Methodenartikel

Identificatie van Neutrophil Extracellular Traps in Paraffine-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescentie Microscopie

8.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60834

⸱

29 maart 2020

 ,  ,  , 
1Veterinary Medical Teaching Hospital, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 2Department of Veterinary Surgical and Radiological Sciences, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 3Department of Veterinary Medicine and Epidemiology, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te identificeren in formaldehyde-vaste en paraffine-ingebedde katachtige cardiogene trombi met behulp van warmte-geïnduceerde antigen retrieval en een dubbele immunolabeling protocol.

Samenvatting

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's), samengesteld uit celvrij DNA (cfDNA) en eiwitten zoals histonen en neutrofiele elastase (NE), worden vrijgegeven door neutrofielen in reactie op systemische ontsteking of ziekteverwekkers. Hoewel eerder is aangetoond dat NETs de stolselvorming vergroten en fibrinolyse remmen bij mensen en honden, is de rol van NET's bij katten met cardiogene arterial trombo-embolie (CATE), een levensbedreigende complicatie secundair aan hypertrofische cardiomyopathie , is onbekend. Een gestandaardiseerde methode om NET's te identificeren en te kwantificeren bij cardiogene arteriële trombi bij katten zal ons begrip van hun pathologische rol in CATE bevorderen. Hier beschrijven we een techniek om NET's te identificeren in formaldehyde-vaste en paraffine-ingebedde trombi binnen de aortabifurcatie, geëxtraheerd tijdens obductie. Na deparaffinisatie met xyleen ondergingen aortasecties indirect warmte-geïnduceerde antigeenterugwinning. Secties werden vervolgens geblokkeerd, permeabilized, en ex vivo NETs werden geïdentificeerd door colocalisatie van cel-vrij DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), en neutrophil elastase (NE) met behulp van immunofluorescentie microscopie. Om de immunodetectie van NET's in trombi te optimaliseren, werd autofluorescentie van weefselelementen beperkt door een autofluorescentieblusproces voorafgaand aan microscopie te gebruiken. Deze techniek kan een nuttig hulpmiddel zijn om NET's en trombose bij andere soorten te bestuderen en biedt nieuwe inzichten in de pathofysiologie van deze complexe aandoening.

Inleiding

Katten met hypertrofische cardiomyopathie lopen het risico op levensbedreigende trombo-embolie complicaties1,2. Ondanks de hoge morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met katachtige cardiogene arteriële trombo-embolie (CATE), wordt de onderliggende pathofysiologie van CATE bij katten slecht begrepen. Er zijn ook beperkte diagnostische en therapeutische instrumenten om katten te behandelen en te identificeren die het risico lopen op deze verwoestende aandoening3.

Naast zijn rol in aangeboren immuniteit, neutrofielen is aangetoond dat een rol spelen in trombose door het vrijgeven van neutrofiele extracellulaire vallen (NETs), die web-achtige netwerken van cel-vrij DNA (cfDNA) ingelegd met histonen en korrelige eiwitten zoals neutrofiele elastase (NE) en myeloperoxidase. Neutrofielen ondergaan NETs vorming in reactie op systemische ontsteking, directe ontmoeting met ziekteverwekkers, en interactie met geactiveerde bloedplaatjes4,5,6,7. Bij honden is aangetoond dat neutrofie-afgeleid DNA stolsellyse remt, terwijl NET-eiwitten de stolselvorming versnellen. Het vermogen van NET's om circulerende cellen en stollingscomponenten te vangen is ook de sleutel tot hun trombogene eigenschappen8,9,10,11,12.

NET's worden gedetecteerd door colokalisatie van extracellulaire neutrofiele eiwitten, histonen en cfDNA. Hierdoor is de identificatie en kwantificering van NET's in vaste weefsels door immunofluorescentie van gedeparafeerde weefsels superieur aan traditionele hematoxyline en eosine (H&E) vlek met behulp van heldere veldmicroscopie4,5. Verschillende menselijke studies met behulp van immunofluorescentie microscopie geïdentificeerd NETs als structurele componenten van coronaire arteriële trombi, cerebrale beroerte trombi, atherothrombosis, en veneuze trombi13,14,15,16,17. Tot op heden is een gestandaardiseerde methode om NET's in katachtige trombi op te sporen en te kwantificeren niet beschreven. Omdat de identificatie van NET's in katachtige cardiogene arteriële trombi toekomstig translationeel onderzoek in NET's en trombose kan vergemakkelijken, beschrijven we technieken van NET-identificatie en -beoordeling in paraffine-ingebedde arteriële trombi bij katten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hier beschreven methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of California, Davis. Necropsies en biopten van weefsels werden uitgevoerd met toestemming van de eigenaars.

1. Weefselfixatie, inbedding en doorsnede

  1. Ontleed de aortabifurcatie, met inbegrip van de dalende aorta, dijbeenslagader, en de gemeenschappelijke iliacale slagaders (Figuur 1A), kort na humane euthanasie of dood. Blunt ontleden de fascia (Figuur 1B) alvorens het volledig onder te dompelen in 10% neutraal gebufferde formaline voor een minimum van 24 uur en niet langer dan 48 uur.
  2. Om het monster uit te drogen, dompel je eerst onder in 10% neutraal gebufferd formaline verwarmd tot 37 °C gedurende 1 uur. Dompel vervolgens onder in toenemende concentraties ethanol verwarmd tot 37 °C (70%, 95%, 100%) 2x voor 1 uur per stuk. Ten slotte, zonder spoelen, dompel 2x onder in 100% tolueen verwarmd tot 37 °C gedurende 1 uur per stuk.
  3. Voeg paraffine verwarmd tot 62 °C toe en laat de paraffine 's nachts volledig stollen.
  4. Sectie 2–3 μm van het paraffine-ingebedde weefsel met behulp van een microtoom en plaats op positief geladen glasplaten. Bewaar doordeelde weefsels bij -80 °C tot verdere analyse.

2. Deparaffinisatie, rehydratie en warmte-geïnduceerde antigeenterugwinning

  1. Als u deparaffinisatie en rehydratie van secties op glazen platen wilt uitvoeren, plaatst u glazen dia's in rekken en verwerkt u het volgende:
    1. Dompel volledig onder in 100% xyleen voor 3 min. Herhaal deze stap 2x. Spoel niet tussen de stappen door.
    2. Volledig onderdompelen in dalende concentraties ethanol (100%, 95%, 70%) bij kamertemperatuur (RT), 3x voor 3 min per stuk. Spoel niet tussen de stappen door.
    3. Dompel volledig onder in gedeïoniseerd water gedurende 2 min. Herhaal.
  2. Plaats secties in tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1 % Tween (TBST, pH = 7,6) voor 2-3 min.
  3. Vul het reservoir met gedeïoniseerd water verwarmd tot 100 °C. Laat de stoomkamer 20 min equilibreren.
    OPMERKING: Warmte-geïnduceerde antigen retrieval kan het best worden uitgevoerd met indirecte verwarming gegenereerd door een stoomboot met een vooraf ingestelde temperatuurinstelling, zoals een voedselstoomboot.
  4. Verwarm de commercieel verkrijgbare antigeenterugwinningsoplossing met Tris en EDTA (pH = 9) tot 95-97 °C op een temperatuurgecontroleerde kookplaat met constante roeren. Zorg ervoor dat het niet kookt.
    LET OP: De oplossing moet bewolkt worden zodra deze is opgewarmd.
  5. Giet de verwarmde antigeenterugwinningsoplossing in een schuifcontainer en plaats de container in de kamer van de stoomboot. Laat de antigeenterugwinningsoplossing 3-4 min afstellen met de temperatuur van de stoomboot. Zorg ervoor dat de temperatuur van de kamer ~95 °C is.
  6. Dompel de dia's volledig onder in de verwarmde antigeenterugwinningsoplossing en zet de toepassing van externe verwarming gedurende 20 min voort.
  7. Haal de schuifcontainer uit de stoomboot en laat de dia's en de antigeenterugwinningsoplossing afkoelen tot RT. Bewaar de verdunde antigeenophaaloplossing op 4 °C en hergebruik tot 2x indien nodig.
  8. Was de dia's 3x met TBST voor 5 min.

3. Immunolabeling en autofluorescentie blussen

OPMERKING: Tabel 1 beschrijft de samenstelling van de blokkeringsbuffers die in de volgende stappen worden gebruikt.

  1. Incubeer secties in Blocking Buffer 1 voor 2 uur bij RT onder zacht schommelen (30-50 rpm). Verzegelmet paraffinefolie om uitdroging te voorkomen.
  2. Zonder wassen, onmiddellijk van toepassing 100 μL verdunde konijn polyklonale anti-menselijke citrullinated histon H3 (citH3) antilichaam (0,03 mg/mL verdund in blokkerenbuffer 1) direct op de dia.
  3. Plaats op elke sectie een uitglijder (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) zodat het antilichaammengsel gelijkmatig kan worden verdeeld.
  4. Incubeer voor 12-16 uur bij 4 °C met zacht schommelen (30-50 tpm). Verzegelmet parafilmfolie om uitdroging te voorkomen.
  5. Was 3x met TBST voor 5 min.
  6. Breng 100 μL geitenantikonijn antilichaam aan dat is geconjugeerd op Alexa Fluor 488 (verdund tot een eindconcentratie van 0,04 mg/mL of 1:50 in Blocking Buffer 1) zoals beschreven in stap 3.3. Incubeer gedurende 1 uur bij RT onder zacht schommelen (30-50 rpm). Bescherm dia's tegen licht.
  7. Was met TBST 3x voor 5 min.
  8. Incubeer secties in Blocking Buffer 2 's nachts bij 4 °C onder zacht schommelen (30-50 rpm). Beschermen tegen licht.
  9. Was met TBST 3x voor 5 min.
  10. Blok secties in Blocking Buffer 3 zoals beschreven in stap 3.3 bij RT voor 2 uur onder zachte schommelen (30-50 rpm).
  11. Incubeersecties met bioateuze polyklonale konijnenanti-menselijk NE-antilichaam (eindconcentratie = 0,2 μg/mL in blocking buffer 3) bij 4 °C voor 12-16 uur zoals beschreven in stappen 3.2–3.4.
  12. Was met TBST 3x voor 5 min.
  13. Incubeer met Alexa Fluor 594 streptavidin conjugaat (verdunnen tot 1:100 of 0,02 mg/mL in Blocking Buffer 3) zoals beschreven in stappen 3.2–3.3 gedurende 1 uur bij RT. Bescherm tegen licht en afdichting met paraffine om uitdroging te voorkomen.
  14. Was met TBST 1x voor 5 min.
  15. Breng 100 μL autofluorescentieblusoplossingmengsel direct aan op de secties gedurende 1 min, zoals geïnstrueerd door de fabrikant.
  16. Was de glijbanen met TBST 6x voor 10 min.
  17. Bedek elke dia met 100 μL van 300 nM DAPI gedurende 5 min in het donker.
  18. Was met TBST voor 3 min. Herhaal dit voor een totaal van 5x.
  19. Breng een druppel (~ 50 μL) antifade montagemedium, onderdeel van de autofluorescentiebluskit, rechtstreeks aan op de glazen schuif rond de sectie. Plaats een uitglijder (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) voorzichtig op de sectie zonder dat er bellen ontstaan.
  20. Laat monsters 's nachts in het donker bij 4 °C genezen totdat het montagemedium is uitgehard voor microscopische analyse met onderdompelingslenzen.

4. Identificatie van neutrofiele extracellulaire val

OPMERKING: Het volgende protocol maakt gebruik van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop met een 1.280 x 960 digitale CCD-camera (zie Tabel van materialen).

  1. Om trombi te lokaliseren, scant cranially om caudally langs de lengte van de aorta, aortabifurcatie, en elke femorale slagader met behulp van fase contrast microscopie met een 10x doelstelling. Een trombus is een conglomeraat van weefsel met rode bloedcellen, witte bloedcellen en bloedplaatjes grenzend aan het endotheel op fasecontrast en heldere veldmicroscopie(figuur 2A, figuur 2B).
  2. Onderzoek eerst secties voor NET's met behulp van het DAPI-kanaal (excitatie = 357/44 nm) met 10x- en 20x-doelstellingen(figuur 2C). Merk op dat cfDNA verschijnt als gedecondenseerd DNA dat zich niet binnen de grenzen van het cytoplasma van een cel bevindt wanneer het wordt gezien op fasecontrast of heldere veldmicroscopie.
  3. Identificeer extracellular NE en citH3 op de Texas Red kanalen (excitatie = 585/29 nm, emissie = 628/32 nm) en groen fluorescerend eiwitkanaal (excitatie = 470/22 nm, emissie = 525/50 nm), respectievelijk met 10, 20 en 40x doelstellingen.
  4. Net's in een trombus evalueren en analyseren met behulp van beschikbare software, zoals Image J (NIH). NET-vorming wordt geïdentificeerd op basis van de colokalisatie van cfDNA, extracellulaire citH3 en NE zoals eerder beschreven18. Houd een consistente belichtingstijd en -winsten van elk kanaal behouden tijdens het verkrijgen van afbeeldingen om verzadiging in pixelintensiteit te voorkomen.
  5. Breng elke trombus in kaart op basis van de nabijheid van de dalende aorta door deze te verdelen in drie gelijke zones, met zone 1 die het dichtst bij de aorta ligt, zone 3 het verst van de aorta en zone 2 tussen zone 1 en 3). Met de operator verblind door de medische toestand van elk onderwerp, neem ten minste tien willekeurige velden in elke zone. Karakteriseren van de verdeling van NET's in trombi door het gemiddelde van het aantal velden met NET's in elke zone of het berekenen van de gemiddelde NET-bezettende gebied per zone.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van dit protocol voor deparaffinisatie, warmte-geïnduceerde antigen retrieval, en dubbele immunolabeling van paraffine-ingebedde trombi, identificeerden we NETs in katachtige CATE voor de eerste keer. Thrombi binnen de aortabifurcatie werden gelokaliseerd door fluorescentiemicroscopie en heldere veldmicroscopie met behulp van standaard H&E-kleuring en fasecontrastmicroscopie. Op heldere veldmicroscopie bestond katachtige arteriële trombi uit rode bloedcellen, leukocyten, fibrine en bloedplaatjes (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We beschrijven een protocol om NET's te identificeren in vaste katachtige cardiogene arteriële trombi met behulp van een dubbel immunolabelingprotocol en immunofluorescentiemicroscopie. Hoewel alleen cardiogene arteriële tromiale trombi werd gekleurd, in theorie dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten trombi en in andere diersoorten. Identificatie van NET's binnen katachtige arteriële trombi suggereert dat NET's een rol kunnen spelen bij trombose bij katten.

Detectie van NET's doo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De studie werd ondersteund door fondsen van de University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). De auteurs willen Dr. Kevin Woolard erkennen voor het gebruik van de fluorescentiemicroscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)Life Technologies CorporationD1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin-conjugaatThermoFisher ScientificCatalogusnr. S11227
Anti-gecitrullineerde histon H3-antilichaamAbcamAb5103
EVOS FL Cell Imaging SystemThermoFisher ScientificAMEFC4300
EVOS Imaging System Objectief 10xThermoFisher ScientificAMEP4681NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objectief 20xThermoFisher ScientificAMEP4682NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objectief 40xThermoFisher ScientificAMEP4699NA 0.75, WD 0.72 mm
Geit anti-konijn Alexa Fluor 488-antilichaamThermoFisher ScientificCatalogusnr. A32723
GeitenserumJackson Immuno Research LabsCatalogusnr. NC9660079. Fabrieksartikelnr. 005-000-121
Neutrofiele elastase-antilichaamBioss AntibodiesBs-6982R-BiotineKonijn polyklonaal antilichaam, geconjugeerd met biotine
NP40PierceProductnr. 28324. Batchnr. EJ64292
Positief geladen microscoopglaasjesThomas ScientificFabrieksnr. 1354W-72
KonijnenserumLife TechnologyCatalogusnr. 10510
Target Retrieval SolutionAgilent DakoS2367TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescentie Quenching KitVector LaboratoriesSP-8400

Referenties

  1. Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, Suppl 1 6-9 (2015).
  2. Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
  3. Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
  4. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  5. Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721(2019).
  6. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  7. Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
  8. Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
  9. Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
  10. Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322(2019).
  11. Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
  12. Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083(2018).
  13. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  14. Farkas, ÁZ., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
  15. Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928(2017).
  16. Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
  17. Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
  18. Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210(2018).
  19. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513(2016).
  20. Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
  21. Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
  22. Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
  23. Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
  24. Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
  25. Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
  26. Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
  27. Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
  28. Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In paraffine ingebed weefselgecitrullineerd histon H3neutrofiele elastasecelvrij DNAdoven van autofluorescentieantigeenherstelcardiogene trombo embolie

Gerelateerde artikelen