Het protocol presenteert een volledig gevalideerd TNBS-geïnduceerde murine model van de ziekte van Crohn en methoden voor visualisatie van oestrogeenreceptoren door immunohistochemie met behulp van immunofluorescentie van formaline-vaste darm secties ingebed in paraffine.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Visualisatie van oestrogeenreceptoren in colons van muizen met tnbs-geïnduceerde ziekte van Crohn met behulp van immunofluorescentie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De ziekte van Crohn is het meest gediagnosticeerde type inflammatoire darmziekte. Chronische ontsteking zich ontwikkelt in de darm leidt tot peristtiek stoornis en schade van intestinale slijmvlies en lijkt te worden geassocieerd met een verhoogd risico op darmneoplastische transformatie. Accumuleren bewijs geeft aan dat oestrogenen en oestrogeen receptoren invloed hebben op niet alleen hormoon-gevoelige weefsels, maar ook andere weefsels niet direct gerelateerd aan oestrogenen, zoals de longen of dikke darm. Hier beschrijven we het protocol voor de succesvolle immunofluorescentie kleuring van oestrogeenreceptoren in de dikke darm verkregen uit een murinemodel van de ziekte van TNBS-geïnduceerde ziekte van Crohn. Een gedetailleerd protocol voor de inductie van de ziekte van Crohn bij muizen en darmpreparaat wordt verstrekt, evenals een stapsgewijze immunohistochemische procedure met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde darmsecties. De beschreven methoden zijn niet alleen nuttig voor oestrogeen receptor detectie en oestrogeen signalering onderzoek in vivo, maar kan ook worden toegepast op voor andere eiwitten die betrokken kunnen zijn bij de ontwikkeling van colitis.
Inleiding
De ziekte van Crohn (CD) is een inflammatoire darmziekte (IBD) die zich manifesteert als chronische darmontsteking. De etiologie van CD is slecht begrepen, maar er zijn een paar belangrijke factoren die verantwoordelijk lijken te zijn voor de ontwikkeling van cd's, waaronder darmmicrobiota, en genetische en omgevingsfactoren, zoals dieet of stress1. Voor een beter begrip van de pathogenese van de ziekte van Crohn zijn verschillende modellen van darmontsteking gebruikt2,3,4,5,6,<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dierstudies werden uitgevoerd met toestemming van het Lokaal Ethisch Comité (28/ŁB29/2016) overeenkomstig Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 en institutionele aanbevelingen.
1. TNBS-geïnduceerde murine model van de ziekte van Crohn
OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van mannelijke BALB/C muizen met een gewicht van 25-28 g. Dieren zijn gehuisvest bij een constante temperatuur (22-24 °C) en, relatieve vochtigheid 55 ± 5%, en onderhouden in een 12 uur licht/donker cyclus met gratis toegang tot standaard chow pellets en kraanwater ad libitum.
- Plaats ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Macroscopische kenmerken van dikke darmen bij muizen met tnbs-geïnduceerde ziekte van Crohn
Representatieve beelden van de uit de controle genomen dikke darmen en met TNBS behandelde muizen worden weergegeven in figuur 2. Bij muizen met een TNBS-geïnduceerd model van de ziekte van Crohn wordt de lengte van de dikke darm verminderd terwijl de breedte van de dikke darm wordt verhoogd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn tal van diermodellen voor IBD pathofysiologie onderzoek, met inbegrip van genetische, immunologische of spontane modellen, evenals chemisch geïnduceerde modellen15. Onder de verschillende soorten diermodellen van colitis, chemisch geïnduceerde modellen zoals de TNBS-geïnduceerde model beschreven in dit protocol, zijn relatief goedkoop en gemakkelijk te verkrijgen. Het tnbs-geïnduceerde murinemodel van colitis heeft verschillende klinische symptomen gerelateerd aan de pathologische basis va.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Het werk werd gepubliceerd dankzij de financiële steun van de autoriteiten van de Universiteit van Lodz: vicerector wetenschappelijk onderzoek, vicerector nationale en internationale samenwerking en decaan van de faculteit Biologie en Milieubescherming. Damian Jacenik werd ondersteund door subsidies (2017/24/T/NZ5/00045 en 2015/17/N/NZ5/00336) van National Science Centre, Polen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dieren | |||
| BALB/C muizen | University of Lodz | NA | |
| Apparatuur | |||
| Calliper | VWR | 62379-531 | |
| Kartonblok | NA | NA | |
| Confocale microscoop - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Volautomatische roterende microtoom - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glijplaatje | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Verwarmd paraffine-inbeddingsmodule - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histologisch doosje | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrofobe pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratoriumweegschaal | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metaalvorm | Marfour | CP.5105 | |
| Steriele gaas | NA | NA | |
| Steriele schaar | NA | NA | |
| Steriele pincet | NA | NA | |
| Weefselprocessor - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagentia | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzeensulfonzuur | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serumalbumine | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secundair antilichaam | Abcam | ab96886 | |
| ERα primair antilichaam | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primair antilichaam | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primair antilichaam | Abcam | ab39742 | |
| Zoutzuur | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Waterstofperoxide | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isofluraan (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normaal geitenserum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffine | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrischaal | Nest Scientific | 705001 | |
| Fosfaat bufferoplossing met natriumchloride | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Fysiologische zoutoplossing | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibioticum) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant met DAPI (glycerine-gebaseerde vloeistof met DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Natriumchloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Natriumcitraat | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| XYleen | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
Referenties
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
