Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA

Nandaraj Taye; Sarah Stanley; Dirk Hubmacher

doi:10.3791/60824

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA

7.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60824

⸱

12 februari 2020

Nandaraj Taye¹ , Sarah Stanley¹ , Dirk Hubmacher¹

¹Orthopaedic Research Laboratories, Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In dit artikel

Samenvatting

We bieden een protocol om genen die extracellulaire matrix (ECM) eiwitten coderen in C2C12 myoblasten neer te halen met behulp van small-hairpin (sh) RNA. Gericht op ADAMTSL2 als voorbeeld, beschrijven we de methoden voor de validatie van de knockdown-efficiëntie op het mRNA-, eiwit- en cellulair niveau tijdens C2C12 myoblast tot myotubedifferentiatie.

Samenvatting

Extracellulaire matrix (ECM) eiwitten zijn cruciaal voor skeletspierontwikkeling en homeostase. De stabiele knockdown van genen codering voor ECM eiwitten in C2C12 myoblasten kan worden toegepast om de rol van deze eiwitten in skeletspierontwikkeling te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om het ECM-eiwit ADAMTSL2 uit te putten als voorbeeld, met behulp van small-hairpin (sh) RNA in C2C12 cellen. Na transfection van shRNA plasmiden werden stabiele cellen batch-geselecteerd met behulp van puromycine. We beschrijven verder het onderhoud van deze cellijnen en de fenotypische analyse via mRNA expressie, eiwitexpressie en C2C12 differentiatie. De voordelen van de methode zijn de relatief snelle generatie stabiele C2C12 knockdown cellen en de betrouwbare differentiatie van C2C12 cellen in multinucleated myotubes bij uitputting van serum in de celkweek medium. Differentiatie van C2C12 cellen kan worden gevolgd door heldere veldmicroscopie en door het meten van de expressieniveaus van canonieke markergenen, zoals MyoD, myogenine of myosine zware keten (MyHC) die de progressie van C2C12 myoblastdifferentiatie in myotubes aangeeft. In tegenstelling tot de tijdelijke knockdown van genen met klein-storende (si) RNA, genen die later worden uitgedrukt tijdens C2C12 differentiatie of tijdens myotube rijping kan efficiënter worden gericht door het genereren van C2C12 cellen die stabiel uitdrukken shRNA. Beperkingen van de methode zijn een variabiliteit in de knockdown efficiëntie, afhankelijk van de specifieke shRNA die kan worden overwonnen met behulp van gen knock-out strategieën op basis van CRISPR / Cas9, evenals potentiële off-target effecten van de shRNA die moeten worden overwogen.

Inleiding

Extracellulaire matrix (ECM) eiwitten bieden structurele ondersteuning voor alle weefsels, bemiddelen celcel-cel communicatie, en bepalen cel lot. De vorming en dynamische verbouwing van ECM is dus van cruciaal belang om weefsel en orgaanhomeostase¹^,²te behouden. Pathologische varianten in verschillende genen die coderen voor ECM-eiwitten geven aanleiding tot aandoeningen aan het bewegingsapparaat met fenotypes, variërend van spierdystrofieën tot pseudomousculaire build³^,⁴. Pathogene varianten in ADAMTSL2 veroorzaken bijvoorbeeld de uiterst ze....