In het huidige protocol leggen we uit hoe je gemakkelijk tonsillar mononucleaire cellen van gezonde mensen verwerken en kweken die gedeeltelijke chirurgische tonsillectomie ondergaan om aangeboren immuunreacties bij activering te bestuderen, waarbij virale infectie in mucosale weefsels nabootst.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van tonsillaire mononucleaire cellen om ex vivo ingeboren immuunreacties te bestuderen in een menselijk mucosale lymfoïde weefsel
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het bestuderen van geïsoleerde cellen uit slijmvlies-geassocieerde lymfoïde weefsels (MALT) maakt het mogelijk om de respons van immuuncellen in pathologieën met mucosale immuniteit te begrijpen, omdat ze gastheerpathogenische interacties in het weefsel kunnen modelleren. Terwijl geïsoleerde cellen afkomstig van weefsels waren de eerste cel cultuur model, het gebruik ervan is verwaarloosd omdat weefsel kan moeilijk te verkrijgen. In het huidige protocol leggen we uit hoe je gemakkelijk tonsillar mononucleaire cellen (TMC's) verwerken en kweken van gezonde menselijke amandelen om aangeboren immuunreacties bij activering te bestuderen, waarbij virale infectie in slijmvliesweefsels nabootst. Isolatie van TMC's uit de amandelen is snel, omdat de amandelen nauwelijks epitheel hebben en tot miljarden van alle grote immuunceltypes opleveren. Deze methode maakt detectie van cytokine productie met behulp van verschillende technieken, waaronder immunoassays, qPCR, microscopie, flow cytometrie, enz., vergelijkbaar met het gebruik van perifere mononucleaire cellen (PBMCs) uit bloed. Bovendien vertonen TMC's een hogere gevoeligheid voor geneesmiddelentests dan PBMCs, waarmee rekening moet worden gehouden met toekomstige toxiciteitstests. Ex vivo TMC-culturen zijn dus een eenvoudig en toegankelijk slijmvliesmodel.
Inleiding
Studies over menselijke organen zijn beperkt als gevolg van toegankelijkheid en voor de hand liggende ethische redenen. Ze zijn echter essentieel om de complexiteit van de menselijke biologie volledig te begrijpen. Culturen van geïsoleerde cellen (primaire culturen of cellijnen) zijn een standaardsysteem in celbiologiestudies vanwege hun beschikbaarheid. Terwijl geïsoleerde celculturen hebben toegestaan uitstekende ontdekkingen, het gebruik van cellijnen is gekomen op nadere toetsing, omdat ze niet volledig na te bootsen in vivo orgaanbiologie. De cultuur van driedimensionale cellen of weefselexplants is echter zeer complex4,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De specimens worden niet specifiek verzameld voor onderzoeksdoeleinden en de studie wordt niet als invasief beschouwd. Echter, menselijke amandelen collectie vereist ethische goedkeuring door de lokale relevante autoriteiten. In ons geval is het goedgekeurd door het Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). Bovendien wordt toestemming van elke patiënt of wettelijke vertegenwoordiger gevraagd om persoonsgegevens van donoren (bijvoorbeeld geslacht, leeftijd, geschiedenis van KNO-infecties) te verkrijgen die kunnen helpen bij het interpreteren van experimentele resultaten.
1. Behandeling van het menselijke tonsillaire wee....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We kenmerkten eerst het immuunsysteem profiel van cellen aanwezig in de cultuur en analyseerden de hoeveelheid TMC's. We phenotyped de TMC's van amandelen met flow cytometrie. Zoals blijkt uit figuur 1,waren alle belangrijke immuunceltypen die in PBMC's in bloed aanwezig waren, in de TMC's van amandelen. In TMC's was de frequentie van alle celtypen, behalve B-cellen, echter lager dan in PBMC's.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Menselijke amandelen vertegenwoordigen een integratief en fysiologisch ex vivo-model om aangeboren immuunreacties te bestuderen op de slijmkoselsinterface, omdat ze de rol van een secundair lymfoïde orgaan nabootsen. Interessant is dat de cellulaire samenstelling van de TMC's vergelijkbaar is met de PBMCs en alle grote celpopulaties omvat, hoewel hun percentage kan verschillen van PBMCs van bloed(figuur 1). Extra populaties kunnen ook worden gevonden, omdat alle immuunreacties worden geïniti.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) voor de experimenten en N.B. fellowship (AAP 2017 166). N.S. erkent steun van de ANRS for fellowship (AAP 2016 1), de European Molecular Biology Organization EMBO for Fellowship (LT 834 2017), het startup funding programma "Baustein" van de Medische Faculteit van de Universiteit van de Universiteit van de Universiteit (LSBN.0147) en de Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/11).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10 meshes steel grid - 1910 µm | Dutscher | 198586 | Te plaatsen in de celstrainer Cellector |
| 60 meshes steel grid - 230 µm | Dutscher | 198591 | Te plaatsen in de celstrainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine celstrainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic oplossing, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium en 100 μg/mL Streptomycin - toe te voegen aan kweekmedium |
| BD FalconTM Ronde-Bodembuizen, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS buizen |
| Celstrainer Cellector, 85 mL en 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Celviabiliteits Assay | Promega | G7572 | Viabiliteits assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical buizen Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Gebogen pincet | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfaat (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Zonder calcium en magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Meet de luminescentie | |
| Fetaal Runderserum (FBS) | Te toevoegen aan kweekmedium | ||
| Fluorescentie gelabelde antilichamen | Zie Tabel 1 | ||
| Glazen Stompe | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 M) | Thermo Fisher | 15630056 | Gebruik bij 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Parel-gebaseerde immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Dichtheidsgradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Langzaam bevriezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-vrij | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Celkweek Schaal, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Steriel chirurgisch mes N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensatie Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | Om wasbuffer in PBS te maken |
Referenties
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
