig en vries bij -70 °C.
   4. Na 2-3 uur supplement 15 mL van de cultuur (van stap 6.2.1) met IPTG tot 1 mM en cultuur voor een extra 5 uur.
   5. Verzamel de bacteriële pellet door centrifugering (10.000 x g, 4 °C, 10 min) en vries in bij -70 °C.
3. Zuiver de eiwitvarianten.
   1. Breng 20 μL nikkelaffiniteitsharssuspensie over in 200 μL B1-buffer in een buis van 1,5 mL met een brede boorpipetpunt, meng voorzichtig en centrifugeer (5.000 x g, 30 s, 4 °C). Verwijder de supernatant door pipetteren en laat de buis op ijs.
   2. Stouw de bacteriële pellet van stap 6.2.5 in 300 μL b1 door krachtige vortexing. Breng de schorsing over in een buis van 1,5 mL.
   3. Voeg 3 μL van 100x proteaseremmercocktail en lysosoomoplossing toe in B1 (eindconcentratie van 1 mg/mL). Desintegreer de cellen door sonicatie met een tip uitgeruste sonde. Gebruik zes 10 s uitbarstingen per monster met >15 s tip koeling tijd in ijs tussen. Houd de celsuspensingen de hele tijd op ijs.
   4. Pelletcelpuin door centrifugering (2 min, 12.000 x g, 4 °C) en breng 250 μL supernatant over naar de harsaliquot vanaf stap 6.3.1.
   5. Meng gedurende 15 min in een koude ruimte, bij voorkeur in een carrouselmixer of door zachte vortexing.
   6. Centrifugeer (5.000 x g, 30 s, 4 °C) en zuig de supernatant aan met een pipet.
   7. Voeg 500 μL W buffer toe en hang de hars voorzichtig op. Centrifugeer (5.000 x g, 30 s, 4 °C) en zuig de supernatant aan met een pipet.
   8. Herhaal stap 6.3.7.
   9. Voeg 20 μL buffer E toe, stouw de hars voorzichtig op en laat het monster 2-5 min op ijs staan. Centrifugeer (5.000 x g, 30 s, 4 °C) en verzamel de supernatant.
   10. Herhaal stap 6.3.9. Zwembad supernatants.
   11. Analyseer eiwitmonsters via SDS-PAGE (5-10 μL) (Figuur 7).
4. Scherm voor varianten met de gewijzigde specificiteit.
   1. Assay decolleté activiteit op bacteriofaag lambda DNA. Het eiwitmonster kan tot 10% van het uiteindelijke reactievolume uitmaken. Een totaal van 2 μL eiwitmonster per 0,5 μg DNA en 2 uur reactietijd is een goed uitgangspunt.
   2. Analyseer de reactieproducten door agarose gel elektroforese samen met de producten gegenereerd door het wilde type enzym. Selecteer de klonen die decolletépatronen genereren die duidelijk te onderscheiden zijn van het patroon dat door het wilde typeenzym wordt gegenereerd voor verdere analyse (figuur 8).

Resultaten

Dit protocol is slechts een hulpmiddel om de frequentie van de gewenste varianten van een engineered REase te verhogen door twee ongewenste klassen uit te putten (maar niet te elimineren): inactieve enzymen en endonucleases met ongewijzigde wild typesequentiespecificiteit. Aan de andere kant, omdat het veranderen van REase specificiteit is uiterst moeilijk, het vinden van zelfs een dergelijke variant het produceren van een splitsing patroon dat verschilt van de wilde type enzym in een enkele screening van 24 klonen moet worden beschouwd als een succes. In onze handen konden de beste schermen tot 20% van de veelbelovende varianten identificeren (figuur 8A).

Het positieve resultaat hangt sterk af van de kwaliteit van de bibliotheek (d.w.z. een beperkte frequentie van vervangingen en de willekeurige verdeling ervan) en een efficiënte vangst van de bioateuze populatie bibliotheekleden (stappen 3.6–3.7). Beide problemen kunnen worden gedetecteerd. De kwaliteit van de bibliotheek moet voorafgaand aan de selectie worden gecontroleerd door zoveel mogelijk klonen te rangschikken (>15) of door de bibliotheek rechtstreeks te rangschikken door hoge doorvoervolgorde (stap 3.10, tabel 3). Als een meerderheid van de geselecteerde klonen niet actief zijn, is dit een duidelijke indicatie van het falen van de streptavidin-selectie. Een soortgelijk effect wordt waargenomen in het geval van bibliotheken die veel selectiecycli ondergaan, omdat dergelijke bibliotheken waarschijnlijk worden gedomineerd door inactieve varianten die aan de streptavidin-selectiestap(figuur 8B)zijn ontsnapt. Daarom is het raadzaam om screening na elke selectiecyclus uit te voeren en handmatig geselecteerde veelbelovende varianten verder te ontwikkelen in plaats van afhankelijk te zijn van selectieiteratie.

Figuur 1: In vitro selectie van een nieuwe sequentiespecificiteit op basis van NlaIV engineering. (A) De organisatie van de expressie / selectie cassette (ESC) omvat twee erkenning sites voor REase, 1) de geselecteerde volgorde (GGATCC) dicht bij het juiste uiteinde en 2) de teller geselecteerde sequentie (GGSSCC) dicht bij het linkereinde, evenals de T7p en T7t-T7 promotor en T7 terminator. De primer binding sites zijn hieronder weergegeven. Decolleté door wild type en geselecteerde NlaIV varianten worden weergegeven als rode en groene driehoeken respectievelijk. bB) Selectiecyclusstappen: I) Emulsificatie van transcriptie-vertaling-decolletéreactie mixen met de ESC-bibliotheek; II) Alle biotinylated DNA wordt gevangen op magnetische deeltjes bedekt met streptavidine en verwijderd, waardoor codering inactieve varianten; III) EsC's die REases coderen met wilde typeactiviteit (d.w.z. die in staat zijn de GGSSCC-sequentie te splijten) worden geëlimineerd omdat decolleté van de sequentie de bindingsplaatsen voor de voorwaartse en omgekeerde primers scheidt. Daarom vindt er geen versterking van deze SER's plaats; IV) Input voor de volgende selectieronde wordt gecreëerd door toevoeging van biotine aan de rechterkant en herinvoering van variatie van de teller geselecteerde sequenties aan de linkerkant. Herdrukt van Czapinska et al.⁸ met toestemming van Elsevier. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Voorbereiding van het ESC. Fragment afgeleid van de oorspronkelijke constructie in een expressievector die NlaIV ORF onder controle van de T7 promotor bevat, werd gewijzigd om geschikt te zijn voor expressie/selectie. De NlaIV site stroomafwaarts van de NlaIV ORF werd verwijderd en unieke sites (SalI, EcoRI en Eco52I) die werden gebruikt om geselecteerde posities mutagenize werden geïntroduceerd in de NlaIV ORF als stille mutaties. De uiteindelijke constructie werd versterkt met flankerende primers die twee flankerende NlaIV-sites introduceerden: De tellergeselecteerde sequentie (GGSSCC) aan de linkerkant en geselecteerde reeks (GGATCC) aan de rechterkant. De omgekeerde primer introduceerde ook biotine. Primers die worden gebruikt bij het maken van gemuteerde ECS worden weergegeven als blauwe pijlen en hieronder gelabeld (zie tabel 1B,C). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Regeling van split- en mixsynthese. Het voorbeeld verwijst naar MutB primer synthese waar een NNS sequentie werd geïntroduceerd op 0,8 frequentie op vier posities (zie ook tabel 3). Merk op dat chemische synthese wordt uitgevoerd van 3 ' tot 5 ', maar alle sequenties worden weergegeven in canonieke 5 '-3' oriëntatie (dat wil zeggen, het gaat van rechts naar links in dit schema). Wilde typesequenties op mutagene posities worden in het groen weergegeven, terwijl NNS mutagene sequenties in het rood zijn. De SalI-herkenningssite die later wordt gebruikt om mutaties in SER's te introduceren, wordt onderstreept. Punten van mengen en splitsen stappen (2 en 4) zijn aangegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Gebruik van unieke beperking enzym sites in oligonucleotide gerichte mutagenese. De strategie voor mutatieintroductie wordt getoond op een voorbeeld van de bouw van bibliotheken A-C (zie stappen 3.1–3.7). Herdrukt van Czapinska et al.⁸ met toestemming van Elsevier. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Endonucleolytisch decolleté in in vitro transcriptie-vertaling. (A) Splitsing van een testsubstraat in optimale REase buffer: 1) Substraat, 612 bp PCR product met één NlaIV herkenningsplaats; 2) Decolletéproducten, 355 bp en 257 bp.B) Decolleté in een in vitro transcriptie-vertalingreactie (met 0,5 μg ESC): 1–2) 15 μL aliquots van in vitro transcriptievertaling zonder substraat (regel 2: reactie aangevuld met 1,5 mM MgCl_2); 3–4) 15 μL aliquots van in vitro transcriptie-vertaling met 1 μg testsubstraat; (regel 4: reactie aangevuld met 1,5 mM MgCl₂). S-DNA grootte marker (pBR322 verteerd met MspI). Monsters werden opgelost in 6% native PAGE. DNA was bevlekt met ethidium bromide. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Producten van de eerste PCR in de selectiecyclus. Zie figuur 1B, stap III; protocolstap 5.10. Kolomsets 1 en 2 zijn aliquots van twee verschillende bibliotheken geladen in drievoud. S-DNA formaat standaard (lambda DNA verteerd met HindIII en EcoRI). Pijl geeft de positie van de volledige esc (1.050 bp) aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: NlaIV-varianten gezuiverd voor verdere screening in minischaal. Zie stap 6.3.11. Elke lijn bevat een 10 μL aliquot van een andere variant. S-eiwit moleculairgewicht standaard. Moleculaire massa van NaIV REase subunit is 29,9 kDa. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 8: Voorbeelden van screening van NlaIV-varianten voor sequentiespecificiteitswijziging. Zie stap 6.4.2. (A) Succesvolle screening met een hoge frequentie van veelbelovende varianten. S = DNA-maatmarker, lambda-DNA met HindIII en EcoRI; wild type (wt) = lambda DNA gespleten met wild type NlaIV; λ = lambda DNA substraat, niet gespleten; andere kolommen=varianten met een zeer lage activiteit. Varianten zijn gelabeld ! = veelbelovende varianten die een decolletépatroon produceren dat verschilt van het wilde type enzym; ? = varianten die ook de voorkeur voor de volgorde hebben gewijzigd. (B) Mislukte screening, met een meerderheid van de varianten inactief en een variant met blijkbaar ongewijzigd decolleté patroon. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 9: Alternatieve selectie door ligatie. Dit alternatief kan worden gebruikt voor alle REases genereren kleverige uiteinden. Hier presenteren we een voorbeeldprotocol voor een selectieschema voor MwoI-enzym (niet gepubliceerd). I) Geselecteerde volgorde (gelegen aan de rechterkant van de ESC) met gedefinieerde residuen in rood en geselecteerde variatie van de cognate sequentie weergegeven in het blauw. Tussen haakjes wordt onder de geselecteerde volgorde aan de linkerkant van het ESC afgebeeld; II) Product van MwoI-decolleté; III) Na beëindiging van in vitro transcriptie/ vertaling worden producten gezuiverd en wordt ligatie uitgevoerd met overtollige adapter. Alleen de decolletéproducten die in de geselecteerde volgorde zijn gespleten, kunnen deelnemen aan ligatie. Daarom worden inactieve varianten geëlimineerd en is de pulldown-stap niet nodig. Het decolletéproduct in de geselecteerde volgorde van de toonbank (aan de linkerkant van het ESC, niet weergegeven) kan niet aan deze ligatie deelnemen omdat het uitstekende uiteinde van de adapter niet complementair is aan de geselecteerde volgorde van de teller; IV) Selectieve PCR maakt gebruik van dezelfde strategie als in het hoofdprotocol om varianten te elimineren met de wilde type gedegenereerde sequentie specificiteit (F1 primer binding distaal aan de teller geselecteerde site), terwijl inactieve varianten worden geëlimineerd door de selectieve omgekeerde primer die niet kan binden aan de onbladde (en dus niet gewijzigd door adapter ligatie) rechterkant. In de volgende cyclus kan het proces worden herhaald met behulp van een adapter die identiek is aan het decolletéproduct van de voorgaande stap (d.w.z. de "klovencassette" in paneel III) en een geschikte selectieve omgekeerde inleiding. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Tabel 1: Primers gebruikt in NlaIV engineering. De volgorde van de beperkingssites die in de opmerkingen worden genoemd, wordt onderstreept. Kleine letters geven sequenties aan die geen aanvullingen hebben in de DNA-sjablonen. Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Tabel 2: Voorwaarden voor PCR-reacties die in het protocol moeten worden gebruikt. T_m = primer smelttemperatuur (als T_m is verschillend voor de primers, de lagere T_m moet worden gebruikt). Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Tabel 3: Resultaten van kwaliteitscontrole van twee mutagene primers gesynthetiseerd met split-and-mix strategie. Mutagenized codons worden aangegeven met [XXX]. Een lager indexnummer geeft de positie van een gecodeerd aminozuur aan. Aangepast van Czapinska et al.⁸ met toestemming van Elsevier. Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Tabel 4: Resultaten van EP-PCR. Belangrijkste parameters afgeleid van sequentieanalyse van 22 klonen van ECS. Klik hier om deze tabel te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Discussie

Het selectieprotocol dat hier wordt beschreven, is getest op NlaIV⁸, een dimeric PD-(D/E)XK-vouwherkenningssequentie die een palindromische doellocatie met centrale NN-basen herkent en een botte eindsnede tussen de NN-bases katalyseert. NlaIV werd geplukt omdat decolleté tussen de NN-bases suggereert dat deze basen dicht bij het eiwit in het complex liggen. In principe kan het protocol worden gebruikt voor elke sequentiespecifieke beperking endonuclease, monomeric of dimeric, van elke vouwgroep, waarbij dubbele strengbreuken van elke stagger worden gekaald, ongeacht of katalytische en specificiteitsdomeinen samenvallen (zoals in het NlaIV-voorbeeld) of afzonderlijk zijn (bijvoorbeeld FokI). Bovendien is het protocol in principe niet alleen nuttig voor het genereren van nieuwe, meer enge enzymspecificiteit, maar kan het ook worden gebruikt om steractiviteiten te elimineren of om high fidelity endonucleases te creëren. Dit alles is echter nog niet getest. Met name gerichte eliminatie van steractiviteit kan ingewikkeld zijn, omdat dezelfde aminozuurresiduen betrokken kunnen zijn bij het binden aan de gewenste en ongewenste basen. De in vitro stappen die in dit protocol worden beschreven, zijn niet beperkt tot de selectie van verkleinde specificiteiten, maar kunnen ook worden gebruikt om anders gewijzigde specifieke kenmerken te selecteren. Er is dan echter een probleem met variant endonucleases: als het spectrum van substraten nieuwe doelen bevat die niet door de ouderlijke endonuclease worden gespleten, is er over het algemeen geen goede manier om cellen te beschermen tegen de schadelijke effecten van deze activiteit. Als de specificiteit van endonuclease daarentegen slechts wordt verkleind, zijn de doelstellingen een subset van de wilde typedoelen, en daarom moet het reeds beschikbare cognate methyltransferase volledig beschermend zijn.

Ons protocol verschilt in verschillende opzichten van veel gerichte evolutieprotocollen. Open leesframediversiteit wordt eenmaal gegenereerd aan het begin van het experiment, niet in elke iteratie. Bovendien wordt het gemaakt door split-and-mix synthese, in plaats van door EP-PCR. Voor NNS-vervangingen van codons, zoals gebruikt in dit werk, zijn er (4 x 4 x 2)⁶ ~ 1,07 x 10⁹ combinaties voor zes posities. Daarom is een bepaalde variant gemiddeld eenmaal aanwezig in 1,7 fmoles van ESC. Deze capaciteit kan worden verhoogd tot zeven posities door synthese te gebruiken met een mengsel van 20 trinucleotide precursoren die worden aangeboden door Glen Research of door de mutatiefrequentie te verlagen in minder veelbelovende posities met split-and-mix oligonucleotide synthese. Indien mogelijk wordt aanbevolen om de mate van variatie te beperken tot zes posities. Uiteraard vereist een dergelijke mutagenese targeting enige reeds bestaande kennis over ten minste de regio's van de REase die betrokken zijn bij substraatbinding. Het split-and-mix protocol om diversiteit te genereren heeft duidelijke voordelen ten opzichte van EP-PCR. Met behulp van EP-PCR verkregen we ongewijzigde varianten en sequenties met acht vervangingen voor NlaIV ESC's in dezelfde EP-PCR (tabel 4). De bibliotheek van EP-PCR bevat een aanzienlijke fractie van klonen die moeten worden vermeden (wilde type sequenties, meerdere vervangingen, frameshift en onzin mutaties, en mutaties op plaatsen die waarschijnlijk niet van invloed zijn volgorde specificiteit).

Ons protocol verschilt ook van vele andere gerichte evolutieprotocollen door de aanwezigheid van twee opeenvolgende selectiestappen. Positieve selectie zorgt ervoor dat de gewenste activiteit behouden blijft, anders wordt de biotinetag niet verwijderd en kan de coderingsvolgorde worden verwijderd door pull-down. Het is technisch mogelijk dat de toevallige opkomst van een nieuwe, niet-overlappende specificiteit (bijvoorbeeld GCATGC) ook zou kunnen leiden tot het verbreken van de biotinetag, als er een geschikte decolletéplaats aanwezig is in de buurt van het gewenste decolleté, maar niet elders. Dit zou echter hoogst onwaarschijnlijk moeten zijn. Negatieve selectie verwijdert open leesframes die coderen voor enzymen die nog steeds de ongewenste activiteit hebben. Deze stap is niet strikt verplicht, omdat het protocol de uitvoerbibliotheek nog steeds zal verrijken met varianten die in staat zijn om de selectiereeks te splijten, maar niet in staat zijn om zich elders in het ESC te kloven, waardoor het ongeschikt is voor PCR-versterking. De selectieeffectiviteit zal naar verwachting echter lager zijn omdat enzymen met de oorspronkelijke sequentiespecificiteit niet uit de output zullen worden verwijderd en veelbelovende varianten met gewijzigde specificiteit zullen overtreffen, maar ook verminderde enzymatische activiteit. Merk op dat op populatieniveau zowel gewenste als ongewenste doelsequenties kunnen, maar niet hoeven te zijn, ontaarden. In het NlaIV-voorbeeld werd het antidoel gedegenereerde en werd het doel niet gedegenereerde. Zelfs wanneer er sprake is van degeneratie op bevolkingsniveau, is in één druppel slechts één (niet-gedegenereerde) doelstelling of anti-target aanwezig. In ons protocol worden doel- en doelsequenties opnieuw geïntroduceerd bij elke herhaling van de selectiestappen. Daarom moet een open leesframe een enzym coderen dat alle mogelijke doelen kan splijten en niet in staat is om een van de antidoelen te splijten om meerdere selectierondes te overleven. Merk op dat de noodzaak om het antiselectiedoel opnieuw in te voeren bij elke iteratie van het protocol twee opeenvolgende CDR's afdwingt. De eerste PCR maakt gebruik van een primer die uitvalt buiten het anti-doel, zodat decolleté van het anti-doel de PCR-reactie voorkomt. De tweede PCR vereist een primer die verder reikt dan de anti-target, en herintroduceert anti-target, om ervoor te zorgen dat tijdens meerdere rondes van de selectie, elk open leesframe wordt getest tegen alle varianten van de anti-target.

Voor enzymen die kleverige uiteinden genereren, kan een gerelateerd alternatief protocol op basis van een eerder beschreven methode voor isolatie van REase ORF¹⁰ worden gebruikt. De uitputting van inactieve varianten door biotine-opvang die in onze experimenten wordt gebruikt, wordt in het alternatieve protocol vervangen door ligatie van de compatibele adapter met een sequentie die wordt gebruikt als primerbindingssite in een selectieve PCR (figuur 9). Alleen SER's die enzymen produceren met de geselecteerde specificiteit genereren ligatie-geschikte uiteinden en zullen daarom worden geselecteerd. De volgorde van het kleverige uiteinde van de tegengeselecteerde reeks moet zodanig zijn ontworpen dat het niet kan deelnemen aan ligatie met adapters. Iteratie van het selectieproces kan eenvoudig worden bereikt door te schakelen tussen twee verschillende adapters en dus twee verschillende reverse primers in selectieve PCR.

Zelfs met nieuwe protocollen, de taak van engineering nieuwe specifieke kenmerken in vitro is nog steeds zeer uitdagend. Voor typische type II REases zijn sequentiespecificiteit en endonunucleolytische activiteit afhankelijk van dezelfde eiwitgebieden. Het is daarom moeilijk om het ene te veranderen zonder het andere te beïnvloeden. Succes wordt waarschijnlijker gemaakt door een strategie die rekening houdt met de voetafdruk van het enzym, de symmetrie van eiwit-DNA-interacties respecteert en voortbouwt op reeds bestaande enzymatische voorkeuren, die vooraf moeten worden bepaald in biochemische experimenten, zoals werd gedaan voor het NlaIV-voorbeeld⁸.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1000Å CPG Support (dA, dT, dC, dG)	Biosset	45-1000-050	Ook andere leveranciers kunnen worden gebruikt
ASM-800 DNA/RNA	Biosset	800-001-000
GeneJET Gel Extraction Kit	Thermo Scientific	K0691	Elk ander kit kan worden gebruikt
Glen-Pak DNA purification cartridge	Glen Research	60-5200
HIS-Select Nickel Affinity Gel	Sigma	P6611
pET 28a vector			Elke andere vector met T7 promotor stroomafwaarts van plykloneringsplaats kan worden gebruikt in plaats daarvan
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F530S	Elke andere hoog-fidelity en zeer procesieve thermofiele polymerase kan in plaats daarvan worden gebruikt
Porous steel foil	Biosset	40-063
Rapid Translation System RTS 100, E.coli HY Kit	Roche	3 186 148
Restriction endonucleases	Thermo Scientific		Natuurlijk kunnen andere leveranciers en enzymen worden gebruikt
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S	Ook andere leveranciers kunnen worden gebruikt. We hebben positief getest bedden van Sigma
Synthesis chemicals including phosphoramidities	Carl Roth		Ook andere leveranciers kunnen worden gebruikt
Synthesis columns (different sizes)	Biosset
T4 DNA ligase	Thermo Scientific	EL0011	Elke andere ligase kan worden gebruikt