Methodenartikel

Karakterisering van in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door RNA-Seq Analyse

DOI:

10.3791/60905

⸱

16 mei 2020

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, 3Department of Human Genetics, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier gepresenteerd is een stapsgewijze procedure voor in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door contactremming gevolgd door karakterisering op moleculair niveau door RNA-seq analyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke primaire keratinocyten worden vaak gebruikt als in vitro modellen voor studies over epidermale differentiatie en aanverwante ziekten. Methoden zijn gemeld voor in vitro differentiatie van keratinocyten gekweekt in tweedimensionale (2D) ondergedompelde manieren met behulp van verschillende inductie voorwaarden. Hier beschreven is een procedure voor 2D in vitro keratinocyten differentiatie methode door contactremming en latere moleculaire karakterisering door RNA-seq. Kortom, keratinocyten worden geteeld in gedefinieerd keratinocyten medium aangevuld met groeifactoren totdat ze volledig samenvloeien. Differentiatie wordt veroorzaakt door nauwe contacten tussen de keratinocyten en verder gestimuleerd door het uitsluiten van groeifactoren in het medium. Aan de hand van RNA-seq-analyses wordt aangetoond dat beide 1) gedifferentieerde keratinocyten verschillende moleculaire kenmerken vertonen tijdens differentiatie en 2) het dynamische genexpressiepatroon lijkt grotendeels op cellen tijdens epidermale gelaagdheid. Wat de vergelijking met normale keratinocyten differentiatie, keratinocyten dragen mutaties van de transcriptie factor p63 vertonen veranderde morfologie en moleculaire handtekeningen, in overeenstemming met hun differentiatie gebreken. Tot slot beschrijft dit protocol de stappen voor 2D in vitro keratinocyten differentiatie en de moleculaire karakterisering ervan, met de nadruk op bio-informatica analyse van RNA-seq gegevens. Omdat RNA extractie en RNA-seq procedures zijn goed gedocumenteerd, het is niet de focus van dit protocol. De experimentele procedure van in vitro keratinocyten differentiatie en bio-informatica analyse pijplijn kan worden gebruikt om moleculaire gebeurtenissen te bestuderen tijdens epidermale differentiatie in gezonde en zieke keratinocyten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke primaire keratinocyten afgeleid van de menselijke huid worden vaak gebruikt als een cellulair model om de biologie van de opperhuid1,2,3,4te bestuderen . De gelaagdheid van de opperhuid kan worden gemodelleerd door keratinocyten differentiatie, hetzij in een 2D ondergedompeld monolayer mode of 3D lucht-lift organotypic model2,3,5,6,7. Hoewel 3D-modellen steeds belangrijker zijn geworden om de epidermale structuur en functie te beoordelen, worden 2D-differentiatiemodellen nog steeds veel gebruikt, vanwege hun gemak en de mogelijkheid om grote aantallen cellen voor analyses te genereren.

Er zijn verschillende voorwaarden toegepast voor het induceren van keratinocytendifferentiatie in 2D, waaronder toevoeging van serum, hoge concentratie calcium, lagere temperatuur en remming van epidermale groeifactorreceptoren2,3. Elk van deze methoden is gevalideerd door een aantal keratinocyten differentiatie marker genen en aangetoond effectief te zijn in de beoordeling van keratinocyten differentiatie, ook onder pathologische omstandigheden. Deze inductieomstandigheden vertonen echter ook verschillen in hun differentiatieefficiëntie en kinetiek wanneer specifieke panelen van markergenen worden onderzocht2,3.

Een van deze methoden omvat keratinocyten contactremming en uitputting van groeifactoren in het cultuurmedium8. Het is aangetoond dat keratinocyten spontaan kunnen differentiëren wanneer cellen de volledige dichtheid bereiken.  Het uitsluiten van groeifactoren in het cultuurmedium kan de differentiatie verder verbeteren. De methode die contactremming combineert en groeifactoren uitputten, is aangetoond dat het gedifferentieerde keratinocyten genereert met genexpressiepatronen die vergelijkbaar zijn met de normale gestratificeerde opperhuid bij het gebruik van verschillende opperhuidmarkeringen3,wat suggereert dat dit model geschikt is voor het bestuderen van normale keratinocytendifferentiatie. Onlangs zijn twee uitgebreide genexpressieanalyses van keratinocytendifferentiatie gerapporteerd met behulp van dit model9,10. Onderzoekers valideerden dit model op moleculair niveau en toonden aan dat het kan worden gebruikt om normale en zieke keratinocytendifferentiatie te bestuderen.

Dit protocol beschrijft de procedure voor de in vitro differentiatie methode en moleculaire analyse van gedifferentieerde cellen met behulp van RNA-seq. Het illustreert ook karakterisering van de transcriptie van cellen op differentiatie dag 0 (proliferatie fase), dag 2, dag 4, en dag 7 (vroeg, midden, en late differentiatie, respectievelijk). Het is aangetoond dat gedifferentieerde keratinocyten genexpressiepatronen vertonen die grotendeels lijken op cellen tijdens epidermale gelaagdheid. Om te onderzoeken of deze methode kan worden gebruikt voor het bestuderen van huidpathologie, hebben we dezelfde experimentele en analysepijplijn toegepast om keratinocyten te onderzoeken die mutaties dragen van de transcriptiefactor p63 die zijn afgeleid van patiënten met ectrodactyly, ectodermal displasie en gespleten lip/gehemelte (EEG) syndroom11,12. Dit protocol richt zich op de in vitro differentiatie van keratinocyten en de daaropvolgende bio-informatica analyse van RNA-seq. Andere stappen in de volledige procedure, zoals RNA extractie, RNA-seq monster voorbereiding en bibliotheek bouw, zijn goed gedocumenteerd en kan gemakkelijk worden gevolgd, vooral bij het gebruik van vele veelgebruikte commerciële kits. Daarom worden deze stappen slechts kort beschreven in het protocol. De gegevens tonen aan dat deze pijpleiding geschikt is voor het bestuderen van moleculaire gebeurtenissen tijdens epidermale differentiatie in gezonde en zieke keratinocyten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huidbiopten werden genomen uit de stam van gezonde vrijwilligers of patiënten met p63 mutaties, om de primaire keratinocytencultuur op te zetten. Alle procedures voor de oprichting van menselijke primaire keratinocyten zijn goedgekeurd door de ethische commissie van het Radboud Universitair Medisch Centrum Nijmegen (Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen). Er werd geïnformeerde toestemming verkregen.

1. Menselijke primaire keratinocytendifferentiatie door contactremming

  1. Bereid keratinocyten groeimedium (KGM) van Keratinocyte Basal Medium (Tabel van materialen) indien nodig.
  2. Maak 500 mL proliferatiemedium met behulp van vooraf bereide voorraden (KGM-pro; zie tabel 1).
  3. Maak 500 mL-differentiatiemedium (KGM-dif; zie tabel 2).
    LET OP: KGM met supplementen kan twee weken op 4 °C worden gehouden. Voor een langere opslag kan het worden opgeslagen en opgeslagen bij -20°C.
  4. Zaad primaire keratinocyten in de dichtheid van 5,0-20 x 103 cellen/cm2, afhankelijk van de celprolifererende capaciteit. Voeg voldoende KGM-pro medium toe om cellen te bedekken.
    LET OP: 1) Details van de reguliere celcultuur binnen KGM medium zijn te vinden op de website van Lonza13. 2) De zaaidichtheid moet voor elke cellijn worden getest. Een normale primaire keratinocytenlijn kan bijvoorbeeld worden gezaaid met een dichtheid van 5,0 x 103 cellen/cm2, terwijl een lijn met mutaties in de transcriptiefactor p63 die minder prolifererend is, moet worden gezaaid bij een dichtheid van 20 x 103 cellen/cm2. 3) Afhankelijk van de experimentele opstelling moeten verschillende schotels of putten van cellen worden gezaaid om monsters op verschillende differentiatiedagen in replica's te kunnen verzamelen.
  5. Vernieuw cellen met het KGM-pro medium gedurende twee dagen na het zaaien (zaaien op dag 0, verfrissend voor de1e keer op dag 3). Daarna, vernieuwen met KGM-pro medium om de andere dag. Controleer cellen regelmatig, ten minste om de andere dag.
  6. Induceer celdifferentiatie wanneer cellen meer dan 90% samenvloeien door het medium te veranderen in KGM-dif. De dag van het veranderen van medium naar KGM-dif wordt gedefinieerd als differentiatiedag 0. Verzamel cellen voor verdere RNA-analyses door eerst 2x te wassen met DPBS, daarna in de lysebuffer (van een RNA-extractiekit) op te nemen.
    OPMERKING: Met de bovengenoemde zaaidichtheid moeten cellen binnen 7-10 dagen samenvloeiing bereiken. Cellen kunnen worden gezaaid met een hogere initiële dichtheid om samenvloeiing sneller te bereiken. Als cellen niet proliferative zijn, kan langer wachten geen aanleiding geven tot volledig samenvloeiende cellen. Een hogere zaaidichtheid kan nodig zijn.
  7. Vernieuw cellen met het KGM-dif medium elke dag en verzamel cellen op differentiatiedag 2, 4. en 7 voor verdere RNA-extractie.

2. RNA-extractie

  1. Isoleer totaal RNA. Dit kan worden uitgevoerd met behulp van een commerciële RNA isolatie kit (zoals Zymo Quick-RNA MicroPrep RNA), of met behulp van fenol14. Echter, een isolatie kit met een DNAse behandeling wordt sterk aanbevolen voor RNA-seq monsters om DNA-besmetting en fenol te voorkomen. Een voorbeeld van een commerciële RNA-isolatie kit wordt gegeven in de tabel van materialen.
  2. Meet de RNA-concentratie met een spectrometer. Zowel DNA als RNA hebben een absorptiepiek van 260 nm.
    LET OP: 1) De verhouding tussen de absorpties op 260 nm en 280 nm wordt gebruikt om de zuiverheid van het RNA te beoordelen. Een verhouding van ongeveer 2,0 wordt algemeen aanvaard als 'puur' RNA. Als de verhouding aanzienlijk lager is dan 2,0, kan het monster besmet zijn met verontreinigingen die bij 280 nm absorberen, zoals eiwitten, fenolen of andere stoffen. 2) De verhouding tussen de absorpties op 260 nm en 230 nm meet nucleïnezuur zuiverheid. Er wordt een ratio tussen 2,0 en 2,2 verwacht. Als de verhouding aanzienlijk lager is, kan het monster besmet zijn met verontreinigingen die 230 nm absorberen, zoals EDTA, ethanol of andere stoffen.

3. RNA-kwaliteitscontrole

  1. Voer RNA uit op een bioanalyzer RNA Pico-chip om RNA Integrity Number (RIN) kwantitatief te valideren, of op een gel voor een kwalitatieve maat. In het algemeen is een RIN van ten minste acht zeer aan te raden. Echter, bij het extraheren van RNA uit weefsels de RIN lager kan zijn.
    OPMERKING: Optioneel kan de kwaliteitscontrole worden uitgevoerd door qPCR op het RNA-materiaal.

4. RNA-seq bibliotheekvoorbereiding

LET OP: De RNA-seq bibliotheek voorbereiding wordt vaak uitgevoerd met een commerciële kit of onder commerciële instellingen. Het beschreven protocol is aangepast van een commerciële kit, KAPA RNA HyperPrep Kit met RiboErase (Illumina), met een korte beschrijving van alle vereiste stappen: rRNA uitputting met oligo hybridisatie aan menselijke ribosomale RNAs, RNA fragmentatie, eerste streng synthese, tweede streng synthese en A-tailing, en na het opruimen van elke stap15. Andere bibliotheekvoorbereidingskits kunnen ook voor dit doel worden gebruikt. Het wordt aanbevolen om deze stap uit te voeren met behulp van een commercieel beschikbare kit, omdat de kwaliteit van de gegenereerde cDNA-bibliotheek vaak consistenter is. 2) De volgende stappen worden beschreven voor 1x bibliotheekvoorbereiding. Als u meerdere monsters voorbereidt, maakt u mastermixen met 10% extra volume.

  1. Oligo-hybridisatie en rRNA-uitputting
    1. Oligo hybridisatie master mix voorbereiden (totaal = 11 μL, met 4,4 μL hybridisatiebuffer, 4,4 μL hybridisatie oligo's en 2,2 μL RNase-vrij water) en uitputtingsmastermix (totaal = 5,5 μL, met 3,3 μL uitputtingsbuffer en 2,2 μL RNase H).
    2. Stel het PCR-reactieprogramma in op een thermocycler: 95 °C gedurende 2 min; hellingsgedemper tot 45 °C bij -0,1 °C/s; pauze van 45 °C; 45 °C gedurende 30 minuten; 4 °C voor altijd.
      OPMERKING: Overweeg om te beginnen met het dubbele van de hoeveelheid RNA dan nodig is voor versterking. Gebruik in de eerste poging de helft van het bedrag om door te gaan met de volgende stappen. Dit is om ervoor te zorgen dat er nog steeds materiaal is om deze stappen te herhalen met een ander aantal cycli (zie stap 4.7.2), als de cycli van versterking onvoldoende of overgeamplificeerd blijken te zijn.
    3. Gebruik tussen 25 ng en 1 μg totaal RNA in 10 μL RNAse-vrij water, voeg 10 μL oligo hybridisatie master mix toe. Plaats monsters in de voorgeprogrammeerde thermocycler en start het programma.
    4. Wanneer het programma de pauzestap bij 45 °C bereikt, voegt u 5 μL uitputtingsmastermix toe aan de 20 μL-hybridisatiereactie zonder deze uit de thermocycler te verwijderen. Meng grondig door pipetting op en neer meerdere malen.
    5. Hervat het thermocyclerprogramma om door te gaan met de uitputtingsstap (45 °C gedurende 30 min).
      OPMERKING: 1) Zet de kralen voor rRNA-uitputting (bijvoorbeeld KAPA pure kralen) bij kamertemperatuur (RT) tijdens de uitputtingsstap voor het volgende deel van het protocol. 2) Overweeg de DNase spijsverteringsmastermix voor te bereiden (voor sectie 4.2), omdat de reagentia direct na de rRNA-uitputtingsopruiming nodig zijn.
    6. Voer een KAPA Pure Beads-opschoning van 2,2x kraal uit: combineer de RNA-mix (25 μL) en KAPA Pure Beads (55 μL), door de kralen in de RNA-mix grondig te resuspend door meerdere keren op en neer te pipetten.
    7. Broed op RT gedurende 5 minuten om RNA-binding aan de kralen mogelijk te maken en plaats de buis(en) op een magneetrek om de kralen vast te leggen totdat de vloeistof helder is, en verwijder en gooi 60 μL supernatant voorzichtig weg.
    8. Houd de buis(en) op de magneet, was 2x met 200 μL ethanol van 80% door de kralen uit te broeden met de ethanol voor ≥30 s en gooi de ethanol weg. Probeer alle resterende ethanol te verwijderen zonder de kralen te storen na de tweede wasbeurt.
    9. Droog de kralen bij RT gedurende 3-5 min of totdat alle ethanol is verdampt.
      LET OP: Overdrogen van de kralen kan leiden tot een lagere opbrengst.
  2. DNase spijsvertering
    1. Bereid de DNase-verteringsmastermix voor (totaal = 22 μL, met 2,2 μL DNase-buffer, 2 μL DNase en 17,8 μL RNase-vrij water).
    2. Resuspend de kralen in DNAse spijsvertering master mix (20 μL) door pipetting op en neer meerdere malen. Incubeer de buis(en) bij RT gedurende 3 minuten om het RNA van de kralen te halen.
    3. Plaats de buis(en) op een magneetrek om de kralen op te vangen, totdat de vloeistof helder is en breng voorzichtig 20 μL supernatant over in een schone buis.
    4. Incubeer de buis(en) met supernatant op 37 °C gedurende 30 min.
      OPMERKING: Overweeg de RNA-elutie,fragmentatie en priming mastermixen (voor sectie 4.3) voor te bereiden, omdat de reagentia direct nodig zijn na het opruimen van de DNase-spijsvertering.
    5. Voer een opschoning op basis van 2,2 x kraal uit door 4.1.6–4.1.9 te volgen.
  3. RNA-elutie, fragmentatie en priming
    1. Bereid de Mastermix Fragment, Prime en Elute Buffer (1x) voor met 11 μL Fragment, Prime en Elute Buffer (2x) en 11 μL RNase-vrij water.
    2. Grondig resuspend de kralen met gezuiverde, DNase-behandeld RNA in 22 μL fragmentatie, Prime en Elute Buffer (1x) door meerdere keren op en neer te pipezen.
    3. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten om RNA van de kraal s teeluteeren en plaats de buis(en) op een magneet om de kralen vast te leggen totdat de vloeistof helder is.
    4. Breng voorzichtig 20 μL supernatant over in een buis(en). Gooi de buis(en) weg met kralen.
      LET OP: Dit is een veilige stopplaats, omdat monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 °C voor ≤24 uur.
    5. Plaats de buis(en) in een thermocycler en voer de fragmentatie en priming gedurende 6 minuten uit op 94 °C. Resulterend in ongeveer 200-300 bp lange fragmenten.
      OPMERKING: Incubeer gedurende 8 minuten bij 94 °C voor 100-200 bpfragmenten. Bij het gebruik van gedeeltelijk gedegradeerd RNA, fragment tussen 1-6 min bij 85 °C, afhankelijk van de ernst van de afbraak.
    6. Plaats de buis(en) op ijs en ga onmiddellijk over tot de eerste strengsynthese.
  4. Eerste strengsynthese
    1. Bereid de eerste bundelsynthesemastermix voor (totaal = 12 μL, met 11 μL eerste strengsynthesebuffer en 1 μL KAPA-script).
    2. Stel het PCR-reactieprogramma in op een thermocycler: 25 °C gedurende 10 minuten; 42 °C gedurende 15 minuten; 70 °C gedurende 15 minuten; 4 °C voor altijd.
    3. Combineer op ijs 20 μL gefragmenteerd geprimed RNA met 10 μL eerste strengsynthesemastermix. Houd de buis(en) op ijs, meng grondig door de reactie meerdere keren op en neer te pipetten.
    4. Plaats de buis(en) in de voorgeprogrammeerde thermocycler en start het programma.
  5. Tweede strengsynthese en A-tailing
    1. Bereid tweede strengsynthese en A-tailing master mix op ijs voor (totaal = 33 μL, met 31 μL tweede strengsynthesebuffer en 2 μL tweede strengsynthese en A-tailing enzymmix).
    2. Stel het PCR-reactieprogramma in op een thermocycler: 16 °C gedurende 30 minuten; 62 °C gedurende 10 minuten; 4 °C voor altijd.
    3. Combineer 30 μL van eerste streng synthese product met 30 μL van tweede streng synthese en A-tailing master mix, en meng grondig door pipetting op en neer meerdere malen op ijs.
    4. Plaats de buis(en) in de voorgeprogrammeerde thermocycler en start het programma.
  6. Adapter ligatie en post-ligation opschoning
    1. Verdun voorraadadapters (NEXTflex DNA barcodes, 25 μM) 3,57x in RNase-vrij water tot 7 μM.
    2. Bereid adapter ligatie master mix (totaal = 50 μL, met 40 μL ligatie buffer en 10 μL van DNA ligase).
    3. Combineer 60 μL tweede streng synthese product, 45 μL adapter ligatie master mix, en 5 μL van verdunde adapters. Meng grondig door pipetting op en neer meerdere malen op ijs.
    4. Incubeer de buizen op 20 °C gedurende 15 minuten en ga onmiddellijk verder met de eerste post ligation cleanup.
    5. Voer een opschonende opschoning van 0,63x kraal uit door het combineren van dna-mix met adapterligated (110 μL) en KAPA pure kralen (70 μL), en vervolgens de kralen in de DNA-mix grondig opnieuw op en neer te zetten door meerdere keren op en neer te pipetten.
    6. Herhaal stap 4.1.7–4.1.9.
    7. Haal de buizen uit de magneet. Resuspend de kralen grondig in 50 μL van 10 mM Tris HCL (pH = 8,0–8,5) en de kralen in RT gedurende 2 minuten uitbroeden.
    8. Plaats de plaat op de magneet en wacht tot de vloeistof vrij is. Breng 50 μL van de heldere supernatant over naar een nieuwe buis.
      LET OP: Veilige stopplaats voor minder dan 24 uur bij 4 °C.
    9. Voer een opschoning op basis van 0,7 x kraal uit door 50 μL kralen te combineren met gezuiverd adapter-gebonden DNA met 35 μL PEG/NaCL-oplossing. Meng grondig door vortexing.
    10. Voer opruimstappen 4.1.7–4.1.9 uit. Grondig resuspend de kralen in 20 μL van 10 mM Tris HCL (pH = 8.0–8.5), en de kralen in RT gedurende 2 min uitbroeden.
    11. Leg de plaat op de magneet; wacht tot de vloeistof veilig is. Breng 20 μL van de heldere supernatant over naar een nieuwe buis en ga naar sectie 4.7.
      LET OP: Veilige stopplaats voor minder dan 1 week bij 4 °C of minder dan 1 maand bij -20 °C.
  7. Versterking en opschoning van de bibliotheek
    1. Bereid de bibliotheekversterkingsmastermix voor (totaal = 33 μL, met 27,5 μL 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix en 5,5 μL 10x bibliotheekversterkingsprimermix).
    2. Stel het PCR-reactieprogramma in op een thermocycler met behulp van de volgende parameters. 98 °C voor 45 s; N cycli (zie de noot hieronder) van: 98 °C voor 15 s; 60 °C voor 30 s; 72 °C voor 30 s; 72 °C gedurende 1 min; en 4 °C voor altijd.
      OPMERKING: De cycli voor de versterking van de bibliotheek zijn afhankelijk van het invoermateriaal. Het kan ruwweg als zodanig worden geschat: te beginnen met RNA = 25-100 ng, N = 11–15 cycli; 100-250 ng, N = 9–12 cycli; 250–500 ng, N = 7-10 cycli.
    3. Voer een opschonende opschorting uit op basis van 0,8 x kraal door versterkt bibliotheek-DNA (50 μL) en KAPA zuivere kralen (40 μL) te combineren en vervolgens de kralen in de DNA-mix grondig te hergebruiken door meerdere keren op en neer te pipetten.
    4. Voer opruimstappen 4.1.7–4.1.9 uit. Grondig resuspend de kralen in 50 μL van 10 mM Tris HCL (pH = 8.0–8.5), en de kralen in RT gedurende 2 min uitbroeden.
    5. Breng 50 μL van de heldere supernatant over naar een nieuwe buis en ga naar de tweede bibliotheekversterkingsopruiming.
    6. Voer een opschonende opschoning uit op basis van 1x kraal door versterkt bibliotheek-DNA (50 μL) en KAPA zuivere kralen (50 μL) te combineren en vervolgens de kralen in de DNA-mix grondig te resuspend door meerdere keren op en neer te pipezen.
    7. Voer opruimstappen 4.1.7–4.1.9 uit. Grondig resuspend de kralen in 22 μL van 10 mM Tris HCL (pH = 8.0–8.5), en de kralen in RT gedurende 2 min uitbroeden.
    8. Breng 20 μL van de heldere supernatant over naar een nieuwe buis ga naar Qbit- en bioanalyzermetingen.
  8. Concentratie- en fragmentatiegrootte
    1. Meet dna-concentraties van de monsters. Met behulp van een zeer gevoelige fluorescerende verf-gebaseerde kit (bijvoorbeeld Denovix Qbit, zie Tabel van Materialen), of als de concentratie lijkt te zijn onder 0,5 ng/μL, requantificeren met behulp van een meer gevoelige qPCR aanpak (bijvoorbeeld Kappa Quantification, zie Tabel van Materialen).
    2. Bepaal de fragmentgrootte van de bibliotheek met behulp van hooggevoelige elektroforese (bijvoorbeeld een bioanalist).
      OPMERKING: Optioneel kan kwaliteitscontrole door qPCR worden uitgevoerd voordat sequencing (Appendix) wordt uitgevoerd met behulp van een verdunde geprepareerde bibliotheek in plaats van cDNA.
  9. Sequencing
    1. Stuur de bibliotheek voor sequencing. Voor RNA-seq differentiële genexpressie analyse, een sequencing diepte van leest tussen 10-25 miljoen per monster is over het algemeen voldoende.

5. Voor verwerking van gegevens

  1. Kwaliteitscontrole Fastq-bestanden
    1. Download en installeer Trimgalore16 om basisparen van lage kwaliteit en lege reads in de Fastq-bestanden te verwijderen.
      LET OP: 1) De meeste hier genoemde software werkt alleen in Linux. Indien beperkt tot een Windows-computer, is het mogelijk om analyses uit te voeren op een Linux-server met behulp van de software MobaXterm of Putty. Houd er rekening mee dat voor genoom indexering veel random-access geheugen (RAM) vereist is (ongeveer 64 GB). 2) Het installeren van alle benodigde software in een conda-omgeving is een aanrader. Dit maakt eenvoudige software-installatie en pakketbeheer mogelijk. Ga voor meer informatie over conda naar .
    2. Maak een map (map) voor de gegevens, bijvoorbeeld de map 'RNA_seq_KC_diff'. Stel dit in als de werkmap door te typen: "cd /home/user/RNA_seq_KC_diff/".
      LET OP: Zie 'folder_structure.txt' in de aanvullende coderingsbestanden voor een overzicht van de mapstructuur.
    3. Maak verschillende mappen in de werkmap met de specifieke namen: 'Fastq', 'CRCh38_fasta', 'CRCh38', 'scripts' en 'Mapping'.
    4. Verplaats de fasta-bestanden van de gesequencede gegevens naar de fastq-map. U ook zachte koppelingen genereren met behulp van de opdracht: ln -s home/user/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile naar de Fastq-bestanden om schijfruimte te besparen.
    5. Voer Trim in overvloed op de Fastq-bestanden, zie de TrimGalore.txt bestand voor de code te kopiëren plakken in bash. Wijzig indien nodig mapnamen en -instellingen in de opdracht.
  2. Toewijzing
    1. Download een genoom om de reads in kaart te brengen op bijvoorbeeld hg38 ensembl release 97 (ontmaskerde versie): ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz ; en het bijbehorende genannotatiebestand: hg 38 genannotatie ensembl release 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. Breng beide bestanden over naar de CRCh38_fasta map.
      OPMERKING: Als alternatief gebruik maken van een andere versie van het genoom, bijvoorbeeld, de UCSC-versie van hg38, als mapping om id's te transcripteren in plaats van gen-id's de voorkeur heeft.
    2. Installeer STAR 2.7.117.
    3. Genereer een eigen referentiegenoom met STAR 2.7.1 door het genoomscript te genereren (zie Aanvullende coderingsbestanden). Wijzig de hoeveelheid threads in wat de processer heeft (--runThreadN X). Wijzig indien nodig mapnamen en -instellingen in dit script. Voer het door te kopiëren / plakken in bash.
    4. Installeer samtools 1.918 voor het indexeren van de bam-bestanden en gzip om de wiggle-bestanden te comprimeren.
    5. Lijn de Trim Galore gevalideerde sequencing leest op de menselijk genoom assemblage hg38 (ensembl release 97) met behulp van STAR 2.7.1, gevolgd door indexering met behulp van samtools en gzip. Dit moet worden uitgevoerd met behulp van het script map_fastq.txt (zie Aanvullende coderingsbestanden). Wijzig waar nodig de mapnamen en -instellingen in dit script. Voer het door het kopiëren / plakken in bash.
      OPMERKING: STAR-toewijzing genereert verschillende uitvoerbestanden, waaronder een bam-bestand, een wiggle-bestand en leestellingstabel met de naam *_ReadsPerGene.out.tab, die direct door R kunnen worden gebruikt om te gebruiken als invoer voor Deseq2.
  3. Genoombrowservisualisatie
    1. Installeer wigToBigWig van de UCSC genoom browser tools om bigwig bestanden te genereren met de big2bw script19.
    2. Breng de bestanden 'convertBigWigChroms.py' en 'CRCH38_ensembl2UCSC.txt' van de aanvullende coderingsbestanden over naar een map 'scripts' in de werkmap.
    3. Maak de convertBigWigChroms.py uitvoerbaar (met behulp van de opdracht: 'chmod +x scripts/convertBigWigChroms.py' op een Linux machine).
    4. Genereer bigWig bestanden uit de Wiggle bestanden, met behulp van het script wig2bw.txt (zie Supplemental Coding Files). Voer het door te kopiëren / plakken in bash.
    5. Voer de BigWig-bestanden in op de UCSC genoombrowser of Integrative Genomics Viewer (IGV) voor visualisatie.

6. RNA-seq-gegevensanalyse

  1. Voorbeeldgegevens invoeren in Deseq2
    1. Download en installeer Rstudio (versie 1.1.456) en R (versie 3.6).
    2. Installeer alle vereiste R-pakketten (zie Aanvullende coderingsbestanden).
      OPMERKING: Zie de bijgevoegde bestanden voor een gedetailleerd R-markdown-bestand met alle programmeercode en uitvoer: 'RNA_seq_kc_differentiation_wt.html' en 'RNA_seq_kc_differentiation_patient.html'. Hieronder vindt u een algemene beschrijving van alle stappen.
    3. Een tellingstabel genereren uit de readsPerGene.out.tab-bestanden.
    4. Schrijf een voorbeeldgegevensbestand met alle bestandsnamen, de dag van differentiatie en andere relevante voorbeeldgegevens. Zie 'sample_data_example.csv' in de aanvullende coderingsbestandenvoor een voorbeeldbestand.
    5. Gebruik de teltabel en voorbeeldgegevens om een Deseq220-object te genereren dat zowel de telbare als de voorbeeldgegevens bevat.
  2. Normalisatie van genexpressie, monsterafstand en PCA
    1. Normaliseer de teltabel in het object Deseq2 met deseq2 rld of vst normalisatie. Rld normalisatie heeft de voorkeur, maar met veel monsters, vst normalisatie is veel sneller.
    2. Plot monsterafstand op basis van de genormaliseerde leestellingsintensiteiten met behulp van de "dist" functie in R en vervolgens het uitvoeren van "hclust" clustering op basis van monsterafstand. Plot de heatmap zelf met behulp van het pheatmappakket.
    3. Een PCA-plot genereren van de genormaliseerde leestellingsintensiteiten met behulp van de plotPCA-functie van Deseq2.
      OPMERKING: PCA dient als een hulpmiddel in verkennende gegevensanalyse en kan worden gebruikt om afstand en verwantschap tussen verschillende monsters te visualiseren.
  3. Differentiële/zeer variabele genexpressieanalyse
    1. Bereken de differentiële genen met behulp van de Deseq2-resultaatfunctie. Gebruik echter zeer variabele genen bij het beoordelen van veranderingen in verschillende tijdpunten waarin pairwise vergelijkingen niet van toepassing zijn. In dit geval, extract de top 500 zeer variabele genen via het bestellen op de variantie tussen monsters uit verschillende tijdpunten met de rowVars functie.
      OPMERKING: In onze analyse werden voor de controlemonsters de top 500 zeer variabele genen (de genen met de hoogste standaardafwijking van hun genormaliseerde intensiteit over dagen van differentiatie) gebruikt voor verdere analyse. Echter, voor de zieke vs controle analyse differentieel uitgedrukt genen tussen ziekte en gezonde controles na verloop van tijd werden berekend door Deseq2 met behulp van een meervoudige testen gecorrigeerd p-waarde van 1 x 10-4 als een cutoff. Een andere mogelijke filterstap is het uitsluiten van differentiële genen die minder dan een bepaalde vouwveranderingssnede veranderen.
    2. Voer kmeans clustering uit op het differentiaal of zeer variabele genen om ze te clusteren door verschillende expressiepatronen.
    3. Visualiseer differentieel of zeer variabele genen in een heatmap met behulp van het pheatmappakket. De intensiteit uitgezet in de heatmap is de Deseq2 genormaliseerde intensiteit met de mediaan waarde afgetrokken.
  4. Gen Ontologie (GO) annotatieverrijkingsanalyse
    1. Genereer een lijst van uitgedrukte achtergrondgenen door alle genen met meer dan 10 tellingen in één enkel monster te nemen.
    2. Voer GO-analyse uit met behulp van online tools zoals GOrilla21. Gebruik de lijsten van de differentiaal/zeer variabele genen in clusters als "genlijst", en de achtergrondgenen als achtergrond voor vergelijking.
      OPMERKING: Meer geavanceerde R-gebruikers kunnen het pakketclusterProfiler22 gebruiken om de verrijkingsanalyse van go-term te automatiseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Normale keratinocytendifferentiatie en RNA-seq-analyse
In dit experiment werden keratinocytenlijnen van vijf individuen gebruikt voor differentiatie en RNA-seq-analyses. Figuur 1 vat de experimentele procedure van differentiatie en RNA-seq-analyseresultaten samen. Een overzicht van in vitro differentiatieprocedures van normale keratinocyten en veranderingen in celmorfologie tijdens differentiatie wordt geïllustreerd in figuur 1A. Uit de analy...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk beschrijft een methode voor het induceren van menselijke keratinocyten differentiatie en de daaropvolgende karakterisering met behulp van RNA-seq analyses. In de huidige literatuur gebruiken veel studies over menselijke keratinocytendifferentiatie twee andere methoden, met een hoge calciumconcentratie of met serum als methoden om differentiatie2,3,23te induceren . Een eerder rapport zorgvuldig vergeleken deze drie versc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door De Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Radboud Universiteit fellowship (H.Z.); en Chinese Scholarship Council grant 201406330059 (J.Q.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bioanalyzer 2100AgilentG2929BA
Bovine pituitary extract (BPE)LonzaOnderdeel van de bulletKit
CFX96 Real-Time systeemBio-RadqPCR-machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)Sigma-AldrichD8537
Epidermal Growth Factor (EGF)LonzaOnderdeel van de bulletKit
Ethanolamine >= 98%Sigma-AldrichE9508
High Sensitivity DNA chipsAgilent5067-4626
HydrocortisonLonzaOnderdeel van de bulletKit
InsulinLonzaOnderdeel van de bulletKit
iQ SYBR Green KitBioRad170-8886
iScript cDNA syntheseBio rad1708890
KAPA Library Quant KitRoche07960255001Low concentration meetkit
KAPA RNA HyperPrep Kit met RiboEraseRocheKK8540RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKitLonza192060
NanodropdeNovixDS-11 FX (model)Nanodrop en Qbit voor DNA- en RNA-metingen
NEXTflex DNA barcodes -24IllumniaNOVA-5141036 bp lange primers
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
RNA Pico ChipAgilent5067-1513

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
  2. Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507(2013).
  3. Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
  4. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  5. Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
  6. Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
  7. Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
  8. Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
  9. Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
  10. Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
  11. Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
  12. Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, Pt 13 2200-2207 (2011).
  13. KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit. , Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019).
  14. Doyle, K. aM. Protocols and applications guide. , Promega Corporation. Madison. (1996).
  15. Roche. Hyperprep Kit. , Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019).
  16. Felix Krueger. TrimGalore. , Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019).
  17. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Ryan, D. Convert chromosome names in a bigWig file. , Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019).
  20. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  21. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48(2009).
  22. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  23. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
  24. Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
  25. Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9(2019).
  26. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).
  27. Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21(2014).
  28. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).
  29. Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1(2012).
  30. Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
  31. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341(2012).
  32. Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51(2013).
  33. Soneson, C. ARMOR. , Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019).
  34. Sande, S. F. snakemake-workflows. , Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Contact InhibitionEpidermal DifferentiationGene Expression ProfilingPrincipal Component AnalysisK Means ClusteringGene Ontology AnalysisP63 Mutations

Gerelateerde artikelen