In dit protocol beschrijven we procedures om ontwikkelingsfenotypes bij muizen geassocieerd met aangeboren hartafwijkingen kwalitatief en kwantitatief te analyseren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Analyse van aangeboren hartafwijkingen in muisembryo's met behulp van kwalitatieve en kwantitatieve histologische methoden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Aangeboren hartafwijkingen (CHD) zijn de meest voorkomende vorm van aangeboren afwijking bij de mens, die tot 1% van alle levende geboorten. Echter, de onderliggende oorzaken voor CHD zijn nog steeds slecht begrepen. De ontwikkelende muis vormt een waardevol model voor de studie van CHD, omdat cardiale ontwikkelingsprogramma's tussen muizen en mensen sterk worden bewaard. Het protocol beschrijft in detail hoe muisembryo's van het gewenste zwangerschapsstadium kunnen worden geproduceerd, methoden om het hart te isoleren en te behouden voor downstreamverwerking, kwantitatieve methoden om gemeenschappelijke soorten CHD te identificeren door histologie (bijv. ventriculaire septal defecten, atriumseptale defecten, octrooiductus arteriosus), en kwantitatieve histomorfometrie methoden om gemeenschappelijke spierverdichting fenotypes te meten. Deze methoden articuleren alle stappen die betrokken zijn bij monstervoorbereiding, verzameling en analyse, waardoor wetenschappers CHD correct en reproducibly kunnen meten.
Inleiding
CHDs zijn de meest voorkomende vorm van aangeboren afwijking bij de mens en zijn de belangrijkste oorzaak van aangeboren afwijking gerelateerde sterfgevallen1,2,3,4,5,6. Hoewel ongeveer 90% van de pasgeboren kinderen CHD overleven, wordt het in de loop der jaren vaak geassocieerd met aanzienlijke morbiditeit en medische ingrepen, die een zware last opleggen voor het leven van de patiënten en het gezondheidszorgstelsel7,8....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dieren die in de in dit document genoemde experimenten worden gebruikt, werden behandeld met behulp van de richtlijnen voor de verzorging van dieren van de Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Getimede paring van C57BL6/J muizen voor embryoproductie
- Zodra muizen de fokleeftijd (6-8 weken) hebben bereikt, zet ze ze samen in haremkweekformaat (d.w.z. twee vrouwtjes per één mannetje). Zet ze voor de fokkerij ergens in de middag of avond.
LET OP: Muizen broeden vaak binnen 1 uur nadat de lichten zijn uitgeschakeld binnen hun woonvoorziening. Vrouwtjes moeten worden teruggetrokken ui....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De spierverdichtingsindex werd vergeleken tussen harten die zich ontwikkelden onder twee verschillende omgevingen, een controle en een experimentele groep. Deze protocollen werden gebruikt om de verdichting van spierweefsel kwantitatief te analyseren, wat statistische analyse mogelijk maakte. Spierverdichting bleek aanzienlijk te zijn verminderd in de experimentele harten ten opzichte van de embryo's die zich ontwikkelden in niet-experimentele omstandigheden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol onderzoekt de technieken die betrokken zijn bij de analyse van de hartontwikkeling in embryonale harten. Sommige beperkingen van deze methode zijn de vereiste fysieke behendigheid voor de voorbereidende technieken, die oefening kunnen vereisen, en vaardigheid met microscoopbeeldvorming. Als de plakjes verkregen op de cryostat zijn rommelig, de hematoxyline en eosine vlekken zal niet duidelijk zijn, of als de beelden genomen op de microscoop hebben slechte verlichting, dan is de methode die wordt gebruikt met.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen onthullingen te melden.
Dankbetuigingen
Het Aguirre Lab wordt ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute van de National Institutes of Health onder award nummer K01HL135464 en door de American Heart Association onder award nummer 19IPLOI34660342.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Muizen | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Dekglasjes 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissectiebakjes | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 - Fijne Tang (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosine Y-oplossing | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fijne Schaar | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscoop Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Tang | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematexylin-oplossing | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipettip(s) - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscoop | Olympus | ||
| Verfpenselen (minstens 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Maak een 4% oplossing (opgelost in PBS) |
| Pasteur Pipetten | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicilline-Streptomycine | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Fosfaat Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Verdun van 10x naar 1x voor gebruik |
| Schaal | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Schaal | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handvat #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Bladen | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Vierkante Mal | VWR Scientific | # 100500-224 | Voor OCT mal |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Dia's | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Chirurgische Schaar | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Wegwerp Microtoompes | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Reisschaal | Acculab | VIC 5101 | |
| Xyleen | Millipore Sigma | 214736-1L |
Referenties
- Kathiresan, S., Srivastava, D. Genetics of human cardiovascular disease. Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
