Analyse van aangeboren hartafwijkingen in muisembryo's met behulp van kwalitatieve en kwantitatieve histologische methoden

Summary

In dit protocol beschrijven we procedures om ontwikkelingsfenotypes bij muizen geassocieerd met aangeboren hartafwijkingen kwalitatief en kwantitatief te analyseren.

Abstract

Aangeboren hartafwijkingen (CHD) zijn de meest voorkomende vorm van aangeboren afwijking bij de mens, die tot 1% van alle levende geboorten. Echter, de onderliggende oorzaken voor CHD zijn nog steeds slecht begrepen. De ontwikkelende muis vormt een waardevol model voor de studie van CHD, omdat cardiale ontwikkelingsprogramma's tussen muizen en mensen sterk worden bewaard. Het protocol beschrijft in detail hoe muisembryo's van het gewenste zwangerschapsstadium kunnen worden geproduceerd, methoden om het hart te isoleren en te behouden voor downstreamverwerking, kwantitatieve methoden om gemeenschappelijke soorten CHD te identificeren door histologie (bijv. ventriculaire septal defecten, atriumseptale defecten, octrooiductus arteriosus), en kwantitatieve histomorfometrie methoden om gemeenschappelijke spierverdichting fenotypes te meten. Deze methoden articuleren alle stappen die betrokken zijn bij monstervoorbereiding, verzameling en analyse, waardoor wetenschappers CHD correct en reproducibly kunnen meten.

Introduction

CHDs zijn de meest voorkomende vorm van aangeboren afwijking bij de mens en zijn de belangrijkste oorzaak van aangeboren afwijking gerelateerde sterfgevallen^1,2,3,4,5,6. Hoewel ongeveer 90% van de pasgeboren kinderen CHD overleven, wordt het in de loop der jaren vaak geassocieerd met aanzienlijke morbiditeit en medische ingrepen, die een zware last opleggen voor het leven van de patiënten en het gezondheidszorgstelsel^7,8....

Protocol

Alle dieren die in de in dit document genoemde experimenten worden gebruikt, werden behandeld met behulp van de richtlijnen voor de verzorging van dieren van de Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Getimede paring van C57BL6/J muizen voor embryoproductie

1. Zodra muizen de fokleeftijd (6-8 weken) hebben bereikt, zet ze ze samen in haremkweekformaat (d.w.z. twee vrouwtjes per één mannetje). Zet ze voor de fokkerij ergens in de middag of avond.
   LET OP: Muizen broeden vaak binnen 1 uur nadat de lichten zijn uitgeschakeld binnen hun woonvoorziening. Vrouwtjes moeten worden teruggetrokken ui....

Results

De spierverdichtingsindex werd vergeleken tussen harten die zich ontwikkelden onder twee verschillende omgevingen, een controle en een experimentele groep. Deze protocollen werden gebruikt om de verdichting van spierweefsel kwantitatief te analyseren, wat statistische analyse mogelijk maakte. Spierverdichting bleek aanzienlijk te zijn verminderd in de experimentele harten ten opzichte van de embryo's die zich ontwikkelden in niet-experimentele omstandigheden.

Discussion

Dit protocol onderzoekt de technieken die betrokken zijn bij de analyse van de hartontwikkeling in embryonale harten. Sommige beperkingen van deze methode zijn de vereiste fysieke behendigheid voor de voorbereidende technieken, die oefening kunnen vereisen, en vaardigheid met microscoopbeeldvorming. Als de plakjes verkregen op de cryostat zijn rommelig, de hematoxyline en eosine vlekken zal niet duidelijk zijn, of als de beelden genomen op de microscoop hebben slechte verlichting, dan is de methode die wordt gebruikt met.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube(s)	Fisher Scientific	# 1495970C
C57BL/6J Mice	Jackson Labs	C57BL/6J - stock 000664
Coplin Staining Jars (x6)	VWR Scientific	# 25457-006
Coverslips 24X50MM #1.5	VWR Scientific	# 48393-241
Cryostat - Leica CM3050S	Leica	N/A
Dissecting Dish(s)	Fisher Scientific	# 50930381
Dumont #5 - Fine Forceps (x2)	Fine Science Tools	# 11254-20
Eosin Y Solution	Millipore Sigma	# HT110116-500ML
Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof)	Fisher Scientific	# BP2818-500
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	# E9884-100G
Eukitt	Millipore Sigma	# 03989-100ML
Fine Scissors	Fine Science Tools	# 14060-10
Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC	Leica	N/A
Glycine	Millipore Sigma	# 410225-250G
Graefe Forceps	Fine Science Tools	# 11052-10
Graphpad Prism 8 Software	Graphpad
ImageJ Software	ImageJ
Kimwipes	Fisher Scientific	# 06666A
Mayer's hematoxylin solution	Millipore Sigma	# MHS16-500ML
Micropipette tip(s) - p200	Fisher Scientific	# 02707448
Microsoft Excel Software	Microsoft
OCT Compound	VWR Scientific	# 102094-106
Olympus CkX53 Microscope	Olympus
Paint Brushes (at least 2)
Paraformaldehyde	VWR Scientific	# 0215014601	Make into 4% solution (dissolved in PBS)
Pasteur pipette(s)	Fisher Scientific	# 13-711-7M
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	# 15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	# 70011044	Dilute from 10x to 1x before using
Scale	Mettler Toledo	# MS1602TS
Scale	Mettler Toledo	# MS105
Scalpel Handle #3	VWR Scientific	# 10161-918
Scalpel Blades	VWR Scientific	# 21909-612
Square Mold	VWR Scientific	# 100500-224	For OCT molds
Sucrose	Millipore Sigma	# S9378-500G
Superfrost Plus Slides	Fisher Scientific	# 1255015
Surgical Scissors	Fine Science Tools	# 14002-14
Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades	VWR Scientific	# 25608-964
Travel Scale	Acculab	VIC 5101
Xylene	Millipore Sigma	214736-1L