Bemonstering en analyse van geursignalen van dieren

Samenvatting

We hebben een effectieve methodologie ontwikkeld voor het bemonsteren en analyseren van geursignalen om te begrijpen hoe ze kunnen worden gebruikt in diercommunicatie. In het bijzonder gebruiken we headspace solid-phase microextractie in combinatie met gaschromatografie-massaspectrometrie om de vluchtige componenten van dierlijke geuren en geurmarkeringen te analyseren.

Samenvatting

We hebben een effectieve methodologie ontwikkeld voor het bemonsteren en analyseren van geursignalen, door gebruik te maken van headspace solid-phase microextractie in combinatie met gaschromatografie-massaspectrometrie, om te begrijpen hoe ze kunnen worden gebruikt in dierlijke communicatie. Deze techniek maakt de semi-kwantitatieve analyse van de vluchtige componenten van geurafscheidingen mogelijk door de scheiding en voorlopige identificatie van de componenten in het monster mogelijk te maken, gevolgd door de analyse van piekgebiedverhoudingen om te zoeken naar trends die verbindingen kunnen betekenen die betrokken kunnen zijn bij signalering. De belangrijkste sterke punten van deze huidige aanpak zijn het bereik van steekproeftypen die kunnen worden geanalyseerd; het ontbreken van een complexe monstervoorbereiding of extracties; het vermogen om de componenten van een mengsel te scheiden en te analyseren; de identificatie van de gedetecteerde componenten; en de mogelijkheid om semi-kwantitatieve en potentieel kwantitatieve informatie te verstrekken over de gedetecteerde componenten. De belangrijkste beperking van de methodologie heeft betrekking op de monsters zelf. Aangezien de componenten van specifiek belang volatiel zijn en deze gemakkelijk verloren kunnen gaan of hun concentraties kunnen worden gewijzigd, is het belangrijk dat de monsters na het verzamelen op de juiste manier worden opgeslagen en vervoerd. Dit betekent ook dat de opslag- en transportomstandigheden van monsters relatief duur zijn. Deze methode kan worden toegepast op een verscheidenheid aan monsters (waaronder urine, uitwerpselen, haar en geur-klier geur afscheidingen). Deze geuren bestaan uit complexe mengsels, die voorkomen in een reeks matrices, en vereisen dus het gebruik van technieken om de afzonderlijke componenten te scheiden en de verbindingen van biologisch belang te extraheren.

Inleiding

Er is zeer weinig bekend over de chemische veranderingen die ten grondslag liggen aan de reuksignalen bij dieren¹, ook vanwege methodologische uitdagingen bij het registreren en kwantificeren van vluchtige chemische profielen van geuren². Er zijn verschillende mogelijke valkuilen bij het werken met zeer complexe, chemische matrices; deze omvatten bij het bemonsteren en analyseren van de geurmonsters³.

In het Rosalind Franklin Science Center, University of Wolverhampton, zijn we bezig met de analyse van geuren en geurmerken om te begrijpen hoe ze door dieren kunnen worden gebruikt. We combineren semiochemie met gedragsecologie, endocrinologie en cytologie om ons begrip van de rol van reuksignalen in dierlijke communicatie te verbeteren.

We hebben een methodologie ontwikkeld en vervolgens geuren en markeringen geanalyseerd van verschillende soorten, waaronder verschillende niet-menselijke primaten (d.w.z. gekroonde maki's, roodharige maki's, Japanse makaken, olijfbavianen, chimpansees) en andere zoogdieren (d.w.z. katten, koeien). We hebben een verscheidenheid aan monsters verzameld en geanalyseerd, waaronder urine, uitwerpselen, haar en geur-klier geur afscheidingen. Deze geuren en geurmerken bestaan uit complexe mengsels van verbindingen en daarom moet elke methodologie die voor hun analyse wordt gebruikt, een vorm van separatorietechniek bevatten. Zoals geïllustreerd, komen ze ook voor in een reeks matrices die het gebruik van technieken vereisen om de componenten van belang te extraheren.

Eerdere studies van Vaglio et al.⁴ en andere auteurs⁵ gebruikten dynamische headspace-extractie (DHS) met gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), terwijl ook directe oplosmiddelextractie⁶ en complexe oplosmiddelextracties⁷ zijn gebruikt. Bij dynamische headspacebemonstering gaat het met name om het zuiveren van de headspace met een bekend volume inert gas dat uiteindelijk alle vluchtige stoffen verwijdert, met uitzondering van die welke een sterke affiniteit voor de monstermatrix vertonen (bijvoorbeeld polaire verbindingen in waterige monsters).

Voor de huidige methodologie hebben we de techniek van headspace solid-phase microextractie (HS-SPME) in combinatie met GC-MS overgenomen. In het bijzonder hebben we de methodologie ontwikkeld en verbeterd die al door Vaglio et al. werd gebruikt in zijn vorige GC-MS-laboratorium^8,9,10.

Oplosmiddelloze extractietechnieken zijn zeer effectief voor het analyseren van kleine, zeer vluchtige verbindingen (die anders gemakkelijk uit een monster kunnen worden verloren) omdat deze methoden verbindingen immobiliseren op een stabiele, solide faseondersteuning. De HS-SPME maakt gebruik van een vezel bedekt met een adsorberend polymeer om vluchtige stoffen in de monsterhoofdruimte op te vangen of om opgeloste verbindingen te extraheren door onderdompeling in een waterige biologische vloeistof¹¹. De polymeercoating bindt de verbindingen niet sterk, daarom kunnen ze door verhitting in de injectiepoort van de GC worden verwijderd. Deze methode is krachtiger dan oplosmiddelextractietechnieken en ook effectiever dan DHS.

In de huidige aanpak zitten monsters in glazen flacons. Deze flacons worden opgewarmd tot een temperatuur van 40 °C om de lichaamstemperatuur van de dieren te simuleren om de vluchtige componenten van de geurmarkering te bevorderen om de hoofdruimte van de flacon in te nemen. Een SPME-vezel, bedekt met 65 μm polydimethylsiloxaan/divinylbenzeen (PDMS/DVB) sorbentmateriaal, wordt blootgesteld aan de headspace-omgeving en vluchtige componenten uit het monster worden op de vezel geadsorbeerd. Bij het verwarmen van de vezel in de inlaatpoort van een GC-MS worden de vluchtige componenten uit de vezel gedesorbeerd en vervolgens gescheiden door de GC. Massaspectrale fragmentatiepatronen worden verkregen voor elk onderdeel met behulp van de MS. Door deze massaspectra te vergelijken met massaspectraal databases, kan het mogelijk zijn om voorlopig de componenten van het geurmerk te identificeren. Door het gebruik van een auto-sampler zijn we in staat om meerdere samples in batches op een consistente manier te analyseren.

Aangezien elk type SPME-vezel een andere affiniteit heeft met polaire chemicaliën, wordt de vezel meestal gekozen afhankelijk van de polariteit en/ of het molecuulgewicht van de doelchemische verbindingen. Bovendien worden de GC-omstandigheden gewijzigd afhankelijk van het type GC-kolom en de kenmerken van de doelchemische verbindingen.

Deze techniek maakt de semi-kwantitatieve analyse van de vluchtige componenten van geurmarkeringen mogelijk door de scheiding en voorlopige identificatie van de componenten in het monster mogelijk te maken, gevolgd door de analyse van piekgebiedverhoudingen om te zoeken naar trends die componenten van de geurmarkering kunnen betekenen die betrokken kunnen zijn bij signalering.

De belangrijkste sterke punten van deze huidige aanpak zijn:

• Het bereik van voorbeeldtypen die kunnen worden geanalyseerd.
• Er zijn geen complexe monstervoorbereidingen of extracties nodig.
• Het vermogen om vluchtige componenten te analyseren.
• De mogelijkheid om de componenten van een mengsel te scheiden.
• Om de gedetecteerde componenten te kunnen identificeren.
• De mogelijkheid om semi-kwantitatieve en potentieel kwantitatieve informatie te verstrekken over de gedetecteerde componenten.

Protocol

1. Monsterverzameling

1. Monstergeuren die een van de volgende zijn:
   1. Verzamel spontaan vrijgegeven door gewennende proefpersonen (bijv. dierentuin primaten) via geurmarkering op steriel filterpapier (bijv. geur-kliergeurafscheidingen) of rechtstreeks in flacons (bijv. urine).
   2. Verzamel door steriele wattenstaafjes te wrijven na de training van proefpersonen met behulp van positieve versterkingstraining.
   3. Verzamelen door steriele wattenstaafjes te wrijven na sedatie van proefpersonen.
2. Plaats monsters in steriele 10 ml schroefgedoppen doorzichtige glazen flacons en sluit af met schroefdoppen met FTFE/siliconen septa. Bewaar ze onmiddellijk bij -20 °C.
   OPMERKING: Het is van vitaal belang om schone persoonlijke beschermingsmiddelen te gebruiken, zoals nitrilhandschoenen; ze regelmatig te wijzigen; vermijd direct huidcontact met monsters en flacons. Het verdient de voorkeur om gloednieuwe flacons te gebruiken; in het geval van gebruikte flacons is het echter van vitaal belang om de flacons vooraf schoon te maken en vervolgens hetzelfde protocol te gebruiken.
3. Neem omgevingsvlekken elke keer dat geurvlekken worden verzameld. Verzamel bijvoorbeeld de bemonsteringsmedia (bijv. filterpapier of wattenstaafje) en een flacon met hoofdruimte die tijdens de bemonstering aan de omgeving worden blootgesteld.

2. Monstervoorbereiding

1. Bereid monsters in het veld voor door met een mes een vierkant van ongeveer 10 mm van een met geur gemarkeerd filterpapier of de kop van het wattenstaafje te snijden en in een flacon met schroefruimte van 10 ml te plaatsen.
2. Nadat elk monster is bereid, verwijdert of reinigt u het mes dat wordt gebruikt om de bemonsteringsmedia te snijden met een geschikt antibacterieel doekje en/of alcohol en droogt u het grondig.
3. Bewaar alle monsters bij -20 °C.
   OPMERKING: Voorkeur bij -20 °C of anderszins zo laag mogelijk in het veld.

3. Voorbereiding op de analyse

1. Haal de monsters uit de vriezer en laat het op natuurlijke wijze opwarmen tot kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur.
2. Stel de analysemethode op de GC-MS als volgt in:
   1. Volg voor SPME-analyseomstandigheden de aanwijzingen van de fabrikant om SPME-vezels voor het eerste gebruik te conditioneren: vezelvoorconditionering (260 °C gedurende 5 min), monster incubatie (40 °C gedurende 2 min), extractietijd (15 min), desorptietijd (2 min) en vezel na de conditie (260 °C gedurende 20 min).
   2. Gebruik de volgende GC-omstandigheden: kolom (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), injectortemperatuur (270 °C), debiet (1 ml/min), injectiemodus (splitless), GC-ovenprofiel (45 °C gedurende 2 min; 4 °C/min tot 170 °C; 20 °C/min tot 300 °C), MSD-overdrachtsleiding (2°C).
      OPMERKING: Om de consistentie van de bewaartijd van het monster te verbeteren, is de analysemethode retentietijd vergrendeld).
   3. Gebruik de volgende MSD-omstandigheden: oplosmiddelvertraging (2,5 min) en scanbereik (29 tot 400 amu).
      OPMERKING: In de vorige protocollen⁴werd een bereik van 10 tot 400 gebruikt.
3. Zorg ervoor dat de spoelgastoevoer naar de vezelconditioneringseenheid is ingeschakeld.
   OPMERKING: Het is van vitaal belang dat de SPME-assemblage correct in de auto-sampler is geïnstalleerd en dat deze is uitgelijnd op de auto-sampler trays, fiber conditioning unit en GC inlaatpoort. Onjuiste uitlijning kan leiden tot beschadiging of vernietiging van de SPME-vezel.

4. Analyse

1. Plaats een lege flacon met hoofdruimte (om als systeem leeg te fungeren) in de eerste positie van de GC-MS auto-sampler lade. Plaats de milieu blank in de tweede positie van de auto-sampler tray. Plaats de monsters voor analyse in de volgende posities van de lade voor automatisch monster.
2. Maak een analytische volgorde om elk monster in de monsterlade te analyseren.
   1. Selecteer In het startscherm van MassHunter Sequence | Laadvolgorde.
   2. Vul de volgtabel voor alle spaties en monsters in door de juiste informatie in te voegen. Sla de voltooide volgtabel op.
      OPMERKING: De exacte informatie voor de volgtabel is afhankelijk van de opmaak van de laboratoria voor de tabel. Minimale informatie omvat normaal gesproken het monstertype, de monsternaam, de locatie en het nummer van de flacon, de analysemethode en de locatie en naam van het gegevensbestand (toewijzing van een gegevensbestandnaam die overeenkomt met de voorbeeldnaam helpt toekomstige gegevensverwerking). Tijdens de analyse kunnen extra monsters aan de reeks worden toegevoegd.
3. Voer de reeks uit door | Reeks uitvoeren.
4. Breng na analyse de monsters zo snel mogelijk terug in de vriezer.
   OPMERKING: het is mogelijk om monsters opnieuw te analyseren, maar er moet worden opgemerkt dat sommige vluchtige componenten tijdens de eerste analyse volledig zijn geëxtraheerd en dat sommige verbindingen thermische en bacteriële afbraak bij 40 °C hebben ondergaan, zodat het resulterende chromatogram mogelijk niet grondig representatief is voor de oorspronkelijke geurmarkering.

5. Gegevensanalyse

OPMERKING: De eerste gegevensanalyse omvat de integratie van chromatogrammen om retentietijd- en piekgebiedgegevens te verkrijgen, samen met voorlopige identificatie van pieken met behulp van ChemStation-software en NIST (National Institute of Standards and Technology) massaspectraal databases, versie MSD F.01.01.2317. Data-analyse kan handmatig of via een semi-geautomatiseerde methode worden uitgevoerd. Als de semi-geautomatiseerde methode wordt gebruikt, is het soms nuttig om een zekere mate van handmatige gegevensanalyse uit te voeren om voorlopige identificaties te verifiëren.

1. Open het gegevensbestand door op het juiste bestand in de linkernavigatiebalk te klikken. Het totale ionenchromatogram (TIC) wordt weergegeven in het bovenste venster van het scherm voor gegevensanalyse.
2. Als u de TIC wilt integreren met behulp van de RTE-integrator, selecteert u Chromatogram | Integreren.
3. Pas integratieparameters aan zodat pieken die groter zijn dan 3 x basislijnruis worden geïntegreerd. Selecteer Chromatogram | MS-signaalintegratieparameters. Pas in het uitvoervak het minimale piekgebied aan indien van toepassing (1.0 levert in onze voorbeelden acceptabele resultaten op).
4. Als u pieken wilt identificeren en een overzichtsrapport wilt genereren, selecteert u Rapporten exporteren | Zoekresultaten bibliotheek rapporteren aan XLS.
   OPMERKING: De spectrale bibliotheken die moeten worden doorzocht, samen met het aantal bibliotheekmatches dat moet worden weergegeven, moeten in de software worden ingesteld voordat een bibliotheekzoekopdracht kan worden uitgevoerd.
5. Het resulterende spreadsheetrapport bevat integratiegegevens voor elke piek en een voorlopige spectrale bibliotheekmatch om identiteit toe te wijzen. Normaal gesproken moet de overeenkomst tussen bibliotheekkwaliteit en bibliotheek worden >80 om de voorlopige identificatie te accepteren. Sla de spreadsheet op.
6. Identificeer een piek rechtstreeks vanuit de TIC.
   1. Kies de piek van interesse.
   2. Als de piek klein is, zoomt u in door een vak rond de piek te tekenen door de linkermuisknop ingedrukt te houden, het vak over de piek te strekken en los te laten.
   3. Plaats de cursorlijn zo dat deze zich op het hoogste punt van de piek (of net erna) bevindt.
   4. Dubbelklik op de rechtermuisknop en het massaspectrum voor de piek verschijnt in het onderste venster van het gegevensanalysescherm.
   5. Als u de spectrale bibliotheek wilt doorzoeken, verplaatst u de cursor ergens in het spectrale venster en dubbelklikt u op de rechtermuisknop. De zoekresultaten van de bibliotheek worden in een nieuw venster weergegeven.
   6. Om de achtergrondruis uit een interessant spectrum te verwijderen, dubbelklikt u eerst op de rechtermuisknop op de betreffende piek. Dubbelklik vervolgens op de rechtermuisknop in een gebied zonder pieken direct voor de piek van interesse. Selecteer Chromatogram | Trek spectra af. Het afgetrokken spectrum wordt weergegeven in het onderste venster van het gegevensanalysescherm en geeft '(-)' weer naast de SCAN-gegevens in de vensterkop.

Resultaten

Volgens dit protocol identificeerden we voorlopig in totaal 32 vluchtige chemische stoffen uit de analyse van 14 ano-genitale geursporen die spontaan op filterpapier werden vrijgegeven door rood-ruches maki's (Varecia variegata rubra) en vergeleken geurprofielen met kenmerken van de signaalgever¹². Natuurlijk voorkomende vluchtige stoffen, zoals koolwaterstoffen, terpenen, terpeenalcoholen en ketonen, waren aanwezig in deze profielen en omvatten verbindingen die eerder waren gevonden als ...

Discussie

Het gebruik van controlemonsters, zowel milieucontroles die zijn gemaakt op het moment van monsterverzameling als systeem blanks, zijn cruciaal voor de interpretatie van de geurmerkmonsters. Pieken die worden toegeschreven aan de bemonsteringsomgeving of het instrumentele systeem moeten worden uitgesloten van geursponsmonsters, zodat alleen de pieken van belang in elke interpretatie worden opgenomen. Deze controles kunnen ook een rol spelen bij het beoordelen en monitoren van de "gezondheid" van de instrumentatie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10 mL autosampler vials	Agilent	5188-5392	10 ml schroefdopbuisjes met
18 mm vial caps	Agilent	8010-0139	Magneet met PTFE/siliconen septa
Autosampler	Agilent	GC120 PAL autosampler
Capillary column	Agilent	HP5-MS	30 m x 0.25 mm; 0.25 µm
Data analysis software	Agilent	-	ChemStation
Gas Chromatograph	Agilent	7890B
Inlet septa	Agilent	5182-3442	Merlin microseal
Mass Selective Detector	Agilent	5977A
Reporting software	Microsoft	-	Excel
Spectral library	NIST	-	NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library
Spectral library search program	NIST	-	MS Search v.2.2
Splitless Inlet liner	Agilent	5190-4048
SPME fibres	Agilent	SU57345U	65 µm PDMS/DVB vezel