Methodenartikel

Microwaving en Fluorophore-Tyramide voor Multiplex Immunostaining op Muis bijnieren − Met behulp van ongeconjugeerde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten

DOI:

10.3791/60868

⸱

21 februari 2020

 ,  ,  , 
1College of Animal Science & Technology, Henan University of Science and Technology, 2Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende methoden vastgesteld voor multiplex immunostaining met primaire antilichamen van dezelfde gastheersoort. Hier beschrijven we het gebruik van microgolf-gemedieerde antilichaam strippen en van fluorophore-tyramide om antilichaam cross-reactiviteit te blokkeren tijdens multiplex immunostaining op formaline-vaste paraffine-embedded muis bijnier secties.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunostaining wordt veel gebruikt in biomedisch onderzoek om het cellulaire expressiepatroon van een bepaald eiwit aan te tonen. Multiplex immunostaining maakt etikettering met behulp van meerdere primaire antilichamen mogelijk. Om cross-reactiviteit van antilichamen te minimaliseren, vereist multiplex immunostaining met indirecte kleuring niet-gelabelde primaire antilichamen van verschillende gastheersoorten. De juiste combinatie van verschillende soortenantilichamen is echter niet altijd beschikbaar. Hier beschrijven we een methode voor het gebruik van niet-gelabelde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten (bijvoorbeeld, in dit geval zijn beide antilichamen van konijn) voor multiplex immunofluorescentie op formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) muis bijniersecties. Deze methode maakt gebruik van dezelfde procedure en reagentia die in de antigeenterugwinningsstap worden gebruikt om de activiteit van het eerder gekleurde primaire antilichaamcomplex te ontdoen. Dia's werden gekleurd met het eerste primaire antilichaam met behulp van een algemeen immunostaining protocol gevolgd door een bindende stap met een biotinylated secundair antilichaam. Vervolgens werd een avidin-biotine-peroxidase signaal ontwikkelingsmethode gebruikt met fluorophore-tyramide als substraat. De immunoactiviteit van het eerste primaire antilichaamcomplex werd gestript door onderdompeling in een microgolfkokende natriumcitraatoplossing voor 8 min. De onoplosbare fluorophore-tyramideafzetting bleef op het monster staan, waardoor de dia kon worden vastgehouden met andere primaire antilichamen. Hoewel deze methode elimineert de meeste vals-positieve signalen, sommige achtergrond van antilichaam cross-reactiviteit kan blijven. Als de monsters zijn verrijkt met endogene biotine, kan een geperoxideerd secundair antilichaam worden gebruikt ter vervanging van het biogetinylated secundair einlichaam om het vals-positieve van teruggewonnen endogene biotine te voorkomen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In multiplex immunostaining, directe vlekken met behulp van geconjugeerde primaire antilichamen kan informatieve resultaten opleveren. Zonder gebruik te maken van secundaire antilichamen, de directe kleuring methode heeft een laag risico van valse colokalisatie signalen van antilichaam cross-reactiviteit. Echter, de geconjugeerde verslaggevers (fluorophore, enzymen) of biotine op het primaire antilichaam beperken het toekomstige gebruik ervan. Als alternatief geeft indirecte immunovlekken meestal sterkere signalen met behulp van een ongeconjugeerd primair antilichaam met een gelabeld secundair antilichaam. Idealiter moeten ongeconjugeerde primaire antilichamen die worden gebruikt in multiplex immunostaining afkomstig zijn van verschillende gastheersoorten om cross-reactiviteit van antilichamen te voorkomen. De juiste combinatie van primaire antilichamen van verschillende gastheersoorten is echter niet altijd beschikbaar.

Er zijn verschillende methoden vastgesteld om het risico te elimineren dat het secundaire antilichaam reageert met een ongewenst primair antilichaam. Een veel voorkomende methode is het gebruik van een F(ab) monomeric antilichaam om eventuele resterende bindende epitopen op het eerste primaire antilichaamcomplex te blokkeren voordat het wordt bevlekken met het tweede primaire antilichaam1. Antilichaam strippen, die vergelijkbaar is met de strip en reprobe van een westerse vlek blad, verwijdert de eerder gekleurde antilichaam complex zonder strippen van de afzetting van detecteerbare reporter moleculen zoals 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)2 en de fluorescerende tyramide afzetting3. Met deze methode kunnen reportermoleculen in verschillende kleuren een multiplexresultaat op dezelfde dia weergeven. De multiplex kleuring is ook haalbaar door de volledige verwijdering van de eerder gedeponeerde lagen antilichamen en de uitlijning van vervolgens verworven beelden van andere antilichamen4,5. Deze methoden geven allemaal betrouwbare resultaten, hoewel elke methode zijn beperkingen heeft en ingewikkelde procedures of een speciaal beeldvormingssysteem vereist.

Het huidige protocol toont de toepassing van een antilichaam strippen methode met het gebruik van algemeen beschikbare buffers. Dit protocol kan worden gebruikt voor het uitvoeren van multiplex immunofluorescente vlekken op formaline-fixed paraffine-embedded (FFPE) muis bijniersecties met twee niet-gelabelde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vlekken met het eerste antilichaam

  1. Dewax en rehydrate FFPE dia's met 5 min toegewezen aan elk van de volgende stappen: xyleen of gelijkwaardige reagentia 3x, 100% ethanol 2x, 95% ethanol 1x, 70% ethanol 1x, 50% ethanol 1x, en gedestilleerd water 2x.
    OPMERKING: Dia's moeten vochtig blijven vanaf deze rehydratiestap tot de montage in de laatste stap.
  2. Voor het optioneel ophalen van antigeen plaatst u de glijbanen in 275 mL kokende natriumcitraatoplossing (10 mM, pH = 6,0) gedurende 8 min. Om de oplossing kokend te houden, plaatst u de glijbanen plat op de bodem van een 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x L x H) pipettipbox met deksel en magnetron de oplossing op 70% vermogen in een 700 W magnetron gedurende 8 min. Verwijder vervolgens de pipet tipbox uit de magnetron, open het deksel en laat de oplossing afkoelen bij kamertemperatuur (RT) gedurende ten minste 20 min.
  3. Breng de glijbanen over in een Coplin-pot met PBST (fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,1% polysorbaat 20/80). Was met PBST voor 5 min 3x. Als u niet onmiddellijk naar de volgende stap gaat, bewaar t.a.v. PBST in deze stap een paar uur of bij 4 °C gedurende 1-2 dagen, zo niet onmiddellijk naar de volgende stap.
  4. Om de blokkeringsoplossing voor te bereiden, gebruikt u het normale serum van de gastheersoorten van het secundaire antilichaam als blokkerend reagens. Andere commerciële blokkerende reagentia kunnen ook worden gebruikt. Als het gebruik van een normaal serum dat wordt gebruikt voor de studie die in dit onderzoek wordt gepresenteerd, voegt u 100 μL normaal ezelsserum toe aan 4,9 mL PBST. De blokkeringsoplossing kan maximaal 3 dagen bij 4 °C worden bewaard.
  5. Voor het blokkeren, schud de PBST van de dia's en snel bedekken met voldoende blokkeren oplossing. Incubeer de glijbanen bij RT in een bevochtigde kamer gedurende 30 min.
  6. Bereid de primaire antilichaamoplossing (500 μL voor twee dia's) voor met behulp van de blokkeringsoplossing om het primaire antilichaam tot de gewenste concentratie te verdunnen. De oplossing moet tot gebruik op ijs worden opgeslagen.
    1. Voeg voor 3βHSD 2 μL 3βHSD toe aan 498 μL blokkeringsoplossing.
    2. Voeg voor TH 0,5 μL TH-antilichaam toe aan 499 μL blokkeringsoplossing.
    3. Voeg voor β-catenine 1 μL β-catenin antilichaam toe aan 499 μL blokkeeroplossing.
    4. Voeg voor 20α HSD 1 μL 20αHSD-antilichaam toe aan 499 μL blokkeringsoplossing.
    5. Voeg voor CYP2F2 2 μL CYP2F2-antilichaam toe aan 498 μL blokkeringsoplossing.
  7. Incubeer met het primaire antilichaam door de blokkeringsoplossing van de glijbanen af te schudden en ze snel te bedekken met voldoende primaire antilichaamoplossing. Incubeer de glijbanen in een bevochtigde kamer 's nachts bij 4 °C. Tijdens de incubatie kunnen de dia's worden bedekt door een klein stukje paraffinefolie om uitdroging te voorkomen.
  8. De volgende ochtend was de glijbanen met PBST voor 5 min 3x.
  9. Bereid de secundaire antilichaamoplossing (500 μL voor twee glijbanen) voor met behulp van de blokkeringsoplossing om het biotinylated secundaire antilichaam te verdunnen tot de gewenste concentratie (bijvoorbeeld 1 μL ezelantimuisantilichaam of ezelantikonijnantilichaam in 499 μL van blokkeren oplossing). De oplossing moet tot gebruik op ijs worden opgeslagen.
  10. Incubeer met het tweede antilichaam door PBST van de glijbanen af te schudden en ze snel te bedekken met voldoende secundaire antilichaamoplossing. Incubeer de glijbanen in een bevochtigde kamer gedurende 1 uur bij RT.
    OPMERKING: Als endogene biotine een punt van zorg is, gebruik dan een peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam in plaats van het biotinylated secundaire antilichaam. Ga naar stap 1.14 als u in stap 1.10 een geperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaam gebruikt.
  11. Was de glijbanen met PBST gedurende 5 min 3x.
  12. Bereid de mierikswortel peroxidase-geconjugeerde streptavidin (SA-HRP) oplossing (500 μL voor twee dia's) door 0,5 μL SA-HRP toe te voegen aan 499 μL PBS. De uiteindelijke concentratie is 1 μg/mL.
  13. Incubeer met de SA-HRP oplossing. Schud PBST van de glijbanen en bedek de glijbanen snel met voldoende SA-HRP-oplossing. Incubeer de glijbanen in een bevochtigde kamer gedurende 0,5 uur bij RT.
  14. Was de glijbanen met PBST gedurende 5 min 3x.
  15. Bereid de fluorophore-tyramideoplossing voor door fluorophore-tyramide te verdunnen met zijn verdunningsbuffer volgens de instructies van de fabrikant (bijvoorbeeld 5 μL fluorophore-tyramide in 496 μL verdunningsbuffer).
  16. Voer de signaalontwikkeling uit met fluorophore-tyramide door PBST van de glijbanen af te schudden en de glijbanen snel te bedekken met voldoende fluorophore-tyramideoplossing. Incubeer in een bevochtigde kamer gedurende 1 min bij RT. De incubatietijd kan worden aangepast om de gewenste fluorescentieintensiteit te verkrijgen. Stop de reactie door de dia's over te zetten naar een Coplin-pot met PBST. Was glijbanen met PBST gedurende 3 min 2x.
  17. Signalen kunnen snel worden gecontroleerd onder een fluorescentiemicroscoop om het resultaat in dit stadium te bevestigen. Als coverslips niet worden gebruikt, breng dan op elke sectie een druppel glycerol:PBS (1:1) aan om de monsters vochtig te houden. Was glijbanen met PBST gedurende 3 min 2x. Dia's kunnen enkele dagen bij 4 °C in PBST worden opgeslagen voordat ze naar de volgende stap gaan.

2. Strip het eerste antilichaam

  1. Plaats de glijbanen in 275 mL kokende natriumcitraatoplossing (10 mM, pH = 6,0) gedurende ten minste 8 min. Houd de oplossing aan het koken door de glijbanen plat op de bodem van een 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x L x X H) pipet tipbox met een deksel en microwaving de oplossing op 70% vermogen in een 700 W magnetron voor 8 min. Als een langere strippentijd de voorkeur heeft, kan het nodig zijn om de buffer af te maken met behulp van een kokende natriumcitraatoplossing om de dia's te allen tijde ondergedompeld in bufferoplossing te houden. Haal de pipet tipbox uit de magnetron, open het deksel en laat de oplossing minstens 20 min afkoelen bij RT.
  2. Breng de dia's over in een Coplin-pot met PBST. Was met PBST voor 5 min 3x. Als de volgende stap indien niet onmiddellijk wordt uitgevoerd, bewaar de dia's in een Coplin-pot met PBST bij RT gedurende een paar uur of bij 4 °C gedurende 1-2 dagen.

3. Vlek met het tweede antilichaam

  1. Ga van start bij de blokkeringsstap en volg dezelfde procedures in stap 1.5 tot en met stap 1.14. Gebruik bij de signaalontwikkelingsstappen (stap 1.15 en stap 1.16) de fluorophore-tyramide in een ander fluorescentiespectrum.
    OPMERKING: Dia's kunnen worden gestript met behulp van deze methode meerdere malen om multiplex vlekken mogelijk te maken. Het laatste antilichaam heeft fluorophore-tyramide niet nodig als verslaggever. Een fluorophore-geconjugeerd secundair antilichaam kan worden gebruikt om signalen van het laatste primaire antilichaam weer te geven.
  2. Incubeer dia's met 2 μg/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) of Hoechst oplossing voor 1 min bij RT als nucleaire tegenkleuring nodig is. Was vervolgens de glijbanen met PBST voor 3 min 2x.

4. Beeldvorming Met behulp van een fluorescentiemicroscoop om signalen te detecteren

  1. Monteer een coverslip met een druppel montagemedium dat geschikt is voor immunofluorescentie.
  2. Gebruik voor beeldvorming een fluorescentiemicroscoop om signalen van elk fluorescentiekanaal te detecteren. Begin met het DAPI-kanaal (Nuclear Staining) en de 4x lens om het weefsel op de dia te lokaliseren.
  3. Schakel over naar de 10x lens voor beeldvorming. Pas de belichtingstijd (300 ms) en lichtbronintensiteit (80% intensiteit) aan. Pas deze instellingen aan als het signaal te helder of te donker is. Maak foto's van elk kanaal zonder het podium te verplaatsen. Voor elk kanaal kan opnieuw worden scherpstellen. Voeg de afbeeldingen van elk kanaal samen met behulp van de software van de microscoop of ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De resultaten werden verkregen uit monsters die werden behandeld met alle beschreven stappen, waaronder de stap 1.2 voor het ophalen van antigeen. Alle secundaire antilichamen die hier werden gebruikt waren biotinylated. Fluorophore-tyramide werd gebruikt om signalen te ontwikkelen van de eerste en tweede primaire antilichamen. Beelden werden vastgelegd met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een FITC kubus (voor groene fluorescentie), een TxRED kubus (voor Cy3) en een DA...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multiplex immunostaining is nuttig om de cellulaire colokalisatie van twee of meer antigenen te onderzoeken. Deze veel gebruikte techniek geeft overtuigende colokalisatie resultaten wanneer primaire antilichamen worden geconjugeerd met verschillende verslaggevers (directe kleuring). Echter, directe kleuring biedt meestal zwakkere signalen in vergelijking met indirecte vlekken, waarbij geconjugeerde secundaire antilichamen om de primaire antilichamen te detecteren. Bij indirecte kleuring is een hoogwaardig multiplex immun...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door NIH R00 HD032636.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000
Biotinylated donkey anti-mouseJacksonImmuno715-066-1511:500 verdunning
Biotinylated donkey anti-rabbitJacksonImmuno711-066-1521:500 verdunning
DAPIBioLegend4228012 μg/mL in gedistilleerd water
FluorescentiemicroscoopECHORevolve 4
Horseradish peroxidase-geconjugeerd streptavidinJacksonImmuno016-030-0841:1.000 verdunning
Microgolfoven, 700 WGeneral ElectricJEM3072DH1BB
Muis anti-CYP2F2Santa CruzSC-3745401:250 verdunning
Muis anti-THSanta CruzSC-252691:1.000 verdunning
Normaal ezelsserumJacksonImmuno017-000-1212% serum in PBST
Konijn anti-20αHSDKerafastEB40021:500 verdunning
Konijn anti-3βHSDTransGenicKO6071:250 verdunning
Konijn anti-THNOVUSNB300-1091:1.000 verdunning
Konijn anti-β-cateninAbcamab325721:500 verdunning
Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)JacksonImmuno016-303-0841:1.000 verdunning
TSA Cy3 TyramidePerkinElmerSAT704B001EA1:100 verdunning
TSA Fluorescein TyramidePerkinElmerSAT701001EA1:100 verdunning

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  2. Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
  3. Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
  4. Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043(2012).
  5. Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
  8. Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
  9. Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
  10. Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
  11. Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
  12. Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
  13. Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
  14. Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Magnetron strippingantigeen retrievalavidine biotine peroxidasefluorescentiemicroscopieFFPE coupesantilichaam kruisreactiviteit

Gerelateerde artikelen