Een protocol wordt beschreven voor in situ perfusie van het onderlichaam van de muis, met inbegrip van de blaas, de prostaat, geslachtsorganen, bot, spier en voethuid.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Oprichting van In Situ Closed Circuit Perfusie van onderbuikorganen en achterpoten bij muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ex vivo perfusie is een belangrijk fysiologisch hulpmiddel om de functie van geïsoleerde organen (bijvoorbeeld lever, nieren) te bestuderen. Tegelijkertijd is een uitdaging of niet haalbaar vanwege de kleine omvang van de muisorganen, ex vivo perfusie van bot, blaas, huid, prostaat en voortplantingsorganen. Hier rapporteren we voor het eerst een in situ lager lichaam perfusie circuit in muizen die de bovenstaande weefsels omvat, maar omzeilt de belangrijkste klaring organen (nier, lever, en milt). Het circuit wordt vastgesteld door het afzwmen van de abdominale aorta en inferieure vena cava boven de iliacale slagader en ader en cauterizing perifere bloedvaten. Perfusie wordt uitgevoerd via een peristaltische pomp met perfusate flow gehandhaafd voor maximaal 2 uur. In situ kleuring met fluorescerende lectine en Hoechst oplossing bevestigd dat de microvasculatuur met succes werd geperfuseerd. Dit muismodel kan een zeer nuttig hulpmiddel zijn voor het bestuderen van pathologische processen en mechanismen voor de levering van geneesmiddelen, migratie/metastase van circulerende tumorcellen in/van de tumor en interacties van het immuunsysteem met geperfundeerde organen en weefsels.
Inleiding
Geïsoleerde orgaanperfusie werd oorspronkelijk ontwikkeld om orgaanfysiologie te bestuderen voor transplantatie1,2,3, en maakte het mogelijk om het inzicht in functies van de organen te begrijpen zonder interferentie van andere lichaamssystemen. Geïsoleerde nier- en hartperfusie was bijvoorbeeld enorm nuttig bij het begrijpen van basisprincipes van hemodynamica en effecten van vasoactieve agentia, terwijl leverperfusie belangrijk was voor het begrijpen van de metabole functie, inclusief medicijnmetabolisme in gezond en ziek weefsel4,5,6,7. Bovendien waren perfusiestudies van cruciaal belang voor het begrijpen van de levensvatbaarheid en functie van organen die bestemd waren voor transplantatie. In Cancer Researchearch, geïsoleerde tumor perfusie is beschreven door verschillende groepen met behulp van muis, rat, en vers gereseceerde menselijke weefsels8,9. In sommige geïsoleerde tumorperfusie werd de tumor geïmplanteerd in het eierstokvetkussen om de groei van de tumor die bloedvaten levert van de mesenterieslagader10te forceren. De Jain-groep voerde baanbrekende studies uit met behulp van geïsoleerde perfusie van colonadenocarcinomen om tumorhemodynamica en metastase8,11,12,13te begrijpen . Andere innovatieve engineered ex vivo setups omvatten een 96-well plate-based perfusie apparaat om de primaire menselijke multiple myeloom cellen14 en een modulaire flow kamer voor engineering beenmerg architectuur en functie onderzoek15cultuur.
Naast fysiologie en pathologiestudies is orgaanperfusie gebruikt om de basisprincipes van de levering van geneesmiddelen te bestuderen. Zo beschreef een groep geïsoleerde rattenledemaatperfusie en bestudeerde hij de ophoping van liposomen in geïmplanteerde sarcoman16, terwijl een andere groep ontleede menselijke nierperfusie uitvoerde om de endotheel targeting van nanodeeltjes17te bestuderen. Ternullo et al. gebruikte een geïsoleerde geperfuseerde menselijke huidflap als een ingebouwde vivo huidmedicijn penetratiemodel18.
Ondanks deze vooruitgang in perfusie van grote organen en weefsels, zijn er geen rapporten over in situ perfusiemodellen in muizen die: a) klaringsorganen zoals lever, milt en nieren omzeilen; b) bekkenorganen, huid, spieren, voortplantingsorganen (bij mannen), blaas, prostaat en beenmerg omvatten. Vanwege de geringe omvang van deze organen en de leverende vasculatuur is ex vivo cannulation en de totstandbrenging van een perfusiecircuit niet haalbaar geweest. De muis is het belangrijkste diermodel in kanker en immunologie onderzoek, en de levering van geneesmiddelen. De mogelijkheid om kleine muisorganen te doornemen zou het mogelijk maken interessante vragen met betrekking tot de levering van geneesmiddelen aan deze organen, waaronder tumoren geïmplanteerd in het bekken (blaas, prostaat, eierstok, beenmerg), worden beantwoord, evenals studies van de fundamentele fysiologie en immunologie van ziekten van deze organen. Om dit tekort aan te pakken, ontwikkelden we een in situ perfusiecircuit bij muizen dat mogelijk weefselletsel kan voorkomen en veel beter geschikt is voor functioneel onderzoek dan geïsoleerde orgaanperfusie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle methoden die hier beschreven zijn goedgekeurd door de Universiteit van Colorado's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Verwarm het perfusiesysteem voor
- Bereid het perfusiesysteem voor de operatie door een circulerend waterbad van 37 °C te starten voor alle componenten met waterjas (reservoir, vochtige kamer en deksel) zoals weergegeven in een aangepaste configuratie in figuur 1A. Zorg ervoor dat de slang schoon is en vervang indien nodig. Om het perfuseren volume te beperken, gebruik een bellenval in een vochtige kamer als het perfuseren reservoir (Figuur 1B-6).
2. Vasculaire katheterisatie
- Induceer anesthesie in een 8-10 weken oude BALB/c muis met behulp van een isoflurane veterinaire anesthesie machine met 3-5% isoflurane en zuurstof debiet op 0,3 L/min. Als alternatief, gebruik ketamine/xylazine of een ander type intraperitoneale anesthesie. Evalueer de diepte van anesthesie met 2 methoden: teenknijpen en hoornvliesreflex.
- Prewet een 4-0 zijden hechting met naald in dubbel gedestilleerd water.
- Plaats de verdoofde muis in een supine positie op een piepschuim boord met het hoofd naar de chirurg en immobiliseren voorpoten en achterste ledematen met tape. Veeg de buik met isopropyl alcohol en snijd de buik langs de middellijn in een "T" vorm met schaar. Stop met bloeden rond de rand van de incisie door elektrocoagulatie (cauterizing).
- Duw de maag, jejunum en dikke darm aan de rechterkant van de buik om de abdominale aorta, vena cava, en gemeenschappelijke iliacale en iliolumbar slagaders en aders onthullen.
- Onder een dissectie microscoop, vinden en ligate de iliolumbar slagader / ader in de mannelijke, en eierstokslagader / ader en de iliolumbar slagader / ader in het vrouwtje met behulp van 4-0 zijden hechtingen(Figuur 2 gele lijnen).
- Onder een dissectiemicroscoop, lus twee 4-0 zijden hechtingen onder de abdominale aorta en inferieure vena cava (ongeveer 1 cm boven iliacale slagader en ader, 1 mm uit elkaar, figuur 2), en maak een losse knoop in de hechting het dichtst bij de iliacale vaten (Figuur 2, witte stippellijn). Als alternatief kan een 6-0 zijden hechting worden gebruikt voor deze knoop.
- Onder een dissectiemicroscoop, horizontaal uitlijnen en strekken zowel de inferieure vena cava en de abdominale aorta met porte-aiguille. Gebruik een 24 G gevleugelde afgeschermde infuuskatheter om de abdominale aorta te doorboren, druk op de knop om de naaldkern in te trekken en steek de katheter ongeveer 5 mm in het vat.
- Herhaal dezelfde procedure met de inferieure vena cava en bind knopen van beide hechtingen rond de kathetertijd.
OPMERKING: De naald kan gemakkelijk door het bloedvat prikken; houd daarom de vaten uitgerekt en naald parallel aan het vat. Trek de naaldkern in zodra de naald ongeveer 1 mm in het vat dringt. De abdominale aorta is onder de inferieure vena cava en veel dunner en elastischer als gevolg van wordt ingekapseld in bindweefsel. Daarom kan de aorta "vasthouden" aan de katheter, en moet dus worden katheterized vóór de vena cava om de kans op het uitglijden van de katheter te verminderen.
- Herhaal dezelfde procedure met de inferieure vena cava en bind knopen van beide hechtingen rond de kathetertijd.
- Breng instant lijm om de katheters immobiliseren aan de erector spinae, vervang de buikorganen, en het einde van de operatie met behoud van anesthesie.
OPMERKING: Organen die niet volledig kunnen worden vervangen in de buikholte moeten periodiek worden bevochtigd met perfusiemedium tijdens het perfusieproces.
3. Het perfusiesysteem instellen
- Breng de muis in de vochtige kamer met waterjas voorverwarmd tot 37 °C op een siliconenpad en immobiliseer de kathetervleugels op het pad met 19 G naalden.
- Vul het uiteinde van de slagaderdekatheter (inlaat) met voorverwarmde perfusiebuffer (Ringer's lactaatoplossing aangevuld met 5% BSA) en sluit het kathetereind aan met de inlaatperfusiebuis met behulp van een schroefconnector(Figuur 1B, rode pijl).
OPMERKING: Houd de connector met hemostatische tangen vast en immobiliseer de slang met tape om te voorkomen dat de katheters bewegen. - Pas de peristaltische stroomsnelheid aan op 0,6 mL/min en houd de perfusie-uitstroom(figuur 1B, blauwe pijl) gedurende 5-10 minuten open om het bloed door de veneuze katheter te wassen. Er zullen enkele stolsels in de uitlaatkatheter zitten; spoel de stolsels met perfusate buffer voor het sluiten van de perfusie circuit.
- Sluit het uiteinde van de veneuze katheter aan met de uitlaatbuizen met behulp van een schroefconnector om het circuit te sluiten (figuur 1B). Voer op dit moment CO2-gas euthanasie uit en controleer door punctie op de borst of een andere methode.
- Bedek de vochtige kamer met het opgewarmde deksel. Controleer het niveau van de perfusate periodiek en voeg meer indien nodig. Perfusie kan tot 2 uur worden uitgevoerd.
LET OP: 5 mL perfusate is nodig om het gesloten perfusiesysteem in te stellen. Als er geen lekken of oedeem is, zal het volume van het perfusaat met minder dan 1 mL afnemen en is extra buffer niet nodig. Om te voorkomen dat oedeem veroorzaakt door perifere circulerende trombus, perfusie buffer met 0,002% heparine kan worden gebruikt in de eerste 10 minuten van perfusie, maar moet worden veranderd in buffer zonder heparine om te voorkomen dat het lekken aan de rand van de incisies. - Voeg indien nodig op elk gewenst moment een reagens naar keuze toe in het perfusiereservoir of aan de injectiepoort(figuur 1B-5). Zo kan bijvoorbeeld 10 μL van 10 mg/mL Hoechst33342 in het perfusaat worden toegevoegd om de celkernen 2 uur vóór het einde van de perfusie te bevlekken, of 50 μL van 1 mg/mL DyLight 649-lectine om de vasculaire endotheelcellen 30 min vóór het einde van de perfusie te bevlekken.
OPMERKING: Als u probeert beenmerg te bevlekken met Hoechst-oplossing, moeten muizen 30 minuten voor de operatie vooraf worden geïnjecteerd. - Na perfusie met fluorescerende reagentia, uitwassen met perfusie buffer voor nog eens 10 minuten om de achtergrond fluorescentie te minimaliseren.
4. Analyse van geperfuseerde organen
- Verzamel organen, waaronder testis, prostaat, blaas, dijbeen, spier en huid (bijvoorbeeld voeten). Accijns een stuk orgel ongeveer 1 mm3 en plat tussen twee glazen dia's.
- Studie onder omgekeerde fluorescerende confocale microscoop met behulp van DAPI/Cy5 excitatie- en emissiefilters (excitatielasers : DAPI, 405 nm; Cy5.640 nm). Gebruik ten minste 200x vergroting doelstelling met een 0,45 numerieke diafragma.
- U de organen ook 4% formaldehydeoplossing voor 24 uur bevestigen en hematoxylin-eosine-kleuring19uitvoeren.
- Om een botvenster te creëren voor intacte beenmergobservatie, immobiliseer u beide uiteinden van het dijbeen of scheenbeen en schraap het corticale bot weg met de zijdelingse rand van een 19 G naald om het periosteum bloot te stellen; zorg ervoor dat u een dun laagje restbeen houdt. Plaats bot op een cover slip met het raam naar het glas en beeld met omgekeerde fluorescerende confocale microscoop met behulp van DAPI en Cy5 kanalen zoals hierboven beschreven. De cellen en het vasculaire netwerk in de beenmergholte kunnen gemakkelijk worden waargenomen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We hebben een gesloten circuit perfusiesysteem opgezet door cannulation van de abdominale aorta en de inferieure vena cava van 8-10 weken oude muizen terwijl het volume van de perfusiebuffer minder dan 10 mL blijft. Figuur 3A toont confocale beelden na het doorsbrengen van weefsels met Ringer's oplossing met Hoechst 33342 en DyLight 649-lectine. Spier,beenmerg, testis, blaas, prostaat, en voet huid tonen efficiënte nucleaire en vasculaire vlekken. Figuur 3B toon...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het beschreven circuit kan worden gebruikt om verschillende onderzoeksvragen te onderzoeken, bijvoorbeeld de rol van verschillende serumcomponenten en weefselbarrières bij de levering van geneesmiddelen, of immuun- en stamcelhandel. Verschillende systemen voor de levering van geneesmiddelen (bijvoorbeeld liposomen en nanodeeltjes) kunnen aan het perfusaat worden toegevoegd om de rol van fysiologische en biochemische factoren bij de levering te begrijpen. De duur van de perfusie kan variëren, afhankelijk van het onderzoch...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De studie werd ondersteund door de NIH subsidie CA194058 aan DS, Skaggs School of Pharmacy ADR seed grant program (DS); National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31771093), het Project of International Collaboration of Jilin Province (No.201180414085GH), de Fundamental Research Funds for the Central Universities, het Program for JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Aangepast als de perfisate container; maakt ook constante drukperfusie mogelijk |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | Houd de temperatuur van de kamer |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed vochtige kamer met deksel om de perfusate en de temperatuur van de muis te handhaven |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | Voer perfusate naar de canule in de vochtige kamer |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | Beheers de perfusiesnelheid |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | Circulerend waterbad voor alle water-jacketed componenten |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | Voor het immobiliseren van de Insyte Autoguard Winged naald en het krabben van het corticale bot |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter voor 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
Referenties
- Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125(2019).
- Kabagambe, S. K., et al. Combined Ex vivo Hypothermic and Normothermic Perfusion for Assessment of High-risk Deceased Donor Human Kidneys for Transplantation. Transplantation. 103 (2), 392-400 (2019).
- Knaak, J. M., et al. Technique of subnormothermic ex vivo liver perfusion for the storage, assessment, and repair of marginal liver grafts. Journal of Visualized Experiments. (90), e51419(2014).
- Hems, R., Ross, B. D., Berry, M. N., Krebs, H. A. Gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochemical Journal. 101 (2), 284-292 (1966).
- Nielsen, S., et al. Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin-CD water channels to plasma membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (4), 1013-1017 (1995).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Schreiter, T., et al. An ex vivo perfusion system emulating in vivo conditions in noncirrhotic and cirrhotic human liver. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (3), 730-741 (2012).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Viscous resistance to blood flow in solid tumors: effect of hematocrit on intratumor blood viscosity. Cancer Research. 49 (13), 3513-3519 (1989).
- Duyverman, A. M., et al. An isolated tumor perfusion model in mice. Nature Protocols. 7 (4), 749-755 (2012).
- Sears, H. F., et al. Ex vivo perfusion of a tumor-containing colon with monoclonal antibody. J Surg Res. 31 (2), 145-150 (1981).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Kristjansen, P. E., Boucher, Y., Jain, R. K. Dexamethasone reduces the interstitial fluid pressure in a human colon adenocarcinoma xenograft. Cancer Research. 53 (20), 4764-4766 (1993).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Geometric resistance to blood flow in solid tumors perfused ex vivo: effects of tumor size and perfusion pressure. Cancer Research. 49 (13), 3506-3512 (1989).
- Zhang, W. T., et al. Ex vivo Maintenance of Primary Human Multiple Myeloma Cells through the Optimization of the Osteoblastic Niche. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Di Buduo, C. A., et al. Modular flow chamber for engineering bone marrow architecture and function. Biomaterials. 146, 60-71 (2017).
- Lokerse, W. J. M., Eggermont, A. M. M., Grull, H., Koning, G. A. Development and evaluation of an isolated limb infusion model for investigation of drug delivery kinetics to solid tumors by thermosensitive liposomes and hyperthermia. Journal of Controlled Release. 270, 282-289 (2018).
- Tietjen, G. T., et al. Nanoparticle targeting to the endothelium during normothermic machine perfusion of human kidneys. Science Translational Medicine. 9 (418), (2017).
- Ternullo, S., de Weerd, L., Flaten, G. E., Holsaeter, A. M., Skalko-Basnet, N. The isolated perfused human skin flap model: A missing link in skin penetration studies. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 96, 334-341 (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, 4986(2008).
- Hekman, M. C., et al. Targeted Dual-Modality Imaging in Renal Cell Carcinoma: An Ex vivo Kidney Perfusion Study. Clinical Cancer Research. 22 (18), 4634-4642 (2016).
- Graham, R. A., Brown, T. R., Meyer, R. A. An ex vivo model for the study of tumor metabolism by nuclear magnetic resonance: characterization of the phosphorus-31 spectrum of the isolated perfused Morris hepatoma 7777. Cancer Research. 51 (3), 841-849 (1991).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
