Verbeterde levensvatbaarheid voor Ex vivo 3D Hydrogel Culturen van patiënt-afgeleide Xenografts in een perfused microfluïdisch platform

Samenvatting

Dit protocol toont methoden om een uitgebreide in vitro cultuur van patiënt-afgeleide xenografts (PDX) mogelijk te maken. Een stap verbetert de algehele levensvatbaarheid van meercellige clusterculturen in 3D hydrogels, door eenvoudige verwijdering van niet-levensvatbare enkele cellen. Een secundaire stap toont best practices voor PDX-cultuur in een geperfundeerd microfluïdisch platform.

Samenvatting

Patiënt-afgeleide xenografts (PDX), gegenereerd wanneer resected patiënt tumorweefsel rechtstreeks wordt geënt in immuungecompromitteerde muizen, blijven biologisch stabiel, waardoor het behoud van moleculaire, genetische en histologische kenmerken, evenals heterogeniteit van de oorspronkelijke tumor. Echter, het gebruik van deze modellen om een veelheid van experimenten uit te voeren, met inbegrip van screening op geneesmiddelen, is onbetaalbaar, zowel in termen van kosten en tijd. Driedimensionale (3D) cultuursystemen worden algemeen gezien als platforms waarin kankercellen hun biologische integriteit behouden door middel van biochemische interacties, morfologie en architectuur. Ons team heeft uitgebreide ervaring met het kweken van PDX cellen in vitro met behulp van 3D matrices bestaande uit hyaluronzuur (HA). Om muisfiblast stromalcellen in verband met PDX's te scheiden, gebruiken we rotatiecultuur, waarbij stromale cellen zich hechten aan het oppervlak van weefselkweekbehandelde platen terwijl gescheiden PDX-tumorcellen zweven en zichzelf associëren in meercellige clusters. Ook drijvend in de supernatant zijn enkele, vaak dode cellen, die een uitdaging vormen bij het verzamelen van levensvatbare PDX-clusters voor downstream inkapseling in hydrogels voor 3D-celcultuur. Om deze enkele cellen te scheiden van levende celclusters, hebben we dichtheidsstapgradiëntcentrifugatie gebruikt. Het hier beschreven protocol zorgt voor de uitputting van niet-levensvatbare enkele cellen uit de gezonde populatie van celclusters die zullen worden gebruikt voor verdere in vitro experimenten. In onze studies nemen we de 3D-culturen op in microfluïde platen die mediaperfusie tijdens de cultuur mogelijk maken. Na de beoordeling van de resulterende culturen met behulp van een fluorescerende image-based levensvatbaarheidstest van gezuiverde versus niet-gezuiverde cellen, tonen onze resultaten aan dat deze extra scheidingsstap het aantal niet-levensvatbare cellen uit onze culturen aanzienlijk verminderde.

Inleiding

In de afgelopen tien jaar heeft het gebied van kankeronderzoek aangetoond hernieuwde enthousiasme voor patiënt-afgeleide xenografts (PDXs) als een instrument voor de beoordeling van kankercel traject afhankelijkheid en drug gevoeligheid¹. De meest voorkomende PDX-modellen worden vastgesteld door onderhuidse of orthotopische implantatie van menselijke tumorcellen - een tumorfragment, een cluster van gescheiden tumorcellen of een monster van geïsoleerde circulerende tumorcellen (CTC's) -in een knaagdierhost. Als de tumor "nemen" succesvol is, zullen de xenograft cellen zich vermenigvuldigen, vasculariseren en anderszins interageren met het gastheerweefsel om een tumor te creëren, die kan worden geoogst op een optimale grootte, onderverdeeld en opnieuw geïmplanteerd in andere gastheren. Onder hun vele voordelen als modelsysteem behouden PDX's doorgaans een aanzienlijk deel van de heterogeniteit van de inheemse tumorcelpopulatie en maken het de beoordeling van mensspecifieke trajecten en celreacties^{mogelijk 2,3}. De in vivo context maakt tumorinteractie met vasculatuur en andere aangrenzende stroma mogelijk en recapituleert weefselkenmerken zoals drugsdiffusiedynamiek, zuurstofspanning en extracellulaire matrix die de progressie van de tumor biologisch en mechanisch beïnvloeden. Een negatief aspect van PDXs is hun afhankelijkheid van een knaagdier gastheer, zowel voor tumor expansie en uiteindelijk voor hypothese testen. Omdat veel PDX's zich niet kunnen aanpassen aan de traditionele tweedimensionale (2D)-cultuur op weefselkweek polystyreen zonder veel van hun wenselijke kenmerken te verliezen, is er een minimale middenweg voor onderzoekers tussen deze relatief gecontroleerde in vitro-methode en de aanzienlijke toename van de kosten, faciliteiten en tijdsvereisten voor in vivo PDX-gebruik.

We hebben meerdere in vitro modellen beschreven die 3D-celcultuur implementeren binnen een ondersteunende matrix, en onlangs uitgebreid dat werk aan te tonen de ex vivo cultuur van meervoudige prostaatkanker (PCa)-afgeleide PDX's, zowel alleen als in co-cultuur met beenmerg-afgeleide fibroblasten^4,5. Hyaluronzuur (HA)-gebaseerde hydrogelmatrices bieden aanpasbare en biologisch relevante ondersteuning voor beide celtypen, met facile controle over hydrogelkenmerken en optische helderheid voor beeldvorming door de hydrogeldiepte⁶.

Volwassen PDX tumorweefsels bestaan uit een variabel mengsel van heterogene menselijke kankercellen en muisstroma (fibroblasten, endotheelcellen, enz.). Om cel-type specifieke bijdragen aan tumorprogressie in vitro te bestuderen, kan het voordelig zijn om tumoren te scheiden, de celpopulaties te scheiden en experimenteel op een georganiseerde manier op te nemen om trajecten van intercellulaire communicatie te ontleden. De gemengde celpopulaties in weefselvertgates hebben differentiële compatibiliteit met specifieke kweekomstandigheden. Bijvoorbeeld, tumor-geassocieerde fibroblast levensvatbaarheid vereist ofwel oppervlak aanhankelijkheid of 3D matrices gefunctionaliseerd met integrin liganden, terwijl epitheel-afgeleide PDX cellen hebben meestal niet deze eisen, in plaats daarvan ten gunste van celcel interacties. Deze verschillen kunnen worden benut om een effectieve scheiding van PDX-cellen van besmettende muisstromalcellen te bereiken. Rotatiecultuur van weefselvert verteert maakt stromale celtrouw aan het weefselkweekoppervlak mogelijk, terwijl celcelverklevingen PDX-cellen drijven die boven het roterende kweekoppervlak zweven om meercellige clusters in het supernatant te vormen in 24−48 uur. De specifieke kenmerken van deze clusters variëren met de PDX (bijvoorbeeld grote, strakke, zeer bolvormige clusters of kleinere, lossere aggregaten die lijken op trossen druiven), maar zijn meestal van biologisch relevante afmetingen (50−250 μm diameter), voldoende voor het beoordelen van cellulaire interacties die afhankelijk zijn van intercellulaire contacten.

Tumor retrieval en verwerking onvermijdelijk resulteert in een zekere mate van collateral cell dood, hetzij als gevolg van schade op korte termijn van mechanische / enzymatische verstoring, of op lange termijn onverenigbaarheid van subpopulaties met de gekozen cultuur voorwaarden. Ondanks het nut van rotatiecultuur als eerste bulkscheiding, worden dode of stervende cellen onvermijdelijk overgebracht met de PDX clusters en kunnen de resulterende cultuur beïnvloeden. Deze dode cellen zijn vaak individuele PDX cellen die niet werden geïntegreerd in een cluster, muis stromale fibroblasten die niet kunnen overleven in geselecteerde cultuuromstandigheden, of bijzonder fragiele endotheelcellen. Dergelijke stervende cellen kunnen experimentele resultaten van "overlevenden" beïnvloeden en kunnen een aanzienlijke invloed hebben op kwantificering, bijvoorbeeld via fluorescerende op beelden gebaseerde screeningtesten op basis van beeld. Om de selectie van levende PDX-cellen uit deze methode te verbeteren, hebben we centrifugatiemethoden aangepast met dichtheidsstappen om individuele dode/stervende cellen gemakkelijk te verwijderen uit PDX-mengsels en overwegend levende meercellige clusters te behouden.

Om de studie van resulterende PDX-afgeleide clusters in de 3D-cultuur te verbeteren, hebben we gebruik gemaakt van een microfluidics-gebaseerde perfusiecultuurplatform, de OrganoPlate (figuur 1), een hoog-doorvoerorgaan-op-een-chip-platform dat simultane cultuur van maximaal 96 individuele perfusie, 3D-culturen op een 384-wellitert microbordbasis (Figuur 1A)^7,8. In de 2-baans microfluidic plaat wordt een enkele weefselchip verbonden door twee microfluïde kanalen (Figuur 1B, gelkanaal: rood, perfusiekanaal: blauw) die vier putten op een rij omspannen. De twee microfluidic kanalen worden gescheiden door een korte plastic nok genaamd een Phaseguide die overloop van een kanaal in zijn aangrenzende buurman kanaal voorkomt, en tegelijkertijd zorgt voor een membraan-vrije interface tussen de inhoud van de gel en perfusie kanaal⁹. Omdat de bodem van de microfluidic plaat bestaat uit microfluïde glas, kunnen de culturen in het observatievenster via de bodem van de plaat worden bekeken met een standaard of geautomatiseerde microscoop. Perfusie is gevestigd in de microfluïde plaat met een programmeerbare rocker, met behulp van de zwaartekracht om media te rijden door de microfluïde kanalen, tussen reservoirputten (Figuur 1C). De perfusie stroom-nabootst meer samenvatten de tumor micromilieu dan statische cultuur, waardoor voor de integratie van schuifspanning en verbeterde distributie van gassen en voedingsstoffen. De voordelen van het behoud van een geperfundeerde kankercelcultuur in de microfluïde plaat zijn eerder beschreven als geperfundeerde borstkankerculturen die een optimale levensvatbaarheid vertoonden in vergelijking met een statische 3D-cultuur van dezelfde cellen⁷.

Het onderhavige rapport beschrijft een aangepaste dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode voor het isoleren van levende meercellige PDX-clusters en toont zijn nut bij het vestigen van 3D PDX-culturen binnen perfusable microfluïde platen. Omdat een toenemend aantal onderzoekslaboratoria methoden zoekt om het gebruik van PDX te vergemakkelijken, verwachten we dat de hier gepresenteerde protocollen van onmiddellijke nut zullen zijn.

Protocol

Tumorweefsel werd verkregen met toestemming van de patiënt en volgens een goedgekeurd Institutional Review Board (IRB) protocol. Xenografts werden geïmplanteerd, geteeld en geoogst volgens een geaccepteerd Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protocol.

OPMERKING: Alle werkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een steriele biologische veiligheidskast om de steriliteit te behouden. Alle stappen moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders bepaald.

1. Bereiding van materialen voor PDX-verwerking

1. Autoclave tang en scalpel handvat of scheermesjes.
2. Dooi dissociatie enzym oplossing bij 4 °C 's nachts of bij kamertemperatuur op dezelfde dag als weefsel dissociatie.
   OPMERKING: Ontdooien bij 37 °C wordt afgeraden, omdat dit sommige dissociatieenzymen kan inactiveren.
3. Bereid ten minste 100 mL PDX-kweekmedium (Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium-nutriëntenmengsel F-12 [DMEM-F12] met 100 U/mL penicilline en streptomycin en 30% foetaal runderserum [FBS]), en ten minste 25 mL PDX-verwerkingsmedium (DMEM-F12 met 100 U/mL penicilline en streptomycine en geen FBS). Bewaar op 4 °C tot het gebruiksklaar is.

2. PDX-dissociatie en initiële zuivering van stromale component

1. Verzamel autoclaved gebruiksvoorwerpen, 70 μm cel strainers (2−3), 60 mm ronde weefselkweekschotels (2), 6-well weefselkweekplaten, steriele 50 mL conische centrifugebuizen en steriele 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Warme cultuurmedium tot 37 °C en laat dissociatie enzym oplossing te komen tot kamertemperatuur.
2. Wanneer PDX-weefsel een diameter van 1,0−1,5 cm in een muishost heeft bereikt, verwijder de tumor chirurgisch uit de muis met standaardmiddelen (bijvoorbeeld onder geaccepteerde anesthesie) en bewaar op ijs in een buis van 50 mL met PDX-kweekmedium (Figuur 2A). Verwerk het weefsel onmiddellijk, via de onderstaande stappen, om de levensvatbaarheid van de cel te maximaliseren, bij voorkeur binnen 1−2 uur na de oogst.
3. Breng tumorweefsel over naar een voorgewogen steriele 50 mL conische buis. Spoel 6x met 30 mL steriele PBS om bloed en verontreinigingen te verwijderen. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof en weeg het tumorweefsel.
4. Breng tumorweefsel naar een 60 mm ronde weefselkweekschaal en gehakt in ~1 mm^3-stukken met behulp van een steriel scheermesje of scalpel.
5. Voeg 5 mL PDX-verwerkingsmedium toe om tumordrijfmest te verzamelen en over te brengen naar een nieuwe steriele buis van 50 mL. Spoel de kweekschotel met nog eens 5 mL PDX-verwerkingsmedium, vervolgens met dissociatieenzymoplossing (10 mL/g tumor, ten minste 5 mL), waarbij alle spoelingen aan de 50 mL-buis worden toegevoegd.
6. Incubeer 20 min bij 37 °C met zacht schudden. Draai de buis zachtjes halverwege de incubatietijd.
7. Pipet zachtjes op en neer met een serologische pipet om klonten te breken. Filtercellen met een 70 μm celzeef geplaatst over een nieuwe steriele 50 mL buis.
   LET OP: Er kan meer dan één zeef nodig zijn.
8. Centrifuge op 200 x g gedurende 5 min tot pelletcellen. Verwijder supernatant en resuspend in 2−3 mL van PDX cultuurmedium. Tel cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller.
9. Gebruik tabel 1 om het vereiste aantal gescheiden PDX-afgeleide cellen te schatten dat nodig is om de gewenste celdichtheid per chip te bereiken.
   OPMERKING: De waarden in tabel 1 zijn bedoeld als uitgangspunt. Werkelijke waarden zullen variëren als gevolg van weefsel levensvatbaarheid / cellulaire en celverlies van bevriezing / herstel. PDX tumoren zijn individuen, zelfs binnen een bepaald type kanker, zodat deze waarden empirisch moeten worden aangepast.
10. Van het getal berekend in stap 2.9, plaat 1−2 x 10⁶ cellen in 5 mL van PDX cultuurmedium per put van een 6-well weefsel kweekplaat. Incubatie (37 °C, 5% CO₂, 95% luchtvochtigheid) voor 48 uur met zacht schudden (50−55 tpm) om clustervorming te bevorderen (figuur 2B). Nadat cluster is gevormd, gaat u verder naar sectie 3 voor centrifugatie.
11. Cryopreserve ongebruikte PDX cellen van de initiële dissociatie in 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% dimethylsulfoxide (DMSO) of een commercieel verkrijgbaar primair celbevrief medium.
    OPMERKING: Aanhangende muis stromal cellen kunnen ook worden hersteld van het weefsel plaat oppervlak, indien gewenst, door spoelen kort met cultuur medium en uit te breiden met standaard middelen.
12. Voor later gebruik van cryopreserved PDX tumorcellen/muis stroma, dooicellen in een 37 °C waterbad gedurende 2 min. Tel en plaat in een 6-well weefselkweekplaat zoals beschreven in stap 2.10 voordat u doorgaat naar sectie 3. Verhoog het aantal PDX-cellen met ~ 20% om levensvatbaarheid verliezen van cryopreservatie tegemoet te komen.

3. Dichtheidsgradiëntcentrifugatiegebaseerde scheiding van PDX-afgeleide clusters uit afzonderlijke cellen

1. Bereid 20 mL van 100% dichtheidgradiëntoplossing voor door 18 mL dichtheidsgradiëntecentrifugatieoplossing grondig te mengen met 2 mL steriele 10x Hanks' uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS) in een steriele conische buis van 50 mL. Maak 10 mL elk van 20%, 30%, 40% en 55% dichtheidgradiëntoplossingen door deze 100% oplossing te verdunnen met steriele 1x HBSS en goed te mengen.
   OPMERKING: Deze volumes zijn voldoende voor twee 15 mL gradiënten die kunnen worden gebruikt om ~15 x 10⁶ cellen per stuk te scheiden. Als het scheiden van minder dan ~ 15 x 10⁶ cellen, moet het tweede verloop worden gebruikt als een evenwicht voor centrifugatie.
2. Voeg 3 mL van 55% dichtheidgradiëntoplossing toe aan de onderkant van een conische buis van 15 mL. Houd de buis onder een hoek, zeer voorzichtig laag 3 mL van 40% dichtheid gradiënt oplossing op de top van de 55% laag, langzaam af te geven van de vloeistof op de schuine kant van de buis om te voorkomen dat het mengen van de lagen. Herhaal dit met de 30% dichtheidgradiëntoplossing.
3. Verzamel de supernatant van PDX rotatieculturen met een 5 mL serologische pipet, spoelplaat oppervlak voorzichtig. Centrifuge op 200 x g gedurende 2 min tot pelletcellen.
4. Verwijder supernatant en resuspend de celpellet in 3 mL van 20% dichtheidgradiënt oplossing op basis van het aantal gradiënten die nodig zijn om de cellen te scheiden. Voorzichtig laag 20% dichtheid gradiënt oplossing met cellen op de bovenkant van het verloop(en). Als u slechts één verloopbuis voor cellen gebruikt, staat u bovenaan de balansgradiëntbuis met een 20% dichtheidsgradiëntoplossing van 20%.
5. Dop de buizen en centrifuge in een zwenk emmer rotor centrifuge voor 30 min bij 4 °C, 2.000 x g, en 0 rem.
6. Na centrifugatie zullen breuken zichtbaar zijn (figuur 2C). Verzamel 2−3 mL fracties in verse buizen van 15 mL. Voeg 3−4 volumes steriele 1x HBSS toe aan elke fractie en om te keren om grondig te mengen.
7. Centrifuge op 1.000 x g gedurende 3 min tot pelletcellen. Verwijder supernatant en resuspend de celpellet in 1−2 mL van PDX verwerkingsmedium.
   OPMERKING: Levensvatbare PDX-celclusters worden meestal gevonden op de 40-55% dichtheidsgradiëntoplossingsinterface (Figuur 2D) met enkele dode/stervende cellen die zich ophopen op de 20−40% dichtheidsgradiëntoplossingsinterface voor de meeste geteste PDX's.
8. Verwijder een klein, representatief aliquot (50−100 μL) voor re-dissociatie met een gelijk volume van dissociatieenzymoplossing om celnummer in de geclusterde celsuspensie te beoordelen. Tel cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde celteller.

4. Hydrogelbereiding en microfluïde plaatverzaaiing

1. Reconstitute HA hydrogel oplossingen (thiol-modified HA, HA-SH; thiol-reactive polyethyleen glycol diacrylaat, PEGDA) volgens de instructies van de fabrikant.
2. Voeg met behulp van een multichannel pipet 50 μL HBSS toe aan alle putten in de kolommen van het observatievenster (kolom 3, 7, 11, 15, 19, 23) van een 2-baans microfluïde plaat om de vochtigheid van de cultuur en optimale beeldomstandigheden te behouden.
3. Bereken het volume van de celsuspensie van sectie 3 die nodig is voor 50 μL hydrogel bij de gewenste celdichtheid (d.w.z. 5.000 cellen/μL). Voor het zaaien van een microfluïde plaat, aliquot het berekende volume in elk van 4 steriele 1,5 mL centrifuge buizen.
   LET OP: HA hydrogels hebben een vaste tijd tot gelatie. Pas het volume van de geloplossing aliquots voor de efficiëntie van de gebruiker bij het afgeven als voortijdige gelatie optreedt.
4. Pas de pH van de HA-SH-oplossing direct voor gebruik aan op 8.0 met 1 N NaOH. Voer een testgelatie uit door 40 μL HA-SH te mengen met 10 μL PEGDA en gelatie na verloop van tijd te monitoren. Gelation begint meestal 5−8 min na het mengen van HA-SH met de PEGDA crosslinker.
5. Centrifuge cel suspensie aliquots gedurende 2 min (200 x g, kamertemperatuur) tot pelletcellen. Verwijder voorzichtig de supernatant en resuspend cellen in het juiste volume van HA-SH.
   OPMERKING: De uiteindelijke hydrogel is een 4:1 HA-SH:PEGDA-oplossing (in volume) zodat cellen opnieuw moeten worden opgetrokken in 40 μL HA-SH voor een eindvolume van 50 μL.
6. Voeg 10 μL PEGDA toe aan één aliquot van cellen in HA. Meng goed en wacht 1−3 min (afhankelijk van de gelatietijd vanaf stap 4.4) voordat u de microfluïde plaat zaait.
   OPMERKING: Het toestaan van de gelatiereactie van start voor het zaaien helpt om de celbezinking te minimaliseren.
7. Breng een tip aan voor het afgeven van 1,5 μL-volumes op een herhaalpipet met één kanaal en laad met cellen in HA hydrogel-oplossing. Vergeet niet om de hydrogel aliquot goed gemengd te houden om een gelijkmatige celverdeling te garanderen.
8. Om de microfluidic plaat te zaaien, lijnt upijppunt loodrecht op de plaat terwijl u voorzichtig de punt in het midden van de gelinlaat plaatst (kolommen 1, 5, 9, 13, 17, 21) om contact te garanderen, maar geen druk bij het afgeven van de hydrogel-oplossing. Werken snel om voortijdige hydrogel stolling te voorkomen, afzien van 1,5 μL gel oplossing in elke gel inham.
9. Observeer de vulstatus van de microfluïde kanalen door vanaf de bovenkant van de plaat, de onderkant van de plaat of per microscoop te bekijken en beoordeel de belasting, met behulp van figuur 3 als leidraad (succesvol laden in figuur 3A, pipetpositioneringsbegeleiding in figuur 3B, gemist in figuur 3C, niet gevuld om te eindigen in figuur 3D, overloop in figuur 3E). Identificeer de noodzakelijke aanpassingen in de techniek die het vulsucces voor de volgende ronde chips kunnen verbeteren (zie discussie voor tips voor het oplossen van problemen).
10. Herhaal stap 4.6−4.9 met de overige 3 aliquots cellen in HA-oplossing. Omkeren van de plaat tijdens de voorbereiding van de volgende aliquot (~ 1 min).
    OPMERKING: De wachttijd van 1 min en de inversie van de plaat verbeteren de 3D-verdeling van de cellen door de celbezinking te verminderen naarmate gelatie optreedt.
11. Nadat alle chips zijn gevuld, ontcunificeren de plaat bij 37 °C in een bevochtigde couveuse tot gelatie is voltooid (~ 45 min).
12. Zorg er met behulp van de meegeleverde handleiding voor dat de perfusierotator in de celkweek incubator wordt geïnstalleerd met de juiste perfusie-instellingen (14° hoek, intervallen van 4 min).
13. Voeg 50 μL PDX-kweekmedium toe aan alle medium inhammen (kolommen 2, 6, 10, 14, 18, 22) en controleer of de kanalen goed gevuld worden door de plaat om te draaien. Tik de plaat voorzichtig tegen een oppervlak om de vloeistof aan te moedigen om de microfluïde kanalen te vullen.
14. Voeg 50 μL DMEM-F12 (10% FBS) toe voor alle middelgrote verkooppunten (kolom 4, 8, 12, 16, 20, 24). Als er luchtbellen in het perfusiekanaal zitten, verwijder dan door de plaat voorzichtig tegen een oppervlak te tikken.
15. Met behulp van een microscoop en plaat lay-out vorm (Aanvullende figuur 1), record chip vullen succes. Sluit verkeerd gevulde chips uit voor verder experimenteel gebruik.
16. Plaats de plaat op een kantelende tuimelschakelaar die op een 14° kanteling en een 4 min cyclus wordt geplaatst om perfusie te beginnen. Vervang PDX-kweekmedium om de 2 dagen (eerst 50 μL in de inlaat, dan 50 μL in uitlaat).

5. Celvlekken, beeldvorming en beeldkwantificering

1. Bereid een cel levensvatbaarheid test oplossing met drie fluorescerende kleurstoffen (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, calcein acetoxymethyl [AM]).
   1. Bereid voorraadoplossingen van elke kleurstof als volgt voor: Hoechst 33342 bij 1,6 mM (1 mg/mL) in gedeïmiseerd water; calcein AM op 4 mM in watervrije DMSO; ethidium homodimer-1 bij 2 mM in DMSO/H₂O (1:4, v/v).
      LET OP: De stock calcein AM en ethidium homodimer-1 oplossingen zijn opgenomen in de nota kit in Table of Materials.
   2. Bereid een enkele werkoplossing voor in HBSS of fenol roodvrij medium, met alle drie de kleurstoffen. Optimaliseer de uiteindelijke werkconcentratie voor elk celtype en -matrix, binnen het bereik van 1,6−8,0 μM voor Hoechst 33342, 0,1−10 μM voor calceine AM en 0,1−10 μM voor ethidium homodimer-1.
2. Verwijder kweekmedium en breng de werkbare heidskleurstofoplossing aan op gewenste microfluïde chips (75 μL in inlaat, 25 μL in uitlaat) en plaats 1 uur lang terug op de perfusierocker in de celkweek incubator.
3. Afbeelding van de observatievensters van de gekleurde culturen met behulp van een handmatige of geautomatiseerde confocale microscoop(Tabel van materialen) met fluorescerende filters (vermeld als excitatie / emissie golflengten, in nm) alle kernen (Hoechst 33342, 350/461), dode celkernen (ethidium homodimer-1, 528/617) en levend celcytoplasma (calcein AM, 494/517) waar te nemen.
4. Leg 140 μm Z-stacks vast met een stapgrootte van ≤1 μm met behulp van een 20x luchtdoelstelling. Er zijn drie gezichtsvelden nodig om het hele microkanaal met een kleine overlapafbeelding te maken. Om dubbele bemonstering te voorkomen, afbeelding slechts twee velden van de weergave per chip.
   OPMERKING: Beeldvormingscondities moeten worden geoptimaliseerd om een goede NyQuist-bemonstering te garanderen. In de ervaring van auteurs is een snel beeldvormingssysteem, gebaseerd op deconvolutie van een conventionele epifluorescentiebron of resonantiescanmodus op een confocale, noodzakelijk om een complete Z-stack, met drie laserkleuren, binnen een redelijke hoeveelheid tijd volledig te testen op een plaat (ongeveer 3,5 uur met geautomatiseerde beeldvorming, inclusief setup).
5. Met behulp van software voor beeldanalyse u de Z-stack-afbeeldingen testen op de gewenste gekwantificeerde gegevens, zoals morfologie, aggregatiestatus of andere functies. Als u de levensvatbaarheid van cellen wilt kwantificeren, telt u het aantal dode cellen (rood) en de totale celkernen (blauw).

Resultaten

Een programmeerbare perfusie rocker werd bereid in een standaard water-jacked cel cultuur incubator, en twee-lane microfluïde platen werden bereid in een standaard biosafety kast voor het laden (Figuur 1). Een MDA-PCA-118b PDX tumor werd uitgebreid in vivo, geoogst wanneer het een maximale grootte had bereikt, en gescheiden zoals beschreven in protocol sectie 2 om een drijfmest suspensie van cellen te creëren, op ongeveer een eencellige toestand (Figuur 2A). De ...

Discussie

Hier beschrijven we een methode voor het verwerken en kweken van levensvatbare PDX-afgeleide tumorcellen in een hoge doorvoer, geperfuseerd 3D-kweeksysteem. Hoewel dit protocol pca PDX-weefsel gebruikt, is het even effectief voor andere epitheliale tumoren. Tumorkenmerken variëren tussen individuele PDX-lijnen, zelfs binnen hetzelfde weefsel van oorsprong (prostaat, borst, enz.). Sommige PCa PDX lijnen zijn meer fibrotische en moeilijk te isoleren levensvatbare cellen uit, terwijl anderen zijn meer cellulaire. De tumor g...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1N NaOH			elke geschikte weefselkweekkwaliteit
60 mm ronde weefselkweekschalen			elke geschikte
6-well weefselkweekplaten			elke geschikte
70 µm celstrainers	Corning	431751	of gelijkwaardig
Centrifuge	Eppendorf	5810R met geschikte rotor en emmers voor 15/50 mL kegelcentrifugebuizen	of gelijkwaardig
Dichtheidsgradiënt centrifugatie oplossing	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimethylsulfoxide			elke geschikte weefselkweekkwaliteit
Dissociatie-enzymoplossing	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	of gelijkwaardig
Pincetten			elke geschikte
HA hydrogel kit	ESI BIO	GS311	HyStem (Hyaluronzuur-SH en PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	of gelijkwaardig
Heat-inactivated foetaal bovien serum	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	of gelijkwaardig
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	of gelijkwaardig
Beeldverwerkingssoftware	Oxford Instruments	Imaris 9.3	of gelijkwaardig
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	of gelijkwaardig
Microfluidische kweekplaat	Mimetas	9603-400-B	2-lane OrganoPlate
Microscoop	Nikon	A1R	of gelijkwaardig
Meerkanaals pipet	Eppendorf	3125000036	of gelijkwaardig
PDX-afgeleid tumorweefsel			verkregen onder IRB-goedkeuring voor menselijk weefsel en IACUC-goedkeuring voor dierlijke gastheer
Penicilline-streptomycine	ThermoFisher Scientific	15140-122	of gelijkwaardig
Perfusie rocker	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9)			elke geschikte
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Lonza	17-516F	of gelijkwaardig
Schermessen			elke geschikte
Roterende xy-shaker	VWR	Advanced 3500 Orbital Shaker	of gelijkwaardig
Scalpelgreep			elke geschikte
Eenkanaals herhaalpipet	Eppendorf	22260201
Steriele, 15mL kegelcentrifugebuizen			elke geschikte
Steriele, 50mL kegelcentrifugebuizen			elke geschikte