Verbeterde levensvatbaarheid voor Ex vivo 3D Hydrogel Culturen van patiënt-afgeleide Xenografts in een perfused microfluïdisch platform

Lindsey  K. Sablatura; Kristin  M. Bircsak; Peter Shepherd; Karla Queiroz; Mary  C. Farach-Carson; Pamela  E. Constantinou; Anthony Saleh; Nora Navone; Daniel A. Harrington

doi:10.3791/60872

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Verbeterde levensvatbaarheid voor Ex vivo 3D Hydrogel Culturen van patiënt-afgeleide Xenografts in een perfused microfluïdisch platform

5.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60872

⸱

5 december 2020

Lindsey K. Sablatura¹ , Kristin M. Bircsak² , Peter Shepherd³ , Karla Queiroz⁴ , Mary C. Farach-Carson¹^,⁵^,⁶ , Pamela E. Constantinou¹^,⁷ , Anthony Saleh² , Nora Navone³ , Daniel A. Harrington¹^,⁵^,⁶

¹Department of BioSciences, Rice University, ²Mimetas US Inc, ³Department of Genitourinary Medical Oncology Research, Division of Cancer Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, ⁴Mimetas B.V., ⁵Department of Bioengineering, Rice University, ⁶Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, The University of Texas Health Science Center, ⁷Sheikh Ahmed Center for Pancreatic Cancer Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol toont methoden om een uitgebreide in vitro cultuur van patiënt-afgeleide xenografts (PDX) mogelijk te maken. Een stap verbetert de algehele levensvatbaarheid van meercellige clusterculturen in 3D hydrogels, door eenvoudige verwijdering van niet-levensvatbare enkele cellen. Een secundaire stap toont best practices voor PDX-cultuur in een geperfundeerd microfluïdisch platform.

Samenvatting

Patiënt-afgeleide xenografts (PDX), gegenereerd wanneer resected patiënt tumorweefsel rechtstreeks wordt geënt in immuungecompromitteerde muizen, blijven biologisch stabiel, waardoor het behoud van moleculaire, genetische en histologische kenmerken, evenals heterogeniteit van de oorspronkelijke tumor. Echter, het gebruik van deze modellen om een veelheid van experimenten uit te voeren, met inbegrip van screening op geneesmiddelen, is onbetaalbaar, zowel in termen van kosten en tijd. Driedimensionale (3D) cultuursystemen worden algemeen gezien als platforms waarin kankercellen hun biologische integriteit behouden door middel van biochemische interacties, morfologie en architectuur. Ons team heeft uitgebreide ervaring met het kweken van PDX cellen in vitro met behulp van 3D matrices bestaande uit hyaluronzuur (HA). Om muisfiblast stromalcellen in verband met PDX's te scheiden, gebruiken we rotatiecultuur, waarbij stromale cellen zich hechten aan het oppervlak van weefselkweekbehandelde platen terwijl gescheiden PDX-tumorcellen zweven en zichzelf associëren in meercellige clusters. Ook drijvend in de supernatant zijn enkele, vaak dode cellen, die een uitdaging vormen bij het verzamelen van levensvatbare PDX-clusters voor downstream inkapseling in hydrogels voor 3D-celcultuur. Om deze enkele cellen te scheiden van levende celclusters, hebben we dichtheidsstapgradiëntcentrifugatie gebruikt. Het hier beschreven protocol zorgt voor de uitputting van niet-levensvatbare enkele cellen uit de gezonde populatie van celclusters die zullen worden gebruikt voor verdere in vitro experimenten. In onze studies nemen we de 3D-culturen op in microfluïde platen die mediaperfusie tijdens de cultuur mogelijk maken. Na de beoordeling van de resulterende culturen met behulp van een fluorescerende image-based levensvatbaarheidstest van gezuiverde versus niet-gezuiverde cellen, tonen onze resultaten aan dat deze extra scheidingsstap het aantal niet-levensvatbare cellen uit onze culturen aanzienlijk verminderde.

Inleiding

In de afgelopen tien jaar heeft het gebied van kankeronderzoek aangetoond hernieuwde enthousiasme voor patiënt-afgeleide xenografts (PDXs) als een instrument voor de beoordeling van kankercel traject afhankelijkheid en drug gevoeligheid¹. De meest voorkomende PDX-modellen worden vastgesteld door onderhuidse of orthotopische implantatie van menselijke tumorcellen - een tumorfragment, een cluster van gescheiden tumorcellen of een monster van geïsoleerde circulerende tumorcellen (CTC's) -in een knaagdierhost. Als de tumor "nemen" succesvol is, zullen de xenograft cellen zich vermenigvuldigen, vasculariseren en anderszins interageren met het gasthe....