Twee verschillende Real-Time Place Preference Paradigma's met behulp van Optogenetica binnen de Ventral Egmental Gebied van de Muis

Summary

Hier presenteren we twee gemakkelijk te volgen stapsgewijze protocollen voor plaatsvoorkeursparadigma's met behulp van optogenetica bij muizen. Met behulp van deze twee verschillende opstellingen, voorkeur en vermijding gedrag kan stevig worden beoordeeld binnen hetzelfde apparaat met een hoge ruimtelijke en temporele selectiviteit, en op een eenvoudige manier.

Abstract

Begrijpen hoe neuronale activering leidt tot specifieke gedragsoutput is fundamenteel voor de moderne neurowetenschappen. Door optogenetica bij knaagdieren te combineren met gedragstests in gevalideerde paradigma's, kan de meting van gedragsgevolgen bij stimulatie van verschillende neuronen in real-time met een hoge ruimtelijke en temporele selectiviteit, en dus de oprichting van causale relaties tussen neuronale activering en gedrag. Hier beschrijven we een stap-voor-stap protocol voor een real-time plaats voorkeur (RT-PP) paradigma, een aangepaste versie van de klassieke geconditioneerde plaats voorkeur (CPP) test. De RT-PP wordt uitgevoerd in een apparaat met drie compartimenten en kan worden gebruikt om te beantwoorden als optogenetische stimulatie van een specifieke neuronale populatie lonend of aversief is. We beschrijven ook een alternatieve versie van het RT-PP protocol, het zogenaamde neutral compartment preference (NCP) protocol, dat kan worden gebruikt om aversie te bevestigen. De twee benaderingen zijn gebaseerd op uitbreidingen van de klassieke methodologie afkomstig van gedragsfarmacologie en de recente implementatie van optogenetica binnen de neurowetenschappen. Naast het meten van plaatsvoorkeur in real time, kunnen deze opstellingen ook informatie geven over geconditioneerd gedrag. We bieden eenvoudig te volgen stapsgewijze protocollen naast voorbeelden van onze eigen gegevens en bespreken belangrijke aspecten waarmee we rekening moeten houden bij het toepassen van dit soort experimenten.

Introduction

De implementatie van optogenetica, een modern neurowetenschappelijk experimenteel instrument waarbij licht wordt gebruikt om neuronale activiteit te controleren, heeft in de afgelopen jaren geleid tot grote vooruitgang in het begrijpen hoe specifieke neuronale populaties gedrag^{beïnvloeden 1,2,3}. De uitstekende ruimtelijke en temporele selectiviteit van de optogenetica maakt het mogelijk om causale verbanden te leggen tussen excitatie of remming van celgroepen van belang en gedragsoutput^2,3. Ruimtelijke selectiviteit in de optogenetica wordt vaak gewaarborgd door het Cre-Lox-systeem waarbij de activiteit van Cre recombinase leidt tot een recombinatie van alle DNA-sequenties die aanwezig zijn tussen Lox-sites, de zogenaamde floxed allelen (geflankeerd door lox-sites)⁴. Het doel met het gebruik van de Cre-Lox systeem in optogenetica is het bereiken van expressie van alleles codering optogenetische opsinen in specifieke neuronen van belang, terwijl het verlaten van de omliggende neuronen verstoken van expressie. Opsins zijn lichtgevoelige eiwitten die bij lichtstimulatie van specifieke golflengte ionenstroom toestaan die neurale prikkelbaarheid beïnvloedt of cellulaire functies beïnvloedt door downstream-effectortrajecten te moduleren. Nieuwe varianten van opsins die verschillen in actie (excitatory, remmend, modulatorisch), mechanisme, activering door licht golflengte en kinetiek eigenschappen⁵ worden voortdurend ontwikkeld om te voldoen aan de behoeften van specifieke experimentele benaderingen. Met betrekking tot prikkelbaarheid, met behulp van een depolariserende of hyperpolariserende opsin dicteert de activiteit van de neuronen (opwinding of remming, respectievelijk) op lichtstimulatie op een specifieke golflengte geleverd in de hersenen³.

Selectieve promotor activiteit stuurt de uitdrukking van Cre recombinase naar de neuronen van belang. Door de uitvoering van een floxed allel van de opsin van belang, Cre-gemedieerde recombinatie zal ervoor zorgen dat de opsin selectief wordt uitgedrukt in neuronen die co-express Cre recombinase^3,6. Dit gebruik van dubbele transgenics om ruimtelijke selectiviteit te sturen is zeer efficiënt gebleken in de optogenetica. Dus, terwijl lichtstimulatie om de opsins te activeren in grote lijnen wordt geleverd via een intracerebrale geïmplanteerde optische vezel aangesloten op een lichtbron (LED of laser)³, alleen neuronen uitdrukken zowel Cre recombinase en de floxed opsin allel zal reageren op deze stimulatie. Het Cre-Lox-systeem bij knaagdieren kan op verschillende manieren worden bereikt door alleen transgenics te gebruiken (zowel Cre recombinase als de floxed opsinconstructie worden gecodeerd bij transgene dieren), alleen virale injecties (DNA-constructies voor Cre recombinase en de floxed opsin worden beide geleverd via een virale drager), of een combinatie van de twee (bijvoorbeeld, Cre recombinase wordt gecodeerd door een transgeen dier dat wordt geïnjecteerd met een virus dat de floxed opsinconstructie draagt)⁵. De floxed opsin DNA constructie wordt meestal gekloond in frame met een reporter gen om visualisatie van Cre-gemedieerde recombinatie in weefselsecties mogelijk te maken. Terwijl optogenetica kan ook worden uitgevoerd bij ratten, de gepresenteerde protocollen zijn gegenereerd voor muizen. Voor de eenvoud zullen muizen die zowel Cre recombinase als de floxed opsin dragen, "optogeneticamuizen" worden genoemd. In de onderstaande protocollen zijn optogeneticamuizen gegenereerd door een gemengde transgene (Cre recombinase onder controle van twee verschillende promotors) en viraal (met behulp van een adeno-geassocieerd virus, AAV, om de floxed opsin DNA-constructie te leveren - in ons geval ChR2/H134R) aanpak. Het verkrijgen en onderhouden van transgene muislijnen is een essentieel onderdeel van de methodologie. Cre-driver en floxed opsin transgene muizen kunnen worden geproduceerd voor elk doel, of gekocht indien commercieel beschikbaar, net als een reeks van virussen die DNA-sequenties codering Cre recombinase en floxed opsins in verschillende vormen.

Optogenetica in combinatie met gedragstests heeft bewezen een waardevol hulpmiddel te zijn om de rol van verschillende hersengebieden, of discrete neuronale populaties, in bepaalde soorten gedrag te bestuderen. In de context van beloningsgerelateerd gedrag heeft optogenetica de verificatie van eerdere bevindingen op het gebied van gedragsfarmacologie en experimentele psychologie mogelijk gemaakt, en ook een nieuw niveau van spatio-tijdelijk relevante dissectie mogelijk gemaakt in hoe bepaalde neuronen gedrag beïnvloeden. Een methode die is gebruikt in verschillende studies om beloning-gerelateerd gedrag te beoordelen is een aangepaste versie van de klassieke methode bekend als Conditioned Place Preference (CPP). Klassieke CPP is gebruikt om de lonende of aversieve eigenschappen van drugs van misbruik te beoordelen door hun vermogen om Pavlovassociaties te induceren met signalen van het milieu^7,8. In Pavlovtermen is het medicijn een ongeconditioneerde stimulus, omdat het een aanpak of terugtrekking kan uitlokken als het respectievelijk lonend of aversief is. Continue koppeling van het medicijn met verschillende neutrale stimuli, die zelf geen reactie uitlokken, kan leiden tot aanpak of terugtrekking alleen bij presentatie van het voorheen neutrale, maar na het koppelen, zogenaamde geconditioneerde stimuli⁹. CPP-analyse wordt meestal uitgevoerd in een apparaat met twee compartimenten van dezelfde grootte, maar waar elk compartiment wordt gedefinieerd door verschillende kenmerken, zoals vloertextuur, wandpatronen en verlichting (neutrale stimuli). De twee compartimenten zijn met elkaar verbonden door een gang of een opening tussen de compartimenten. Tijdens conditionering, het onderwerp, meestal een klein knaagdier, ontvangt passieve injecties van een geneesmiddel, terwijl beperkt tot een van de twee belangrijkste compartimenten en zout, terwijl beperkt tot het andere compartiment. De lonende effecten van het medicijn worden vervolgens beoordeeld in een drugsvrije sessie wanneer het onderwerp het hele apparaat vrij mag verkennen. De hoeveelheid tijd doorgebracht in de eerder drug-paired compartiment (de geconditioneerde reactie) wordt beschouwd als Pavlovian leermechanismen gemediet tussen de lonende effecten van het geneesmiddel en de signalen van het compartiment in verband met de toediening(geconditioneerde stimuli) weerspiegelen. Als het dier meer tijd doorbrengt in het gedrug-gekoppelde compartiment, heeft het medicijn een geconditioneerde plaatsvoorkeur geïnduceerd, wat betekent dat het lonende effecten op gedrag heeft. Aan de andere kant, als het medicijn als aversie wordt ervaren, zal het dier het met drugs gepaarde compartiment vermijden en meer tijd doorbrengen in het zoutgekoppelde compartiment, wat aangeeft op geconditioneerde plaatsaversie (CPA)^8,9,10,11.

Aangezien optogenetica kan worden geïmplementeerd om neuronale activiteit in "real-time" te controleren, het gebruik van een gedragsparadigma vergelijkbaar met, maar onderscheiden van, de CPP setup zorgt voor het meten van plaats voorkeur op directe neuronale activering. Optogenetica-gedreven analyse van plaatsvoorkeur wordt daarom vaak aangeduid als een real-time plaatsvoorkeur (RT-PP) analyse paradigma. In het RT-PP paradigma vervangt optogenetische stimulatie van verschillende neuronen via het Cre-Lox-systeem de systemische levering van een geneesmiddel uitgevoerd in het klassieke CPP, zodat het RT-PP-paradigma in plaats daarvan meet of optogenetisch geïnduceerde neuronale stimulatie gezien als lonend of aversief. De huidige beschrijving zal zich richten op optogenetica muizen, maar ook optogenetica ratten kunnen worden getest met behulp van soortgelijke protocollen.

In plaats van conditionering naar een compartiment op een moment als in de klassieke CPP paradigma, de optogenetica muis in de RT-PP paradigma is toegestaan om vrij te bewegen in het hele apparaat en gedrag wordt opgenomen gedurende de sessie. Toegang tot een van de compartimenten is gekoppeld aan intracraniale lichtstimulatie. Onder de juiste lichtstimulatieparameters worden neuronen die een excitatory opsin uitdrukken, daardoor geactiveerd. Als de lichtstimulatie als lonend wordt ervaren, blijft de optogeneticamuis in het lichtgekoppelde compartiment, terwijl als de lichtstimulatie als aversief wordt ervaren, de muis het compartiment verlaat om aan de stimulatie te ontsnappen. Dit type analyse maakt het mogelijk voor de beoordeling van voorwaardelijke leren: Het onderwerp kan leiden tot lichtstimulatie en dus neuronale activering door het invoeren van een compartiment, en stop de stimulatie door het verlaten van het compartiment, vergelijkbaar met hendel-drukken tijdens een instrumentale taak. Bovendien kunnen associatieve leermechanismen worden beoordeeld tijdens volgende sessies waarin de tijd die in elk compartiment wordt doorgebracht wordt gemeten zonder stimulatie. Op deze manier kan de onderzoeker zich distantiëren tussen de onmiddellijk lonende effecten op stimulatie van de neuronen van belang en de associatieve geheugenvorming gerelateerd aan het¹².

In de huidige studie beschrijven we twee stapsgewijze installatieprotocollen voor optogenetica-gedreven plaatsvoorkeursgedrag van vrij bewegende muizen. Het eerste protocol beschrijft RT-PP binnen een apparaat met drie compartimenten en is beschreven op basis van de protocollen die onlangs door Root en collega's¹³ en andere auteurs^{12,14,15,16,17,18}. Het experiment bestaat uit twee fasen bestaande uit verschillende dagelijkse sessies (weergegeven in figuur 1A). Elke sessie is ontworpen voor verschillende doeleinden en de parameters van koppelingstimulatie met een compartiment worden dienovereenkomstig gewijzigd. De eerste sessie, de "Pretest", wordt gebruikt om de eerste voorkeur van het onderwerp te beoordelen op een van de compartimenten. Terwijl het onderwerp is aangesloten op het patchkoord, mag het apparaat vrij verkennen zonder stimulatie gedurende 15 min. Als de initiële voorkeur voor een compartiment meer dan 80% is, wordt de muis uitgesloten van de analyse, omdat de eerste zijbias de analyse kan scheeftrekken. Na de "Pretest", begintfase 1. Het eerste deel bestaat uit twee opeenvolgende, dagelijkse, 30 min sessies van "RT-PP". Tijdens "Fase 1" wordt de optogeneticamuis via het patchkoord verbonden met de laserbron en in de arena geplaatst om deze vrij te verkennen. De muis krijgt intracraniële laserstimulatie bij binnenkomst in een van de hoofdcompartimenten. Pilot experimenten kunnen worden uitgevoerd om te bepalen welk compartiment zal worden toegewezen als laser-paired en die als ongepaard. Als blijkt dat de stimulatie lonend is, wordt de laser gekoppeld aan het minst geprefereerde compartiment tijdens de "Pretest" en aan de meest geprefereerde als de stimulatie aversief is. Zo volgt het gepresenteerde RT-PP-protocol een bevooroordeeld ontwerp in de zin dat laserstimulatie niet willekeurig wordt toegewezen aan een van de twee hoofdcompartimenten (onbevooroordeeld ontwerp), maar wordt gekozen om een eerste voorkeur van de muis te vermijden. De toegang tot het andere hoofdcompartiment of het neutrale compartiment dat de twee hoofdcompartimenten met elkaar verbindt, leidt niet tot intracraniële lichtstimulatie en is dus niet licht gekoppeld. Deze sessies zorgen voor real-time beoordeling van de lonende of aversieve eigenschappen van stimulatie van specifieke neuronale populaties. Op de laatste dag van" Fase 1" vindt een 15 min sessie zonder enige stimulatie plaats. Deze sessie dient om geconditioneerde reacties ("CR") aan te pakken die het gevolg zijn van associatief leren tussen de stimulatie en de omgeving waar het werd ontvangen. Ten minste drie dagen na "Fase 1" vindt de "Reversal Phase" plaats die dezelfde structuur volgt als " Fase1", maar het voorheen niet-gekoppelde hoofdcompartiment is nu gekoppeld aan lichte stimulatie. Zoals in het geval van "Fase 1", worden de twee stimulatiesessies gevolgd door een "CR"sessie. De "Reversal Phase" wordt gebruikt om te bevestigen dat het gedrag van de muis afhankelijk is van optogenetische stimulatie en niet gerelateerd is aan willekeurige parameters. Elke sessie van het RT-PP experiment moet apart geprogrammeerd worden binnen de tracking software. Het huidige protocol beschrijft dergelijke instellingen binnen een specifieke software, maar alle andere tracking software in staat om transistor-transistor-logic (TTL) modulatie signalen te sturen naar de lichtbron kan worden gebruikt.

Het tweede protocol beschrijft een nieuwe setup aangeduid als de Neutrale Compartiment Voorkeur (NCP) paradigma. Dit gewijzigde protocol van de RT-PP maakt gebruik van de kleine omvang en transparantie van de verbindingscorridor die door de muis natuurlijk wordt vermeden vanwege de smalle en transparante samenstelling. Door beide hoofdcompartimenten te koppelen aan lichtstimulatie en de gang alleen vrij te laten van lichtstimulatie, kan de NCP-opstelling worden gebruikt om te testen of de optogenetische stimulatie de muis zal dwingen om meer tijd in de gang door te brengen om te voorkomen dat hij optogenetische stimulatie. Door de tijd die in de twee lichtgekoppelde compartimenten wordt doorgebracht te vergelijken met de tijd die in de gang wordt doorgebracht, kan een verificatie van optogenetisch veroorzaakte aversie worden gemaakt. Het NCP-experiment bestaat uit twee opeenvolgende dagelijkse sessies waarbij optogeneticamuizen stimulatie (elk 30 min) krijgen om de voorkeur in real-time te meten, en één laservrije sessie (15 min) om geconditioneerde reacties op dezelfde manier te beoordelen als die in de RT-PP Protocol.

De RT-PP en NCP protocollen hieronder werden onlangs gevalideerd in ons lab in de studie van hoe verschillende soorten neuronen gelegen in de ventrale tegmental gebied (VTA) zijn betrokken bij verschillende aspecten van beloning-gerelateerd gedrag¹². Hier, om de implementatie van de RT-PP en NCP protocollen, dopamine transporter (DAT)-Cre¹⁹ en vesicular glutamaat transporter 2 (VGLUT2)-Cre²⁰ transgene muizen stereotactisch geïnjecteerd met AAV het dragen van een floxed channelrhodopsin2 (ChR2) DNA-constructie in de VTA waarna een glasvezel werd geïmplanteerd boven de VTA. Gedragsreacties verkregen bij analyse van deze muizen met behulp van de meegeleverde RT-PP en NCP protocollen laat zien hoe activering van dopaminerge en glutamatere neuronen binnen de VTA leidt tot verschillende gedragsreacties(figuur 1).

Stap-voor-stap protocollen voor RT-PP en NCP paradigma's worden voorzien van informatie variërend van genotyping van transgene muizen, stereotaxic virale injecties en fiberoptic afstandsbediening, tot het programmeren van tracking software voor laser-controle en gedragsgedrag Beoordeling. Daarnaast worden suggesties voor wijzigingen van het protocol besproken op het gebied van stimulatieparameters en experimentele aspecten die van invloed kunnen zijn op de wetenschappelijke uitkomst. Hoewel protocollen worden beschreven in de context van de VTA, kunnen ze worden toegepast op elk hersengebied of neuronale populatie, mits de relevante optogeneticatools, zoals relevante Cre-driver en floxed opsins, beschikbaar zijn.

Protocol

Deze studie is uitgevoerd met behulp van heterozygoot DAT-Cre¹⁹ en VGLUT2-Cre²⁰ muizen van beide geslachten, gerijpt >8 weken en wegen >20 g. Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de Zweedse (Animal Welfare Act SFS 1998:56) en wetgeving van de Europese Unie (Verdrag ETS 123 en Richtlijn 2010/63/EU) met toestemming van de lokale partijvoor ethische comités voor dieren.

1. Genotypering van muizen

1. Neem oorbiopten met behulp van een oor puncher te gebruiken voor genotypering van de transgene muizen.
2. Bereid de oorstoten voor om een polymerase kettingreactie (PCR) reactie uit te voeren met behulp van speciaal gemaakte primers.
   OPMERKING: In dit protocol werden Cre-gerichte primers gebruikt.
   1. Voeg 75 μL lysisbuffer (buffer 1: 250 mM NaOH, 2 mM EDTA) toe in elke 1,5 mL-buis met een oorstoot.
   2. Incubeer in een verwarmingsblok bij 96 °C gedurende 30 min.
   3. Laat de monsters 5 min afkoelen en voeg vervolgens 75 μL van de neutralisatiebuffer toe (buffer 2: 400 mM Tris-HCl pH 8.0).
3. Pcr uitvoeren volgens standaardprocedures^12,21 met behulp van de juiste primers (hier: Cre FW 5'-ACGAGTGATGAGGTTCGCAAGA-3', Cre REV 5'-ACCGACGATGAAGCATGTTTAG-3').
   LET OP: Werk op ijs onder een PCR kap en let op niet te vervuilen de reagentia en de monsters.
   1. Bereid de PCR master mix voor. Vermenigvuldig de volgende volumes op basis van het aantal monsters dat zal worden geanalyseerd, inclusief geschikte controlemonsters. Meng de reagentia voor een enkele 25 μL eindvolumereactie in de volgende volgorde: gedestilleerd water (18,9 μL), 10x buffer met MgCl₂ (2,5 μL), 10 mM dNTP-mix (0,5 μL), 10 μM voorwaartse primer (1 μL), 10 μM omgekeerde primer (1 μL), 5 U/μL DNA polymerase (0,1 μL) en sjabloon-DNA (1 μL); worden toegevoegd in de volgende stappen).
      OPMERKING: Voeg altijd een negatieve, een positieve en een lege (zonder sjabloon DNA) controle om geldige resultaten te garanderen.
   2. Voeg 24 μL mastermix toe in PCR-buizen.
   3. Voeg 1 μL template DNA (afkomstig van de oorstoot van elke muis) toe aan elke PCR-buis.
   4. Centrifugeer de PCR-buizen kort om ervoor te zorgen dat het sjabloon-DNA zich in de mastermix bevindt.
   5. Voer PCR uit met een thermische fietser met behulp van het fietsprogramma in tabel 1.
4. Bereid een agarose gel om de monsters uit te voeren met behulp van elektroforese.
   OPMERKING: De grootte is afhankelijk van het aantal monsters dat moet worden geanalyseerd.
   1. Voeg 1% w/v agarosepoeder toe in 1x Tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer in een glazen fles. Verwarm in de magnetron tot de agarose volledig is opgelost en controleer regelmatig of het niet overkookt.
      LET OP: Neem voorzorgsmaatregelen om brandwonden te voorkomen.
   2. Laat de gel afkoelen tot ongeveer 50 °C en voeg een nucleïnezuurgelvlek (0,5 μL/50 mL gel) toe.
   3. Giet de gel in de gietplaat met goed kammen en laat het op kamertemperatuur totdat het volledig gestold wordt. Verwijder de kammen voorzichtig.
   4. Vul de elektroforesetank met 1x TAE buffer en plaats de gel in de tank.
   5. Voeg 2 μL 1x DNA-belastingskleurstof toe in elk van de DNA-monsters.
   6. Laad 4 μL DNA-ladder in de eerste put van de gel en laad vervolgens het volledige volume van de monsters in de resterende putten.
   7. Stel de krachtbron van de elektroforese in op 140 V en ren 25-30 min.
   8. Plaats de gel onder een UV-bron en maak een foto van de resultaten.

2. Stereotaxic chirurgie

1. Na genotyping, aparte muizen houden degenen positief voor Cre. Wacht tot ze minstens 8 weken oud zijn en weeg >20 g om een operatie uit te voeren.
   1. Sanitize het milieu en steriliseren van de chirurgische instrumenten om een operatie uit te voeren onder aseptische omstandigheden.
   2. Injecteer de muizen onderhuids met pijnstillende 30 minuten voor de operatie.
   3. Verdoven de muizen met isoflurane (2−3% in normale lucht voor inductie en 1,5−2,0% voor het behoud van anesthesie). Zorg ervoor dat voldoende anesthesie niveau wordt bereikt door het testen van de afwezigheid van pijnreflexen door zachtjes knijpen de teen van de muis. Pas de isoflurane levering dienovereenkomstig aan.
   4. Plaats de muis op het stereotaxic apparaat. Voeg oogsmeermiddel toe om oogletsel als gevolg van droogte te voorkomen en scheer het haar van de bovenkant van de schedel. Gebruik een verwarmingskussen om de temperatuur van de muis stabiel te houden.
   5. Injecteer 100 μL plaatselijke verdoving onder de huid van de schedel en laat 5 min in werking treden.
   6. Bereid de incisie plaats door drie cirkelvormige toepassingen van alcohol of steriele zoutoplossing afgewisseld met jodium. Gebruik een steriele katoenen punt en start de toepassing van de incisielijn, naar buiten.
   7. Til de huid voorzichtig op met tangen en maak een incisie van ~ 1,5 cm langs de rostrocaudal-as met chirurgische schaar om het oppervlak van de schedel te onthullen.
   8. Breng met behulp van een wattenstaaf h₂O_2-oplossing aan om het periosteum te verwijderen.
   9. Spoel de schedel met steriele zoutoplossing en droog het met behulp van steriele katoenen tip applicators.
   10. Zoek de bregma en lambda.
   11. Controleer de uitlijning van de platte schedel door de punt van de injectienaald, aangepast op het stereotaxic frame, op bregma en lambda te plaatsen. Meet de ventrale coördinaten voor elke positie en vergelijk. Wanneer de schedel plat is, is de ventrale coördinaat voor zowel bregma als lambda identiek. Zo niet, pas dan de hoofdpositie aan en doe de metingen opnieuw.
   12. Zoek en markeer de positie (AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm van bregma volgens Franklin en Paxinos²²) waar de injectie van het Cre-afhankelijke virus en de implantatie van de glasvezel zal plaatsvinden en maak een klein gat met behulp van een micro boor.
   13. Laad 400 nL virus in de 10 μL spuit gemonteerd op het stereotaxic apparaat met behulp van een precisiepomp.
   14. Laat de naald (34 G, afgeschuind) voorzichtig zakken en injecteer 300 nL cre-afhankelijk optogenetisch virus (AAV5-EF1a-DIO-ChR2(H134)-eYFP [5,6 x 10 12/mL]) in de VTA (AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm van bregma en -4,4 mm van het oppervlak van de schedel, volgens Franklin en Paxinos²²) bij 100 nL/min injectiesnelheid met behulp van de precisiepomp.
   15. Laat de naald na injectie 10 min extra op zijn plaats staan om verspreiding van het virus mogelijk te maken (figuur 2A).
   16. Trek de naald langzaam van de injectieplaats in.
   17. Maak kleine gaatjes met behulp van een microdrill te verankeren schroeven die de optische vezel en tandheelkundige cement complex zal stabiliseren.
   18. Neem de bregma-coördinaten opnieuw en implanteer de glasvezel (200 μm diameter, 0,37 NA) bij: AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm van bregma en -4,0 mm van het oppervlak van de schedel (figuur 2B) volgens Franklin en Paxinos²².
   19. Zet de vezel op de schedel met behulp van tandcement. Breng voldoende cement rond de glasvezel ferule om het vast te stellen aan de schedel, maar aandacht besteden aan 3−4 mm van de bovenkant van de ferule vrij van cement te laten om aansluiting van de patch koord mogelijk te maken (Figuur 2C).
       LET OP: Let op dat je het gat niet vult met cement, omdat dit hersenschadeschade kan veroorzaken. Hemostatische materialen kunnen in het gat worden toegevoegd om dit te voorkomen.
   20. Gebruik weefsellijm of opneembare hechtingen om een open wond te sluiten en laat het dier minstens twee weken herstellen. Geef na de operatie een extra dosis pijnstillende 12-24 uur.

3. Het instellen van de besturing van de laserbron

1. Gebruik microcontrollers met één bord om de laserbron te controleren. Schrijf een script met de juiste software. Laad het script op het microcontrollerbord met de juiste verbindingskabel naar de computer.
   OPMERKING: Het script moet externe modulatie (input) afkomstig van de trackingsoftware via een TTL-box bevatten en een uitvoer naar de laser om stimulatieparameters te controleren. Gebruik voor 10 ms pulsbreedte op een frequentie van 20 Hz het script in het supplementale coderingsbestand.
2. Sluit het bord aan op de laser en de TTL box van de tracking hardware.
   1. Gebruik een netwerkkabel om het TTL-vak aan te sluiten op het bord (pin 5 voor het meegeleverde script) (figuur 3A,C).
   2. Zorg ervoor dat de laser is ingesteld om te bedienen door externe modulatie en sluit de laser aan op het bord met behulp van een FC / PC-kabel (pin 13 voor het gegeven script) (Figuur 3B,C).
   3. Sluit de juiste pinnen aan op gronddelen van het bord.
3. Sluit de laserbron aan op de glasvezel.
   1. Sluit de laserbron aan op een roterende verbinding(figuur 3D).
   2. Sluit een patchkoord(figuur 3E)aan op het draaigewricht.
   3. Stabiliseer het roterende gewricht boven het apparaat, maar buiten het opnamegebied. Zorg ervoor dat de lengte van het glasvezelpatchsnoer geschikt is om de muis zonder problemen in de arena te laten bewegen(figuur 3F).

4. Het opzetten van het experiment voor de RT-PP aanpak binnen de tracking software

1. Kalibreer de arena setup. Gebruik een liniaal om een specifiek deel van het fysieke apparaat te meten, een lijn te tekenen die overeenkomt met het deel dat is gemeten op de afbeelding in de software onder het tabblad Schaal tekenen om te kalibreren en voer de reeds bekende waarde in (stap 1 in figuur 4).
2. Ontwerp de arena. Teken het gebied waar de beweging van de muizen wordt geregistreerd (stap 2 in figuur 4).
3. Maak de zones. Teken de zones die uiteindelijk zullen worden toegewezen als lasergekoppeld, laser-unpaired en "neutraal" (stap 3 in figuur 4).
4. Valideer de installatie om te bevestigen dat er geen conflicterende parameters zijn, bijvoorbeeld zones buiten de arena (stap 4 in figuur 4)
5. Stel de experimentele parameters in onder de instellingen voor het besturingselement voor de tabtrial (stap 5 in figuur 4).
   1. Stel de proefperiode in zoals weergegeven in stap 1 in figuur 5 voor een RT-PP-sessie van 30 min.
   2. Zorg ervoor dat "hardware controle" is ingeschakeld, wijzen een compartiment als laser-paired waarin de invoer van de muis zal leiden tot een TTL signaal via de tracking software aan de microcontroller boord. In figuur 5 (stap 2) is het gelaserde compartiment vak A. Schakel voor de omkeringsfase de compartimenten om, zodat compartiment B wordt gelaserd en compartiment A wordt ontkoppeld. Dit doe je door A te vervangen door B en B met A in de software.

5. Wijziging van de opstelling om de aversieve eigenschappen van de stimulatie te testen met behulp van de NCP-aanpak

1. Volg stap 4.1−4.4 zoals eerder beschreven.
2. Stel de tijd van het experiment in op 30 minuten via de optie 'Tot herhalen' in de vakinstellingen 'Referentie' (stap 1 in figuur 6).
3. Wijs zowel A- als B-zones toe als lasergekoppeld (stap 2 in figuur 6)door "wanneer het middelpunt zich in een van zone A- en zone B bevindt" toe te voegen voor het conditievak met betrekking tot de instellingen voor A- en B-compartimenten. Houd er rekening mee dat de laser wordt uitgeschakeld wanneer het dier zich in het neutrale compartiment bevindt.

6. Het uitvoeren van een experiment met behulp van laserstimulatie

1. Stel de detectie-instellingen in.
   1. Gebruik een dummy om op de muis te lijken om de juiste detectie-instellingen te garanderen.
   2. Plaats de dummy in één compartiment van het apparaat en gebruik geautomatiseerde opstelling met dynamische aftrekking.
   3. Verwijder de dummy en plaats deze in het tegenovergestelde compartiment. Zorg ervoor dat de dummy volledig is gedetecteerd en zo niet, pas de instellingen via de software aan om de juiste detectie te bereiken.
      1. Tijdens deze stap ook controleren of de stimulatie werkt zoals het hoort. Begin met acquisitie met behulp van de eerder geconfigureerde instellingen voor trial control en plaats de dummy in het lasergekoppelde compartiment en kijk of de stimulatie wordt geactiveerd zoals het hoort. Plaats de dummy vervolgens in het ongepaarde en/of het neutrale compartiment en kijk of de stimulatie wordt gestopt.
2. Gebruik een vermogensmeter met een sensor om de laserkracht op 10 mW in te stellen met behulp van de knop op de laser(figuur 3B). Voer deze stap uit elke keer dat laserstimulatie wordt gebruikt.
   LET OP: Gebruik beschermende oogapparatuur als directe blootstelling aan laserlicht kan blijvende oogschade veroorzaken.
3. Plaats de muis in het apparaat.
   1. Haal de muis voorzichtig uit zijn kooi en sluit het glasvezelimplantaat aan op het glasvezelpatchkoord met behulp van een keramische hoes.
   2. Plaats de muis voorzichtig in het neutrale compartiment van het apparaat met drie compartimenten.
   3. Wacht tot de muis wordt gedetecteerd door de software.
   4. Verwijder de verticale schuifdeuren die het dier beperken om de hoofdcompartimenten binnen te gaan.
   5. Laat het dier vrij verkennen zonder enige verstoringen.
      OPMERKING: Dezelfde procedure wordt gevolgd wanneer het dier geen stimulatie ontvangt, met uitzondering van het feit dat stap 6.2 niet nodig is en dat de laser de hele tijd uit is.

Results

Het driecompartimenterende apparaat (figuur 3F) is geschikt om de lonende effecten van geneesmiddelen aan te pakken en om in real time de lonende of aversieve eigenschappen van directe stimulatie van neuronen met behulp van optogenetica te beoordelen. Het bestaat uit twee hoofdcompartimenten (20 cm [W] x 18 cm [L] x 25 cm [H]) en één kleiner verbindingscompartiment (20 cm [W] x 7 cm [L] x 25 cm [H]). De belangrijkste compartimenten hebben verschillende wand- en vloertextuur en -patronen om associatief leren te vergemakkelijken, terwijl het verbindings/neutrale compartiment smal en transparant is, zodat de muizen er natuurlijk minder tijd in doorbrengen. Zoals hierboven beschreven, kan de tracking software worden gebruikt om verschillende gedragsparameters van de muizen op te nemen, waaronder beweging en tijd doorgebracht in elk compartiment, en om de laserstimulatie te controleren. Het hele RT-PP-experiment vindt plaats gedurende 8 sessies(figuur 1A)en maakt zowel de beoordeling van de lonende of aversieve eigenschappen van de directe stimulatie (dagen 3, 4, 6 en 7) als de vorming van associaties, positief of negatief, mogelijk in reactie op eerdere ervaringen (dagen 5 en 8, "CR").

Ten eerste testten we DAT-Cre muizen geïnjecteerd met AAV-ChR2-eYFP virus in de VTA om dopaminerge neuronen te richten. In overeenstemming met de literatuur, we merkten op dat de muizen liever tijd doorbrengen in het compartiment in combinatie met de stimulatie (Figuur 1B, fase 1, dagen 3 en 4, blauwe cirkels, tweeweg herhaalde maatregelen [RM] analyse van variantie [ANOVA], effect van compartiment F_(2,18) = 141, p < 0,001; effect van sessie x F_{compartiment (12.108)} = 42,1, p < 0,001; Tukey's post hoc test gekoppeld vs unpaired p < 0,001). De omkeringsfase, waarbij de koppeling van de compartimenten aan laserstimulatie werd verwisseld, bevestigde deze waarnemingen(figuur 1B, dagen 6 en 7, blauwe cirkels, tukey's post hoc test gekoppeld vs ongepaardcompartiment p < 0,001) waardoor de mogelijkheid werd uitgesloten dat de resultaten verkregen uit fase 1 verband hielden met zijbiases of willekeurige parameters. Gemiddeld de tijd doorgebracht in elk compartiment tijdens de vier dagen van RT-PP bevestigd dat de muizen gemiddeld ongeveer 70% van hun tijd doorgebracht in de laser gekoppeld compartiment in tegenstelling tot de ongepaarde (~ 20%) en de neutrale (~10%) compartimenten (Figuur 1B bar grafiek, one-way RM ANOVA, effect van stimulatie F_(2,6) = 139, p < 0,001, Tukey's post hoe gekoppeld vs unpaired en neutrale compartimenten p < 0,001). Bovendien, bij afwezigheid van stimulatie, op dag 5 en 8, brachten de muizen aanzienlijk meer tijd door in het compartiment dat eerder gepaard ging met laserstimulatie (Tukey's post hoc p < 0,001), wat aangeeft dat de eerdere ervaring voldoende was om associatief leergedrag te induceren dat als "zoeken" van de stimulatie werd weerspiegeld. Deze gegevens zijn in overeenstemming met de literatuur en tonen aan dat de huidige methode betrouwbaar kan worden gebruikt om de lonende effecten van optogenetische stimulatie van specifieke neuronale populaties in de VTA te onderzoeken.

Vervolgens testten we VGLUT2-Cre muizen geïnjecteerd met AAV-ChR2-eYFP in de VTA zoals hierboven, om glutamatergic neuronen van de VTA te richten. In dit experiment zagen we een tegenovergesteld gedragsfenotype van het ene dat door de DAT-Cre muizen werd aangetoond. Zo vermeden de muizen het compartiment gekoppeld aan de stimulatie en brachten meer tijd in de ongepaarde tijdens alle RT-PP dagen (Figuur 1C links, twee-weg RM ANOVA, effect van compartiment F_(2,12) = 40,9, p < 0,001; effect van sessie x compartiment F_(12,72) = 16,1, p < 0,001; Tukey's post hoc test gekoppeld vs unpaired p < 0,001; Figuur 1C rechts, eenrichtings RM ANOVA-effect van stimulatie F_(2,6) = 162, p < 0,001, Tukey's post hoc gekoppeld vs ongepaarde en neutrale compartimenten p < 0,001). Interessant is dat tijdens de "CR" dagen 5 en 8, de muizen niet een duidelijke vermijding van de eerder gekoppelde compartiment (geen verschillen tussen gekoppelde en ongepaarde compartimenten). Het is mogelijk dat het gebrek aan geconditioneerde respons te wijten is aan onvoldoende tijd doorgebracht in de laser gekoppeldcompartiment, die de vorming van associaties tussen laser activering en de bijzondere omgeving waar dat plaatsvond verhinderd. Om dit vermijden van fenotype verder te onderzoeken, gebruikten we een aangepast protocol dat we "neutrale compartimentvoorkeur" noemden, afgekort NCP. In dit experiment werden beide hoofdcompartimenten aan stimulatie gekoppeld en bleef het neutrale compartiment stimulatievrij (figuur 7A). We veronderstelden dat, als de stimulatie aversieve eigenschappen heeft, de muis gedwongen zal worden om tijd door te brengen in het kleinere, neutrale compartiment, om het te vermijden. In beide dagen van stimulatie (Stim1 en Stim2) brachten de muizen het grootste deel van de tijd door in het neutrale compartiment (ongeveer 80%) in vergelijking met de gekoppelde compartimenten (figuur 7B,C; links: tweerichtings RM ANOVA-effect van compartiment F_(2,8) = 70,9, p < 0,001; effect van sessie x compartiment F_(4,16) = 6,9, p = 0,002, Tukey's post hoc "Stimulation 1" neutral compartiment vs compartment 1 en 2 p < 0,01, "Stimulation 2" neutraal compartiment vs compartiment 1 en 2 p < 0,001; rechts: one-way RM ANOVA, effect van stimulatie F_(2,2) = 54,2, p = p = 0.018, Tukey's post hoc test gekoppeld 1 en 2 vs neutrale p < 0,05). Zoals in het geval van "CR" dagen tijdens de RT-PP test, leken de muizen geen negatieve associaties te vormen tussen de compartimenten en de stimulatie; dat wil zeggen, bij afwezigheid van stimulatie (CR), onderzochten ze alle compartimenten in dezelfde mate (figuur 7B, geen verschillen tussen de tijd doorgebracht in gekoppelde compartimenten en neutrale compartiment). De resultaten van deze experimenten bevestigden het gedragsfenotype dat tijdens de RT-PP-installatie werd waargenomen en ondersteunen daarmee de combinatorische implementatie van zowel de RT-PP als de NCP-paradigma's.

Figuur 1: Gedragstesten met behulp van optogenetica in het RT-PP paradigma. (A) Schematische weergave van de tijdlijn van de experimenten. (B,C) Linksboven: grafiek die het percentage tijd dat in elk compartiment wordt doorgebracht gedurende het RT-PP-experiment voor DAT-Cre (N = 10) en VGLUT2-Cre (N = 7) muizen die met AAV-ChR2-eYFPworden geïnjecteerd. Blauwe cirkels: laser-gekoppeld compartiment; witte, zwarte cirkels: hoofdcompartimenten; grijze cirkels: neutraal compartiment. Rechtsboven: gemiddeld percentage tijd dat in elk compartiment wordt doorgebracht gedurende de dagen 3, 4, 6 en 7 (RT-PP). Bodem: representatieve heatmaps van tijd doorgebracht in elk compartiment voor een DAT-Cre en een VGLUT2-Cre muis. Alle gegevens werden normaal gesproken verspreid (Shapiro-Wilk test). Resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. ***p < 0,001 gekoppeld vs ongekoppeld; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 gekoppeld vs neutraal compartiment; §§p < 0,01, §§§p < 0,001 unpaired vs neutral compartiment. Dit cijfer is gewijzigd van Bimpisidis et al.¹². Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Chirurgische ingreep voor optogenetische experimenten. (A) Injectie van Cre-afhankelijke virale vector in de VTA. (B) Implantatie van de glasvezel boven de injectieplaats. Let op de ankerschroeven die worden gebruikt voor stabilisatie. (C) Permanente verankering van de vezel op de schedel met behulp van tandcement. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Apparatuur die wordt gebruikt in de optogenetica experimenten. (A) De TTL box gebruikt in de studies. Het ontvangt input van de tracking software en stuurt TTL signalen naar de microcontroller boord. (B) Voorzijde (boven) en achterzijde (onder) van de laserbron die voor de experimenten wordt gebruikt. (C) Het microcontrollerbord dat wordt gebruikt om de laserstimulatie te regelen. Let op de aansluitingen van de TTL box en met de laserbron. (D) Roterende verbinding. (E) Glasvezel patch akkoord gebruikt in de experimenten. F) Het driecompartimentapparaat dat wordt gebruikt voor RT-PP- en NCP-experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Het ontwerpen van arena's en zones binnen de trackingsoftware. Stap 1: Kalibratie van de installatie. Stap 2: Tekening van de hele arena. Stap 3: Tekenzones binnen de arena. Stap 4: Validatie instellen. Stap 5: tabblad Instellingen voor proefbesturingselementen voor het instellen van tijd- en stimulatieparameters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Tijd- en stimulatieparameters instellen van een RT-PP-experiment binnen de trackingsoftware. Het toevoegen van specifieke regels voor de duur (stap 1) en de voorwaarden voor lichte stimulatie (stap 2). De voorwaarden kunnen eenvoudig worden gewijzigd om aan de vereisten voor de omkeringsfase te voldoen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Tijd- en stimulatieparameters van NCP-experimenten instellen binnen de trackingsoftware. De duur van de stimulatiesessies (stap 1) is vergelijkbaar met die voor RT-PP, maar de omstandigheden voor lichtstimulatieactivering (stap 2) zijn verschillend. Toegang tot een van beide hoofdcompartiment (hier genaamd zone A en zone B) resulteert in optogenetische stimulatie die alleen wordt beëindigd wanneer de muis het neutrale compartiment binnenkomt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: Gedragstesten met behulp van optogenetica in het NCP-paradigma. (A) Schematische weergave van de experimentele opstelling. (B) Links: grafiek die het percentage tijd dat in elk compartiment wordt doorgebracht tijdens de twee dagen van stimulatie (Stim1 en Stim 2) en tijdens de sessie met geconditioneerde respons (CR) voor VGLUT2-Cre muizen die in de VTA (N = 5) met AAV-ChR2 zijn geïnjecteerd. Rechts: gemiddeld percentage van de tijd doorgebracht in elk compartiment tijdens de twee dagen van stimulatie van de NCP. (C) Representatieve heatmap van de tijd die in elk compartiment voor een VGLUT2-Cre muis tijdens een van de stimulatiedagen wordt doorgebracht. De gegevens werden normaal verspreid (Shapiro-Wilk test). De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 unpaired vs paired 1 en gekoppelde 2 compartimenten. Dit cijfer is gewijzigd van Bimpisidis et al.¹². Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Stap	Temperatuur	Duur	Cycli
1. Eerste denaturatie	95 °C	4 min	1
2. Denaturatie	95 °C	30 s	30
3. Annealing	55 °C	30 s
4. Uitbreiding	72 °C	40 s
5. Definitieve verlenging	72 °C	6 min	1
6.	4 °C	Tot gestopt door de experimentator	1

Tabel 1: Het PCR fietsprogramma.

Aanvullend coderingsbestand. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).

Discussion

In de huidige studie presenteren we twee stapsgewijze protocollen voor het uitvoeren van verschillende soorten plaatsvoorkeursanalyses met behulp van optogenetica bij muizen. De geschetste protocollen werden gebruikt om de lonende of aversieve gedragsfenotypes van VTA-neuronen(figuur 1 en figuur 6)¹²te beoordelen, maar kunnen ook worden gebruikt om de gedragsrol van neuronen in andere hersengebieden te onderzoeken.

Verschillende recente studies hebben beschreven RT-PP paradigma's in twee-compartiment^23,24 en drie-compartiment apparaten^{13,14,15,16,17,18}. De huidige protocollen beschrijven gedetailleerde opstellingen voor de RT-PP- en NCP-protocollen in een apparaat met drie compartimenten dat lijkt op die welke traditioneel worden gebruikt in CPP-experimenten om gedragseffecten op de toediening van drugs van misbruik te beoordelen. Hoewel de resultaten hier alleen worden gepresenteerd als het percentage tijd dat de muis in elk compartiment heeft doorgebracht, maakt de trackingsoftware het mogelijk om verschillende andere gedragsparameters te analyseren, zoals overgangen naar zones, snelheid, tijd die immobiel en meer wordt doorgebracht. Analyse van verschillende parameters kan van belang zijn voor de interpretatie van gegevens.

De huidige RT-PP protocollen zijn flexibel en kunnen worden aangepast om te testen of verschillende soorten stimulatiepatronen lonende effecten hebben. De parameters van laserbesturing kunnen eenvoudig worden gewijzigd door het script van het microcontrollerbord of binnen de trackingsoftware, wat de veelzijdigheid van de setup aantoont. We stellen een 20 Hz stimulatiefrequentie voor die binnen het bereik ligt, en soms lager, van frequenties die in eerdere studies zijn toegepast met dezelfde opsinvariant (ChR2/H134R) om dopaminerge en glutamaterneuronen en hun terminals^{13,14,16,17,18,23,24,25,26,27}te bestuderen. Recente studies hebben aangetoond dat hogere stimulatiefrequenties de tegenovergestelde effecten op gedrag kunnen hebben dan lagere, en dat deze effecten worden bemiddeld door een depolarisatieblok veroorzaakt door hogere frequenties²⁸. Op dezelfde manier zijn verschillen in gedragsoutput aangetoond bij het stimuleren van glutamatergic en GABAergic neuronen in het laterale preoptische gebied¹⁵. Deze studies onderzochten neuronen van verschillende gebieden dan de VTA en de grootste effecten werden waargenomen op hoge frequenties van niet-glutamaterende neuronen^15,28. Onze keuze op 20 Hz is gebaseerd op eerdere studies van glutamaterende en dopaminerge VTA neuronen waaruit blijkt dat door verschillende stimulatiefrequenties, beloning-gerelateerde gedragsoutput niet significant wordt gewijzigd^24,26.

Een extra parameter die kan worden aangepast en die de experimentele uitkomst kan beïnvloeden, is de kracht van de lichtbron. Hogere laserkracht kan de grootte van het licht gestimuleerde gebied vergroten, wat gunstig kan zijn in sommige soorten experimenten, maar met het nadeel van een stijging van temperatuur⁵. Inderdaad, een recente studie heeft aangetoond dat laser-geïnduceerde stijgingen van de temperatuur kan veranderen fysiologie van de hersenen en beïnvloeden gedragsmetingen²⁹. Deze opmerkingen benadrukken het belang van het opnemen van opsin-negatieve controles in het experimentele ontwerp. In het huidige protocol gebruikten we 10 mW laserkracht die vergelijkbaar is en eerder is aangetoond effectief te zijn in het stimuleren van dopaminerge en glutamaterende neuronen in de VTA^16,24,26. Bij het opzetten van experimenten is het belangrijk om aandacht te besteden aan de grootte van het gebied waarin de cellen van belang zich bevinden en de vezel-optica en patch koord eigenschappen (numerieke diafragma, kerndiameter). Deze parameters zijn essentieel om rekening mee te houden bij het uitvoeren van berekeningen met betrekking tot laserkracht. Voor meer informatie kan de rekenmachine ontwikkeld worden door het lab van Karl Deisseroth(http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php)worden gebruikt.

Histologische verificatie van de Cre-Lox recombinatie is een ander cruciaal aspect bij het toepassen van optogenetica experimenten. Validatie van de recombinatie-efficiëntie moet altijd plaatsvinden in een pilotcohort voordat gedragsexperimenten in een grote groep dieren worden uitgevoerd. Dit is belangrijk om ethische redenen, maar ook voor geoptimaliseerde experimentele output. Elke virale constructie kan variabele specificiteit voor verschillende neuronale types en in verschillende regio's^5,een parameter die de experimenten kan beïnvloeden op onvoorspelbare en zelfs misleidende manieren. Zo hebben we eerder het Cre-Lox recombinatiepatroon van AAV5-virussen in de VTA van DAT-Cre muizen gevalideerd en vastgesteld dat unilaterale injecties voldoende waren om het grootste deel van het interessegebied te bereiken. Toen we vervolgens ruimtelijk beperkte subpopulaties binnen de VTA bestudeerden, zoals een die wordt gekenmerkt door NeuroD6-expressie, merkten we op dat bilaterale virale injecties efficiënter waren om een groter aantal neuronen te targeten die meer uitgesproken gedragseffecten geven op optogenetische lichtstimulatie¹². Bovendien moet de tijd van chirurgie tot initiatie van gedragsexperimenten zorgvuldig worden aangepakt. Twee weken is genoeg tijd voor een ChR2 DNA-constructie worden uitgedrukt in cellichamen zoals we hier laten zien, maar langere wachttijden (~ 8 weken) nodig zou kunnen zijn als de onderzoeker is het testen van het effect van stimulatie in projectie gebieden^13,14,15,17.

Het is vermeldenswaard dat het volume van het geïnjecteerde virus (in ons geval 300 nL) geschikt zou kunnen zijn bij het bestuderen van neuronen in de VTA, maar volume en titer moeten worden aangepast, afhankelijk van de efficiëntie van transductie en de grootte van de bestudeerde structuur. Bovendien kan het voor bilaterale structuren op een afstand van de mediolaterale as nodig zijn bilaterale injecties uit te voeren en ook glasvezel bilateraal te implanteren om activering/remming in beide hemisferen te garanderen.

Ten slotte is het altijd noodzakelijk om postmortem histologische analyse uit te voeren om de efficiëntie van de Cre-Lox recombinatie te valideren en te bevestigen en de juiste implantatieplaats van de optische vezel op de beoogde locatie te verifiëren. Onverwachte, overbeperkte of overmatige Cre-Lox recombinatie kan optreden als gevolg van onbekende verdeling van neuronen uitdrukken Cre buiten de grenzen van het beoogde gebied, of als gevolg van verschillen in het virus serotype, slechte behandeling van het virus, verstopping van de spuit voor de levering van virussen of andere operatie-gerelateerde problemen. Verificatie van bevredigende Cre-Lox recombinatie en correcte fiberoptica-implantatie moet worden uitgevoerd om eventuele statistische resultaten van de gedragsbeoordelingen te bevestigen om veilige conclusies te trekken.

In termen van de hier verstrekte gegevens als voorbeelden van hoe de twee gedragsparadigma's kunnen worden gebruikt, werd de significante voorkeur aan de licht-gekoppelde kant die door optogenetische stimulatie van dopaminerge neuronen in VTA door het analyseren van dat-Cre muizen in het paradigma RT-PP wordt verkregen verwacht gebaseerd op vorige bevindingen^{23,24,25,26,27} terwijl het vermijden van deze kant die door de vglut2-Cre muizen wordt getoond niet werd verwacht. VGLUT2 neuronen van de VTA en hun projecties zijn aangetoond betrokken te zijn bij zowel beloning en aversie^{16,17,24,30,31}, en we hebben daarom de NCP-analyse uitgevoerd om het schijnbare vermijdingsgedrag dat in de huidige RT-PP-opstelling wordt waargenomen, nader te beoordelen. Door gebruik te maken van de smalle, transparante gang als het enige niet-licht gekoppelde compartiment om de aversieve eigenschappen van stimulatie van VTA glutamateren te bevestigen, is het duidelijk dat in deze specifieke opstelling met drie compartimenten, optogenetische activering van deze neuronen een aversieve reactie veroorzaakt. Deze experimenten, waarvan hier werd aangetoond dat ze een voorbeeld zijn van situaties die baat zouden kunnen hebben bij het gebruik van zowel de RT-PP- als de NCP-protocollen, maakten deel uit van een onlangs gepubliceerde studie, en de volledige gegevensset en discussies over deze bevindingen zijn te vinden in deze publicatie¹².

Naast het NCP zijn alternatieve manieren om aversie te bevestigen de sterke verlichting van een gebied binnen een open veldgebied terwijl de rest van de arena wordt gekoppeld aan laseractivering, of een actieve vermijdingstaak uitvoeren waarbij de muis een specifiek gedragspatroon moet uitvoeren om de laserstimulatie te beëindigen¹⁵.

Om samen te vatten, de beschreven protocollen bieden kritische informatie over hoe met succes uit te voeren RT-PP en NCP analyse op de meest efficiënte manier om de rol van neuronale activering in beloning en afkeer te ontrafelen. Afhankelijk van de wetenschappelijke hypothese kan een reeks parameters worden geanalyseerd met behulp van deze protocollen, en elk protocol kan ook worden gecombineerd met andere gevalideerde paradigma's voor geoptimaliseerde gedragsanalyses die optogenetica implementeren om specifieke hersenen aan te pakken gebieden en neuronen van belang.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV-Cre afhankelijk virus	UNC Vector Core	-	een grote verscheidenheid aan virussen om aan de behoeften van elk project te voldoen
Agarose	VWR Life Science	443666A
Buffer voor PCR	KAPA BIOSYSTEMS	KB1003	10x, bevat 1,5mM MgCl2 bij 1x
Bupivacaïne (Marcain)	Aspen	N01BB01	lokaal anestheticum, 5 mg/ml oplossing, vereist recept
Carprofen (Norocarp)	N-Vet	27636	ontstekingsremmend, pijnstillend; 50 mg/ml oplossing, vereist recept
dNTP set	Thermo Fisher Scientific	R0181	100mM, moet worden verdund tot 10mM en gemengd
DNA ladder	Thermo Fisher Scientific	SM0243	100 bp, 50 µg Gene Ruler
DNA loading dye	Thermo Fisher Scientific	R0611	6x, verdun tot 1x voor gebruik
Oorpons	AgnThos	AT7000	oorpons om weefselmonsters te nemen voor PCR of om dieren te markeren
Fiberoptische patchkabels	Doric Lenses	MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25
Implanteerbare glasvezel	Doric Lenses	MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT	de eigenschappen van de vezels kunnen veranderen afhankelijk van het experiment
Infusiepomp voor virusinjecties	AgnThos	Legato 130	bevat een externe pomp om de spuit direct op het stereotexi-frame te bevestigen
Isofluraan (Forane)	Baxter	N01AB06	Volatiel anestheticum, vereist recept
Juwelenschroeven	AgnThos	MCS1x2
Laserbron	Marwell Laser Systems	CNI MBL-III-473-100mW
Microcontroller board	Arduino	"Uno" board	kan bij verschillende bedrijven worden besteld
Microboor	AgnThos	1474	kan worden besteld met of zonder stereotaxische houder
Naald (34G)	World Precision Instruments	NF36BV
Nucleïnezuur gel kleurstof - GelRed	Biotium	41003-T
PCR buisjes	Axygen	PCR-0208-CP-C
Vermogensmeter	Thorlabs	PM100D
Plaats Voorkeurs Apparaat	Panlab	76-0278
Roterende verbinding	Doric Lenses	FRJ_1x1_FC-FC
Hulpstukken	Doric Lenses	SLEEVE_ZR_1-25	mating sleeve om de patchkabel met de geïmplanteerde optische vezel te verbinden
Stabilisatiecement	Ivoclar Vivadent	Tetric EvoFlow
Spuit (10ul)	World Precision Instruments	NanoFil
Taq polymerase	KAPA BIOSYSTEMS	KE1000	500U
TAE buffer	Omega BIO-TEK	SKU:AC10089	50x concentratie, moet worden verdund voor gebruik
Thermische cycler	BIO-RAD S1000	1852148	noodzakelijk om PCR-reacties uit te voeren
Weefsellijm	AgnThos	Vetbond
Tracking software	Noldus	Ethovision XT
TTL box	Noldus	Noldus USB-IO box
UV transilluminator	Azure Biosystems	c200 model