Method Article

Efficiënte differentiatie van postganglionic Sympathische neuronen met behulp van menselijke pluripotente stamcellen onder Feeder-vrije en chemisch gedefinieerde cultuurvoorwaarden

DOI:

10.3791/60843

⸱

May 24th, 2020

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol beschrijven we een stabiele, zeer efficiënte differentiatiestrategie voor het genereren van postganglionische sympathische neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen. Dit model zal neuronen beschikbaar stellen voor het gebruik van studies van meerdere autonome aandoeningen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) zijn uitgegroeid tot een krachtig instrument voor ziekte modellering en de studie van de menselijke embryonale ontwikkeling in vitro. We presenteerden eerder een differentiatieprotocol voor de afleiding van autonome neuronen met sympathiek karakter dat is toegepast op patiënten met autonome neuropathie. Het protocol werd echter gebouwd op Knock Out Serum Replacement (KSR) en op feeder gebaseerde cultuuromstandigheden, en om een hoge differentiatie-efficiëntie te garanderen, was celsortering noodzakelijk. Deze factoren veroorzaken een hoge variabiliteit, hoge kosten en een lage reproduceerbaarheid. Bovendien zijn volwassen sympathieke eigenschappen, waaronder elektrische activiteit, niet geverifieerd. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol waarbij PSC-cultuur en differentiatie worden uitgevoerd in feedervrije en chemisch gedefinieerde cultuuromstandigheden. Genetische markers die hoofdwapen identificeren, worden geïdentificeerd. Verdere differentiatie in postganglionic sympathieke neuronen wordt bereikt na 20 dagen zonder de noodzaak voor celsortering. Elektrofysiologische opname toont verder de functionele neuron identiteit. Afvuren gedetecteerd van onze gedifferentieerde neuronen kan worden versterkt door nicotine en onderdrukt door de adrenerge receptor antagonist propranolol. Intermediaire sympathische neurale voorouders in dit protocol kunnen tot 2 weken worden gehandhaafd als neurale sferoïden, waardoor de culturen kunnen worden uitgebreid. Kortom, onze bijgewerkte sympathische neuron differentiatie protocol toont een hoge differentiatie efficiëntie, betere reproduceerbaarheid, meer flexibiliteit, en een betere neurale rijping in vergelijking met de vorige versie. Dit protocol zal onderzoekers voorzien van de cellen die nodig zijn om menselijke aandoeningen te bestuderen die het autonome zenuwstelsel beïnvloeden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postganglionic sympathische neuronen (symNs) behoren tot het autonome zenuwstelsel (ANS) en hebben meerdere belangrijke rollen in het reageren en reguleren van homeostase van het lichaam onafhankelijk van bewustzijn. Stress stimuleert bijvoorbeeld symnen en roept de vecht-of-vluchtrespons op die leidt tot een toename van hartslag, bloeddruk en zweten. Symns worden beïnvloed in veelvoudige menselijke wanorde toe te schrijven aan genetica, giftigheid/verwonding, of als metgezellen aan andere ziekten. Een voorbeeld van een genetische neuropathie is de kinderziekte Familiale Dysautonomia (FD), waar een ernstige dysregulatie van symns dysautonome crisis veroorzaakt, duidelijk door zweten, vlekken van de huid, braken aanvallen, hypertensie, en angst1. Een voorbeeld van toxiciteit is chemotherapie behandeling, waarvan is gemeld dat toxische bijwerkingen hebben op autonome neuronen2. Het is bekend dat autonome denerhonger en hyper-innervatie beide kunnen leiden tot, of begeleiden, ziekten zoals de ziekte van Parkinson of hypertensieve nierziekte3,4. Dus, in staat zijn om onderzoek te doen en de mechanismen van symN biologie en gebreken in de context van de ziekte te begrijpen is gunstig voor het zoeken naar nieuwe en effectieve behandelingen.

Anatomie
Het perifere zenuwstelsel vertakt zich in zintuiglijke en autonome divisies. De afferente zenuwen van het zintuiglijke zenuwstelsel zijn verantwoordelijk voor het gevoel van pijn en aanraking, terwijl de ANS verantwoordelijk is voor het doorgeven van informatie van alle organen naar de hersenen. Het ANS is verdeeld in het enterische zenuwstelsel, waarbij het maag-darmkanaal, het parasympathische zenuwstelsel, dat belangrijk is voor ontspanning, en het sympathische zenuwstelsel (SNS), dat belangrijk is voor activering/regulatie van organen. De SNS past een twee-neuron systeem5. Preganglionic sympathische neurale axonen in het ruggenmerg eerste project aan de sympathische ganglia, waar postganglionic symN cel lichamen bevinden. Deze neuronen sturen dan lange projecties om de doelweefsels van elk orgaan in het lichaam innervate. Signalen overgedragen door preganglionic neuronen zijn cholinerge, terwijl postganglionic symNs zijn adrenergic en dus express noradrenaline (NE) als hun belangrijkste neurotransmitter. Er zijn enkele opmerkelijke uitzonderingen van postganglionic, sympathische neuronen die cholinerg zijn, met inbegrip van degenen innervating bloedvaten. Adrenerge postganglionic neuronen uitdrukken de enzymen tyrosine hydroxylase (TH), aromatische L-aminozuur decarboxylase (AAAD), dopamine β-hydroxylase (DBH), en monoamine oxidase (MAO-A), allemaal verantwoordelijk voor het genereren en metaboliseren NE. Voorts drukken zij de NE-recyclingtransporters en/of receptoren α-adrenerge receptor (ADRA2), β-adrenerge receptor (ADR2B), noradrenalinetransporter (NET1) en vesiculaire monoaminetransporter (VMAT1/2) uit.

Ontwikkeling
Tijdens de embryonale ontwikkeling symNs zijn afgeleid van de neurale crest (NC), die ontstaat tussen de neurale buis en overlaying ectoderm6, en kan zich onderscheiden in meerdere celgeslachten, met inbegrip van melanocyten, osteoblasten, adipocyten, glia, enterische neuronen, sensorische neuronen, en autonome neuronen7. Neurale crest cellen (NPC's) zijn zeer migrerende cellen die verschillende routes door het embryo. In dit vroege stadium van nc-ontwikkeling drukken de cellen de markers SNAIL1/2, FOXD3 en SOX108,9,10,11uit . De migratieroute bepaalt samen met de axiale locatie die ze aannemen het NC-subtype waarin ze zich zullen ontwikkelen. Deze NC-subtypen kunnen worden onderscheiden door hun specifieke HOX-genexpressie: CranialN NPC's drukken geen HOX-genen uit, vagalNcc's express HOX 1-5, trunk NCCs express HOX 6-9 en sacrale NPC's express HOX 10–1112. Onder hen, stam NPC's worden erkend als de belangrijkste bron van symNen. SymN precursoren uiten de transcriptiefactor MASH1/ASCL113, die de expressie van PHOX2B14 en INSM115bevordert . De GATA familie van transcriptie factoren wordt uitgedrukt tijdens de late sympathische ontwikkeling. GATA2 en GATA3 worden uitgedrukt in de symNs, die op hun beurt activeert DBH16. De transcriptiefactor HAND2 is ook belangrijk voor de expressie en het onderhoud van DBH en TH17.

HPSCs (bijvoorbeeld embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen) zijn een krachtig instrument18 om ontwikkelingsparadigma's te recapituleren en symNs te genereren die vervolgens kunnen worden gebruikt voor ziektemodellering van verschillende menselijke aandoeningen. Het genereren van symnen uit hPSCs is dus van cruciaal belang om ontwikkelingsrichtlijnen te volgen en de expressie van geschikte markeringen langs het differentiatieproces te beoordelen.

Vorig symN-protocol
Weinig onderzoeksgroepen hebben eerder gemeld de generatie van symN's van hPSCs19,20,21. De directe vergelijking van deze protocollen met elkaar en de onze werd onlangs herzien22. In 201623, publiceerden we een differentiatie protocol voor het genereren van autonome neuronen met symN karakter (Figuur 1A). Dit protocol gebruikte KSR-gebaseerd medium, dat werd gebruikt bij zowel het onderhoud van ongedifferentieerde hPSCs als celdifferentiatie. Bovendien werden hPSC's gehandhaafd op embryonale fibroblasten van muizen (MEF-feedercellen). We gebruikten dit protocol en PSC's van patiënten met FD om de aandoening 23 temodelleren. In 2019 beschreven we een meer gedetailleerde versie van dit oudere protocol24. Samengevat werd het neurale lot veroorzaakt door dubbele SMAD-remming25 om TGF-β en BMP-signalering in de eerste 2 dagen te blokkeren. WNT activering met chir99021 bevorderd neurale voorlopers om NC-cellen te worden. Op dag 11 werden cellen gesorteerd door FACS voor CD49D+ of SOX10+ populaties26,23, wat ongeveer 40% NC-generatie efficiëntie opleverde. Zo was sorteren nodig om de efficiëntie en zuiverheid voor de volgende stappen van differentiatie te waarborgen. De NPC's werden gehandhaafd en versterkt als sferoïden met de gecombineerde behandeling van FGF2 en CHIR. Na 4 dagen werden de NC sferoïden van onderhoud verguld en kregen BDNF, GDNF en NGF de symN rijping te voltooien. Hoewel deze symN's sterke symN-markers zoals ASCL1, TH, DBH en PHOX2A uitten, waren markers voor meer volwassen symnen, inclusief expressie van de nicotinische acetylcholine-receptor (CHRNA3/CHRNB4) en blaastransporter (VMAT1/2), laag, zelfs na 70 dagen differentiatie. HOX-genen in dit protocol werden niet formeel getest en volwassen neurale eigenschappen, waaronder elektrofysiologische activiteit van de cellen, werden niet geverifieerd.

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het genereren van symNs (figuur 1B). HPSC's worden onderhouden in feeder-vrije omstandigheden, op vitronectine (VTN)-gecoate gerechten, met behulp van Essential 8 (E8) media27. De formule van de differentiatiemedia is in elk stadium gewijzigd, waardoor het percentage van de NC-populatie28is verhoogd. De symN rijping kan worden gedaan op CD49D+/ SOX10+ gesorteerdof ongesorteerde bulk NCC populaties. Beide tonen hoge niveaus van symN marker expressie door dag 30. Bovendien reageren de symnen die met dit protocol worden gegenereerd, op elektrofysiologische opname en op behandelingen met symN-activator- en inhibitorverbindingen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De H9 PHOX2B:GFP reporter lijn werd geleverd door Oh et al.19. Sommige qPCR primers gebruikt in dit papier werden verkregen van OriGene Technologies, terwijl een paar sequenties worden verkregen uit Frith et al.20,30.

1. Opstelling voor schotelcoating, mediavoorbereiding en hPSC-onderhoud

  1. De laag van de schotel
    1. Vitronectine (VTN) coating
      1. Plaats flesjes VTN in een waterbad van 37 °C tot het volledig ontdooid is en meng vervolgens goed.
      2. Meng voor een petrischaal van 100 mm 7 mL van 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,5 mg/mL VTN, voeg VTN-oplossing toe aan de schotel en incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 1 uur.
    2. Kelder membraan matrix coating
      1. Ontdooi flacons van keldermembraanmatrix (zie Tabel van Materialen)op ijs bij 4 °C 's nachts.
      2. Voor een put van een 6 put plaat, meng 2 mL van DMEM/F12 met 20 μL van 100x kelder membraan matrix, voeg kelder membraan matrix oplossing aan de schotel, wikkel de schotel met paraffine film, en op te slaan in een schone container op 4 °C 's nachts. Werk zo snel mogelijk. Gecoate gerechten kunnen maximaal 2 weken in 4 °C worden bewaard.
    3. Polyornithine (PO)/lamine (LM)/fibronectine (FN) coating
      1. Meng op de eerste dag voor één put van een 24-put plaat 15 μg/mL PO met 1 mL van 1x PBS, incubeer bij 37 °C, 5% CO2 's nachts. Ontdooi zowel LM als FN bij -20 °C 's nachts en bewaar bij 4 °C tot volledig ontdooid.
      2. Op de tweede dag, aanzuigen PO oplossing, was de putten 2x met 1x PBS, voeg 1 mL van 1x PBS met 2 μg/mL van LM en 2 μg/mL van FN en incubeer bij 37 °C in 5% CO2 's nachts. Op dit punt kan de schotel met de LM/FN-oplossing maandenlang in de couveuse worden bewaard zolang het niet uitdroogt. Voeg meer 1x PBS toe om te voorkomen dat de schotel uitdroogt.
  2. Mediavoorbereiding
    1. Bereid het Essential 8 medium (E8) voor door één fles E8-supplement bij 4 °C 's nachts te ontdooien. Meng het supplement met 500 mL E8 medium en antibiotica indien nodig.
      LET OP: Werkende E8-oplossing moet binnen 2 weken worden opgebruikt.
    2. Bereid het hPSC vriesmedium voor door 90 mL compleet E8-medium te mengen met 10 mL DMSO voor een totaal volume van 100 mL. Filter steriliseren.
    3. Bereid het dag0 tot dag 1 differentiatiemedium voor door 100 mL van essentieel 6 (E6) medium te mengen met 10 μM SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021 en 10 μM Y27632 voor een totaal volume van 100 mL.
    4. Bereid het dag 2 tot dag 10 differentiatiemedium voor door 100 mL E6-medium te mengen met 10 μM SB en 0,75 μM CHIR99021 voor een totaal volume van 100 mL.
    5. Bereid de dag 10 tot dag 14 sferoïde medium door het mengen van neurobasaal medium met 2 mL van B27 (50x), 1 mL van N2 (100x), 2 mM L-Glutamate, 3 μM CHIR99021, en 10 ng/mL FGF2 voor een totaal volume van 100 mL.
    6. Bereid de dag 14 tot en met dag 28 medium voor sferoïde onderhoud op lange termijn door 0,5 μM verse RA toe te voegen aan de dag 10 tot dag 14 sferoïde medium voor elke voeding.
      LET OP: Houd RA altijd op -80 °C.
    7. Bereid het Rijpingsmedium van SymN voor door neurobasaal medium te mengen met 2 mL B27 (50x), 1 mL N2 (100x), 2 mM L-glutamaat, 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 μM ascorbiczuur en 0,2 mM dbcAMP voor een totaal volume van 100 mL. De oplossing moet binnen 2 weken worden gebruikt. Voeg voor elke voeding 0,125 μM verse RA toe. Deze oplossing wordt gebruikt vanaf dag 14 (optie 1) of dag 28 (optie 2).
    8. Bereid de FACS-buffer voor door DMEM te mengen met 2% FBS, 2 mM L-glutamaat en antibiotica indien nodig voor een totaal volume van 100 mL.
  3. hPSC-onderhoud
    1. HPSC's ontdooien en bewaren
      1. Bereid een VTN gecoate 100 mm schotel.
      2. Om een flesje hPSC's rechtstreeks van vloeibare stikstof te ontdooien, plaatst u de flacon in een waterbad van 37 °C en slingert u de buis voorzichtig in het water tot het ontdooit. Breng de ontdooide hPSCs over op een buis van 15 mL met 10 mL van 1x PBS en centrifugeer op 200 x g gedurende 4 min.
      3. Gooi de supernatant weg en voeg 1 mL E8 medium toe aan de buis. Pipetteer een paar keer om de pellet volledig opnieuw op te schorten en voeg vervolgens nog eens 9 mL E8 medium toe om in totaal 10 mL te bereiken.
      4. Vermeer de VTN-oplossing uit de 100 mm schaal.
      5. Breng de hPSCs naar een schaal van 100 mm, schud zachtjes (omhoog en links-rechts, niet in cirkels) om ervoor te zorgen dat cellen gelijkmatig worden verdeeld in de schotel
      6. Incubeer bij 37 °C, in 5% CO2.
      7. Op de volgende dag, aanzuigen alle medium en voer met 10 mL van E8.
      8. Voer op deze manier elke dag voor de komende 3-4 dagen en vervolgens voor te bereiden om te splitsen.
    2. HPSCs splitsen
      LET OP: hPSCs op het punt van splitsing moet 80%-90% confluent. Grote kolonies met gladde en heldere randen moeten worden waargenomen. Het contact tussen elke kolonie moet echter worden vermeden(figuur 2B,dag 0 en figuur 6B).
      1. Bereid vtn-gecoate 100 mm gerechten als dat nodig is.
      2. Aanzuig de E8 aan en was de schaal die 1x gesplitst moet worden met 1x PBS.
      3. Aangezogen de 1x PBS en voeg 4 mL van 0,25 M EDTA. Incubatie gedurende 2 min bij 37 °C, 5% CO2.
        LET OP: De hPSCs moeten worden gesplitst / opnieuw worden geplated als kleine kolonies. Behandel met EDTA niet langer dan 2 min om scheiding in enkele cellen te voorkomen. De cellen moeten na de behandeling van 2 min nog steeds aan het schoteloppervlak worden bevestigd.
      4. Aangezogen de EDTA, los de kolonies door sterk pipetteren 10 mL van E8 medium op de schotel oppervlak, en het verzamelen van alle medium en cellen in een 15 mL buis.
      5. Met hPSCs op 80%-90% samenvloeiing, split kolonies door 1:15-1:20. Als u bijvoorbeeld hPSCs tegen 1:20 in één schotel van 100 mm wilt splitsen, neemt u 500 μL E8/hPSCs-oplossing en mengt u met 9,5 mL vers E8-medium.
      6. Plate hPSC's in vtn-gecoate 100 mm gerechten.
        OPMERKING: Het wordt aangeraden om de ideale splitratio voor elke onderzoeker en cellijn onafhankelijk vast te stellen.
    3. Bevriezing van hPSCs
      1. Voor een 100 mm schotel van hPSCs die klaar is om te worden gesplitst, bereiden drie cryovials en 3,5 mL van bevriezing medium.
        LET OP: Media en flacons moeten in 4 °C of op ijs worden bewaard tot het gebruik.
      2. Aangezogen E8 en was de schotel 2x met 1x PBS.
      3. Aanzuigen 1x PBS en voeg 4 mL van 0,25 M EDTA, incubeer gedurende 2 min bij 37 °C, in 5% CO2.
        OPMERKING: hPSCs moeten worden ingevroren als kleine kolonies op het moment dat ze zouden worden gesplitst. Behandel de cellen met EDTA niet langer dan 2 min om scheiding in enkele cellen te voorkomen. Cellen moeten na de behandeling van 2 min nog steeds op het oppervlak van de schotel worden bevestigd.
      4. Aangezogen de EDTA, los de kolonies door sterk pipetteren 10 mL van 1x PBS op het oppervlak van de schotel, en verzamel alle medium en cellen in een 50 mL buis.
      5. Voeg 20 mL van 1x PBS toe en centrifugeer op 200 x g gedurende 4 min om de resterende EDTA uit te wassen.
      6. Gooi de supernatant weg en stouw de pellet opnieuw in 3 mL vriesmiddel.
      7. Verdeel hPSCs gelijkmatig in de drie cryovials, 1 mL per stuk.
      8. Bewaar 's nachts bij -80 °C in een gecontroleerde vriesdoos of een broodje piepschuim om een langzame temperatuurdaling te garanderen en vervolgens over te dragen aan een vloeibare stikstoftank voor langdurige opslag.

2. Zaaiende hPSCs om de differentiatie te starten (dag 0)

OPMERKING: hPSCs moeten klaar zijn voor differentiatie na stabilisatie (d.w.z. 2-3x worden gesplitst na ontdooien). Zorg ervoor dat de kolonies gezond zijn, met gladde, glanzende randen en minimale differentiatie(figuur 2B).

  1. Bereid kelder membraan matrix-gecoate gerechten (24 goed of 6 goed gerechten) een dag voor dag 0 als dat nodig is. Breng de gerechten naar RT aan het begin van differentiatie.
  2. Maak de dag 0-1 differentiatie medium als dat nodig is.
  3. Aangezogen de E8 van de confluent, klaar om hPCSs splitsen, en was de schotel 2x met 1x PBS.
  4. Voeg 7 mL van 0,25 M EDTA per schaal van 100 mm toe, incubeer bij 37 °C, 5% CO2, gedurende 15 min.
    OPMERKING: Op dit punt wordt de EDTA-behandeling verlengd om zich in enkele cellen te verspreiden.
  5. Pipet uit alle hPSCs (ze moeten drijven) en over te dragen aan een 50 mL buis. Voeg dezelfde hoeveelheid of meer van 1x PBS toe als EDTA-oplossing om de EDTA te verdunnen.
  6. Centrifugeer op 200 x g voor 4 min.
  7. Gooi de supernatant weg, voeg 1 mL van dag 0-1 differentiatiemedium en pipet toe om de cellen te homogeniseren. Volg door het toevoegen van meer medium en vervolgens mengen om de celoplossing te verdunnen tot een concentratie ideaal om de cellen te tellen.
    LET OP: Oververdun de celoplossing niet. Cellen van een volledige 100 mm schotel moeten worden verdund in 5 mL van medium om te beginnen.
  8. Tel het celnummer met behulp van een geautomatiseerd celteller of hemocytometer.
  9. Verdun de celoplossing indien nodig om 125.000 cellen/cm2 te bereiken in een laag eindvolume (bijvoorbeeld 2 mL per put voor een 6-putschaal of 500 μL per put voor een 24-putschaal).
    LET OP: Een laag volume helpt de cellen sneller te hechten.
  10. Aangezogen alle kelder membraan matrix oplossing van de gecoate gerechten en plaat de cel oplossing in de putten.
  11. Incubeer bij 37 °C, in 5% CO2.

3. Neurale crest cell inductie (dag 1 tot dag 10, Figuur 2A)

  1. Op dag 1 voer de cellen met dag 0-1 differentiatie medium (3 mL per put voor 6 goed gerechten en 1 mL per put voor 24 goed gerechten).
  2. Op dag 2 voeden de cellen met dag 2-dag 10 differentiatie medium (3 mL per goed voor 6 goed gerechten en 1 mL per goed voor 24 goed gerechten).
  3. Vanaf nu moeten de cellen om de dag worden gevoed tot dag 10 (d.w.z. de volgende voederdag zal dag 4 zijn).
    OPMERKING: Vanaf dag 6 moeten NC-ribbels worden gedetecteerd (figuur 2B). Om te controleren of differentiatie plaatsvindt, wordt geadviseerd om een parallelle differentiatiecultuur in kleinere putten (d.w.z. 24 putten) te dragen, die voor SOX10/AP2a kunnen worden gekleurd en gebruikt voor markergenexpressie gedurende de tijd van differentiatie (Figuur 2B,C).
  4. Als u cellen sorteert, gaat u door naar sectie 4. Ga anders naar sectie 5.

4. Fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) voor neurale crest marker CD49D en aggregerenDE NC-cellen in sferoïden

OPMERKING: Voor FACS-sortering mogen de monsters op ijs worden gehouden en mogen zij niet aan licht worden blootgesteld na het bevlekken tot het sorteren.

  1. Bereid de FACS-buffer voor als de cellen worden gesorteerd.
  2. Bereid dag 10-14 sferoïde medium.
  3. Verwijder op dag 10 het medium en was 1x met 1x PBS.
  4. Voeg dissociatieoplossing (zie Materiaaltafel)bij 2 mL per put toe voor een 6-putschaal of 1 mL per put voor een 24-putschotel en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 voor 20 min.
  5. Pipet uit alle hPSCs en over te dragen aan een 50 mL buis.
  6. Vul de rest van de buis met FACS buffer en centrifugeer op 200 x g gedurende 4 min.
    LET OP: Elke 50 mL buis is geschikt voor maximaal 20 mL of minder van de cel oplossing. Het volume van de FACS-buffer moet hoog genoeg zijn om de dissociatieoplossing te neutraliseren.
  7. Gooi de supernatant, resuspend de cellen met de juiste hoeveelheid FACS buffer (~ 2 mL per put van een 6 goed plaat), en tellen om het celnummer te bepalen.
  8. Bereid de volgende monsters voor.
    1. Monster 1 (onbevlekte controle): 1 x 106 cellen in 400 μL FACS buffer. Filtreer de cellen door een zeefkap van 20 μm en houd de buis op ijs.
    2. Monster 2 (Alleen DAPI-besturing): 1 x 106 cellen in 400 μL FACS-buffer met 0,5 ug/mL DAPI. Filtreer de cellen door een FACS-buis met een zeefkap en houd de buis op ijs.
    3. Monster 3 (CD49d-label): Hang de rest van de cellen op met FACS-buffer met PE/Cy7-geconjugeerde CD49D-antilichamen (5 μL voor 1 x 106 cellen per 100 μL FACS-buffer) in een buis van 15 mL en incubeer op ijs gedurende 20 min.
  9. Vul de buizen met FACS buffer en centrifugeer op 200 x g gedurende 4 min.
  10. Gooi de supernatant weg en suspend elke 5-10 x 106 cellen in 1 mL FACS-buffer met 0,5 ug/mL DAPI volgens de instructies van de fabrikant.
  11. Filtreer de cellen door de FACS-buis met de zeefkap en houd de buis op ijs.
  12. Bereid de FACS-buizen met 2 mL FACS-buffer voor.
  13. Sorteer de FACS-machine met lasers die DAPI en PE-Cy7 kunnen detecteren om de CD49D+ populatie te isoleren.
  14. Na het sorteren, tel de gesorteerde cellen.
  15. Centrifugeer alle gesorteerde cellen en resuspend in dag 10-14 sferoïde medium tot een definitieve concentratie van 0,5 x 106 cellen per 500 μL medium.
  16. Plaat 0,5 x 106 cellen per put in ultra-lage bevestiging 24 goed platen.
  17. De cellen uitbroeden bij 37 °C, in 5% CO2.

5.

  1. Als u FACS niet gebruikt om de NC-cellen te isoleren en ze in plaats daarvan rechtstreeks in sferoïden te aggregeren, bereid dan eerst cellen voor zoals beschreven in stappen 4.2–4.5.
  2. Vul de rest van de buis met 1x PBS en centrifugeer op 200 x g gedurende 4 min.
  3. Gooi de supernatant weg, schort de cellen opnieuw op met een geschikte hoeveelheid dag 10-14 sferoïde medium (bijvoorbeeld ~ 2 mL medium per put voor een 6-putplaat) en tel om het celnummer te bepalen.
  4. Verdun de cellen in dag 10-14 sferoïde medium tot 0,5 x 106 cellen per 500 μL medium.
  5. Plaat 500 μL van de celvering per put in ultra-lage bevestiging 24 goed platen.
  6. De cellen uitbroeden bij 37 °C, in 5% CO2.

6. NC sferoïde onderhoud en sympathische progenitor inductie (dag 10 tot dag 14, figuur 4A)

  1. Optie 1: Minimale sferoïde cultuur
    1. Voeg op dag 11 500 μL van dag 10-14 sferoïde medium toe aan de NC-sferoïden zonder bestaand medium vanaf dag 10 te aspreeren. Incubeer bij 37 °C, in 5% CO2.
    2. Op dag 12, kantel de plaat om de NC sferoïden accumuleren aan de ene kant van de putten. Spoel voorzichtig aan en gooi zoveel mogelijk medium weg, en voer met 1 mL van dag 10-14 sferoïde medium.
    3. Blijf de cellen elke dag voeden tot dag 14.
    4. Optioneel: Als de sferoïden samengaan en een grote klomp genereren, gebruik dan een pipet om de sferoïde klonters te breken. Dit zorgt er ook voor dat individuele sferoïden niet te groot worden.
      LET OP: Het ideale sferoïde bereik moet ongeveer 100-500 μm liggen. Binnen dat bereik is de grootte van individuele sferoïden niet kritiek. De morfologie, zoals een gladde en heldere randen (figuur 3 en figuur 6) is echter belangrijk voor verder succes. Op dag 14, elke 24 goed plaat idealiter bevat ongeveer 50-60 sferoïden van verschillende grootte binnen de bovengenoemde grootte bereik.
  2. Optie 2: Uitgebreide sferoïde cultuur
    1. Op dag 15, om NC sferoïden te houden, voer met 1,5 mL van dag 10-14 sferoïde medium met 0,5 μM RA. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2.
      LET OP: RA moet vers worden toegevoegd voor elke voeding en altijd worden opgeslagen bij -80 °C.
    2. Voer voortaan om de dag tot dag 28 en ga dan verder met het beplaten van de sferoïden (punt 7.1).
      LET OP: De groeiende sferoïden worden ongeveer 1x per week gesplitst door ze te pipetteren met een 1 mL pipet om ze op te breken. Ze worden gesplitst bij een geschatte verhouding van 1:2–1:4. Binnen de uitbreidingsperiode van 2 weken moeten de cellen ongeveer verviervoudigen in aantal.

7. SymN differentiatie en rijping (optie 1: na dag 14; Optie 2: na dag 28)

  1. Plating sferoïden in reguliere gerechten
    1. Bereid PO/LM/FM-gecoate 24 putplaten voor.
    2. Bereid symN medium met 0,125 μM RA (voeg vers elke feed) en 10 μM Y27632 (alleen dag 14).
    3. Op dag 14, kantel de plaat om NC sferoïden accumuleren aan de ene kant van de putten. Spoel voorzichtig aan en gooi zoveel mogelijk medium weg, en voer met 1 mL symN medium.
    4. Verwijder LM/FN van de gecoate platen.
    5. Split en plaat elk goed van de 24 goed plaat in 4 aparte putten van de nieuwe, gecoate 24 goed plaat. Elke originele put zal 1 mL hebben, met ~50-60 sferoïden. Dit levert 250 μL op, met ongeveer 10-15 sferoïden voor elke put op de nieuwe plaat.
    6. Voeg 250 μL extra medium per put toe.
      LET OP: Dit is een splitsing van 1:4; zorg ervoor dat de sferoïden goed binnen de oplossing worden verdeeld, zodat de splitsing relatief gelijkmatig is. Het aantal sferoïden wordt niet meegeteld omdat het uiteindelijke aantal geen invloed heeft op het succes van het genereren van symN's.
    7. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2.
    8. Op dag 15 (of dag 29 voor optie 2) u alle mediums vervangen door 1 mL symN medium met 0,125 μM RA. Vanaf nu moeten de neuronen elke 2 dagen worden gevoed tot dag 20 (of dag 35 voor optie 2).
    9. Na dag 20 (of dag 35 voor optie 2) moeten de neuronen worden gevoed door slechts de helft van het bestaande medium (500 μL) zorgvuldig te vervangen. Vanaf nu, voeden elke week, tenzij het medium snel geel wordt.
    10. Blijf wekelijks voeden tot het gewenste tijdstip.
      OPMERKING: symns hebben de neiging om samen te voegen in ganglia-achtige structuren en zijn geneigd om los te komen van de cultuur gerechten. Om dit te voorkomen, wordt halfvoeding en minimale handling aanbevolen.
  2. Platingcellen voor elektrofysiologische opname
    1. Bereid PO/LM/FM-gecoate 96 goed elektrofysiologie platen.
    2. Bereid symN medium met 0,125 μM RA (voeg vers elke feed) en 10 μM Y27632 (alleen dag 14).
    3. Verzamel op dag 14 alle sferoïden en centrifugeer ze vervolgens op 200 x g gedurende 4 min.
    4. Gooi de supernatant weg, voeg 2 mL dissociatieoplossing toe en breng het mengsel terug naar een van de putten van de ultralage bevestigingsplaat. Incubeer bij 37 °C, in 5% CO2 voor 20-45 min.
      OPMERKING: Afhankelijk van de grootte van de sferoïden kan de dissociatieperiode langer zijn dan 20 min. Controleer de dissociatie van de cel elke 10 min tot 45 min. Optioneel kan 0,1 mg/mL van DNase worden toegevoegd met dissociatieoplossing om te voorkomen dat vrij DNA van dode cellen de kleverige oplossing maakt. Dit is optioneel in dit protocol omdat de sferoïden niet zullen samengaan zodra ze volledig gescheiden zijn.
    5. Pipet om de sferoïden volledig te scheiden en centrifugeer vervolgens op 200 x g gedurende 4 min.
    6. Gooi de supernatant weg, schort de cellen opnieuw op met de juiste hoeveelheid symN-medium en tel het celnummer.
    7. Verguld de cellen op 100.000/cm2 in PO/LM/FN-gecoate elektrofysiologieputten in 200 μL totaal volume per put.
    8. Volg op dag 15 (of dag 29 voor optie 2) dezelfde voerprocessen als in punt 7.1. Het totale volume na dag 15 (of dag 29 voor optie 2) moet 300 μL per put zijn.
    9. Meet de elektrische signalen met behulp van een multi-elektrode array machine na dag 20 (of dag 35 voor optie 2).
      OPMERKING: In optie 2 kunnen sferoïden op elk moment worden verguld tussen dag 14-dag 28. De eerste metingen van elektrische signalen kunnen 1 week na het beplaten van de sferoïden worden uitgevoerd.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol geven we instructies over het genereren van symns van hPSCs. De hier aangetoonde cultuuromstandigheden werden verbeterd van een eerder gepubliceerd protocol23,24 (figuur 1A) tot feedervrije en chemisch gedefinieerde omstandigheden ( figuur1B). Er zijn twee opties beschikbaar, een waarbij symnen binnen 20 dagen worden gemaakt, en een andere waar de NPC's gedurende 2 weken kunnen worden uit...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We publiceerden onlangs twee reviews, een bespreken van het gebruik van hPSC-afgeleide symNs voor ziekte modellering31 evenals een diepgaande vergelijking van de beschikbare differentiatie protocollen22. Dus, hier richten we ons op het oplossen van problemen met het huidige protocol om de geïnteresseerde onderzoeker te helpen slagen in het maken van symNs. Tijdens het gehele differentiatieproces, om consistente gegevens en gezonde gedifferentieerde cellen te verkrijgen, moe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Heidi Ulrichs bedanken voor het kritisch lezen en bewerken van het manuscript.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell culture dishesFalcon353003
15 mL conical tissue culture tubesVWR/Corning89039-664
24-well tissue culture platesFalcon353047
24-well ultra-low-attachment platesCorning07 200 601 en 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubatorThermo Fisher/Life TechnologiesHeracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubesVWR/Corning89039-656
6-well tissue culture platesCostar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibodyAbcamab108311Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibodyBD Pharmingen556604Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibodyBioLegend304313Host: Mouse IgG1; 5 µl/million cells in 100 µl volume
Anti-CD49D antibody (isotype)BioLegend400125Host: Mouse IgG1; 5 µl/million cells in 100 µl volume
DAPI dyeSigmaD95421:1000 dilution
Anti-DBH antibodyImmunostar22806Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibodyAbcamab13970Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibodyAbcamab50839Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibodyMabNET17-1Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibodySanta Cruz BiotechnologySC-377093/H0112Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-365692Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibodyPel-FreezP40101- 150Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acidSigmaA8960-5GStock concentration: 100 mM
B27 supplementThermo Fisher/Life Technologies12587-010Stock concentration: 50x
BDNFR&D Systems248-BDStock concentration: 10 µg/mL
BMP4R&D Systems314-BPStock concentration: 6 mM
Cell counterThermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
Cell counting chamber slidesInvitrogenC10312
CentrifugeEppendorf57021&5424R
CHIR99021R&D Systems4423Stock concentration: 6 mM
Cryo-vialThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627Stock concentration: 100 mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018Stock concentration: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057Stock concentration: 1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6 mediumgibcoA15165-01
E8 mediumgibcoA15169-01Stock concentration: 1x
E8 supplementgibcoA15171-01Stock concentration: 50x
EDTASigmaED2SSStock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
FACS machineBeckman CoulterCytoFLEX (for FACS)
FACS machineBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap)Falcon352235
FACS tubes (white cap)Falcon352063
Fetal bovine serum (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450Stock concentration: 10 µg/mL
GeltrexInvitrogenA1413202Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCsThomson et al., (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN)VWR/Corning47743-654Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamineThermo Fisher/Gibco25030-081Stock concentration: 200 mM
LN tankCustom Biogenic SystemsV-1500AB
MEA readerAxion BioSystemsMaestro Pro
Mouse laminin I (LM)R&D Systems3400-010-01Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplementThermo Fisher/Life Technologies17502-048Stock concentration: 100x
Neurobasal mediumgibco21103-049Stock concentration: 1x
NGFPeproTech450-01Stock concentration: 25 µg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco14190-136Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO)SigmaP3655Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics)InvivoGenANTPM1Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machineBio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
qPCR platesBio-Rad LaboratoriesHSP9601
recombinant FGF2R&D Systems233-FB/CFStock concentration: 10 µg/mL
Retinoic acidSigmaR2625Stock concentration: 1 mM
SB431542Tocris/R&D Systems1614Stock concentration: 10 mM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , Academic Press. (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865(2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92(2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78(2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81(2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsSympathetic Neuron DifferentiationFeeder free CultureChemically Defined ConditionsNeural Crest MarkersElectrophysiological RecordingRetinoic Acid TreatmentSpheroid Culture ExpansionPostganglionic Sympathetic NeuronsAutonomic Nervous System

Related Articles