Een Rat Model van Pressure Overload Geïnduceerde Matige Remodeling en Systolische disfunctie in tegenstelling tot Openlijke Systolische hartfalen

Samenvatting

We beschrijven de creatie van een rat model van druk overbelasting geïnduceerde matige remodelleren en vroege systolische disfunctie waar signaal transductie trajecten die betrokken zijn bij de inleiding van het remodelleren proces worden geactiveerd. Dit diermodel zal helpen bij het identificeren van moleculaire doelen voor het toepassen van vroege therapeutische anti-remodelleren strategieën voor hartfalen.

Samenvatting

In reactie op een verwonding, zoals hartinfarct, langdurige hypertensie of een cardiotoxische agent, past het hart zich in eerste instantie aan door de activering van signaaltransductietrajecten, om op korte termijn het hartmyocyteverlies tegen te gaan en of de toename van wandstress. Echter, langdurige activering van deze trajecten wordt schadelijk leidt tot de initiatie en voortplanting van cardiale remodelleren leidt tot veranderingen in de linker ventriculaire geometrie en toename van de linker ventriculaire volumes; een fenotype dat wordt gezien bij patiënten met systolisch hartfalen (HF). Hier beschrijven we de creatie van een rat model van druk overbelasting geïnduceerde matige remodelleren en vroege systolische disfunctie (MOD) door het opgaan van aorta banding (AAB) via een vasculaire clip met een interne oppervlakte van 2 mm². De operatie wordt uitgevoerd in 200 g Sprague-Dawley ratten. Het MOD HF fenotype ontwikkelt zich bij 8-12 weken na AAB en wordt niet-invasief gekenmerkt door middel van echocardiografie. Eerder werk suggereert de activering van signaaltransductietrajecten en veranderde genexpressie en post-translationele modificatie van eiwitten in het MOD HF fenotype dat de systemen nabootst die bij menselijke systolische HF worden gezien; daarom is het maken van het MOD HF fenotype een geschikt model voor translationeel onderzoek om potentiële therapeutische anti-remodeling targets in HF te identificeren en te testen. De voordelen van het MOD HF fenotype ten opzichte van het openlijke systolische HF fenotype is dat het de identificatie mogelijk maakt van moleculaire doelen die betrokken zijn bij het vroege remodelleringsproces en de vroege toepassing van therapeutische interventies. De beperking van de MOD HF fenotype is dat het niet kan nabootsen het spectrum van ziekten die leiden tot systolische HF bij de mens. Bovendien is het een uitdagend fenotype om te creëren, omdat de AAB-operatie wordt geassocieerd met hoge sterfte- en uitvalpercentages met slechts 20% van de geopereerde ratten die het gewenste HF-fenotype ontwikkelen.

Inleiding

Hartfalen (HF) is een veelvoorkomende ziekte en wordt geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit¹. Knaagdier druk-overload (PO) modellen van HF, geproduceerd door opgaande of transversale aortabanding, worden vaak gebruikt om moleculaire mechanismen die leiden tot HF te verkennen en om potentiële nieuwe therapeutische doelen in HF te testen. Ze bootsen ook veranderingen voor bij menselijke HF secundair e-gevolg aan langdurige systemische hypertensie of ernstige aortastenose. Na PO neemt de linker ventriculaire (LV) wand geleidelijk in dikte toe, een proces dat bekend staat als concentrische LV hypertrofie (LVH), om de toename van LV-wandstress te compenseren en aan te passen. Dit wordt echter geassocieerd met de activering van een aantal onaangepaste signaleringstrajecten, die leiden tot derangements in calciumfietsen en homeostase, metabole en extracellulaire matrixremodellering en veranderingen in genexpressie, evenals verbeterde apoptose en autofagie^2,3,4,5,6. Deze moleculaire veranderingen vormen de trigger voor de initiatie en vermeerdering van myocardrelaatse remodelleren en overgang naar een gedecompenseerd HF fenotype.

Ondanks het gebruik van inteelt knaagdierstammen en standaardisatie van clipgrootte en chirurgische techniek, is er een enorme fenotypische variabiliteit in LV kamerstructuur en functie in aortabandmodellen^7,8,9. De fenotypische variabiliteit die na PO bij ratten, Sprague-Dawley stam, wordt aangetroffen elders^10,11. Van deze, twee HF fenotypes worden aangetroffen met bewijs van myocardiale remodelleren en activering van signaal transductie trajecten leidt tot een toestand van verhoogde oxidatieve stress. Dit wordt geassocieerd met metabole remodelleren, veranderde genexpressie en veranderingen in posttranslationele modificatie van eiwitten, die in totaal een rol spelen in het remodelleren proces^10,12. De eerste is een fenotype van matige remodelleren en vroege systolische disfunctie (MOD) en de tweede is een fenotype van overt systolische HF (HFrEF).

Het PO-model van HF is voordelig ten opzichte van het myocardiaal infarct (MI) model van HF omdat de PO-geïnduceerde omtrek en meridionale wandspanningen homogeen verdeeld zijn over alle segmenten van het myocardium. Echter, beide modellen lijden aan variabiliteit in de ernst van PO^10,11 en in infarct grootte^13,14 samen met intense ontsteking en littekens op het infarct plaats¹⁵ evenals hechting aan de borstwand en omliggende weefsels, die worden waargenomen in het MI-model van HF. Bovendien is het door ratten PO geïnduceerde HF-model een uitdaging om te creëren, omdat het wordt geassocieerd met hoge sterfte- en uitvalpercentages¹⁰, waarbij slechts 20% van de geopereerde ratten het MOD HF-fenotype¹⁰ontwikkelt .

De MOD is een aantrekkelijke HF fenotype en vormt een evolutie van de traditioneel gecreëerde HFrEF fenotype als het mogelijk maakt voor een vroege targeting van signaal transductie trajecten die een rol spelen in myocardiale remodelleren, vooral wanneer het gaat om verstoringen in mitochondriale dynamiek en functie, myocardmetabolisme, calcium fietsen en extracellulaire matrix remodelleren. Deze pathofysiologische processen zijn zeer duidelijk in het MOD HF fenotype¹¹. In dit manuscript beschrijven we hoe we de MOD- en HFrEF-fenotypes kunnen maken en pakken we valkuilen aan tijdens het uitvoeren van de opgaande aortabanding (AAB) procedure. We werken ook uit over hoe we het beste kunnen karakteriseren door echocardiografie de twee HF fenotypes, MOD en HFrEF, en hoe ze te onderscheiden van andere fenotypes die er niet in slagen om ernstige PO te ontwikkelen of die ernstige PO en concentrische remodelleren ontwikkelen, maar zonder significante excentrieke remodelleren.

Protocol

Alle hier beschreven methoden en procedures zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Tulane University School of Medicine.

1. Instrumenten en instrumenten voor het maken van AAB-modellen

1. Verkrijg ontsmettingsmiddelen, zoals 70% isopropylalcohol en povidone-jodium.
2. Verkrijg ketamine en xylazine voor anesthesie en buprenorfine voor analgesie.
3. Het verkrijgen van een verwarming pad en zware absorptie wegwerp onderpad met de afmetingen van 18 inch x 30 inch.
4. Krijg een 100% katoenen touwrol, een tape en een haarknipper.
5. Verkrijg een kunststof karton van 20 cm x 25 cm, een diktebereik tussen 3-5 mm.
6. Verkrijg een Z-LITE glasvezelverlichting.
7. Het verkrijgen van een mechanische ventilator voor kleine dieren (bijvoorbeeld SAR-830/AP).
8. Verkrijg 2-0 en 3-0 Vicryl taper hechtingen en nylon 3-0 monofilament hechting, steriele gaaspads en steriele extra grote katoenen tips en steriele handschoenen.
9. Verkrijg 16 G angiocath voor intubatie.
10. Koop de volgende chirurgische hulpmiddelen.
    1. Verkrijg een Weck roestvrijstalen Hemoclip ligatie en roestvrijstalen ligting clips.
    2. Verkrijgen geharde fijne iris schaar.
    3. Adson-forceps verkrijgen.
    4. Verkrijg twee gebogen Graefe tangen.
    5. Verkrijg een Halsted-Mosquito Hemostats-rechte tangen.
    6. Verkrijg een Mayo-Hegar naaldhouder.
    7. Het verkrijgen van een Alm borst oprolmechanisme met stompe tanden.
11. Gebruik en het verkrijgen van een autoclave en een kraal sterilisator.

2. Opgaande aortabanding chirurgische ingreep

1. Verdoof het dier met een intraperitoneale injectie van een mengsel van 75-100 mg/kg Ketamine en 10 mg/kg Xylazine.
   LET OP: Laat een paar minuten voor het dier volledig verdoofd en slap. Als de verdovingsdosis niet voldoende is en het dier zich nog steeds in de kooi beweegt, injecteert u het dier opnieuw met dezelfde verdovingsdosis na voldoende tijd, ongeveer 5-10 minuten tussen de daaropvolgende injecties. De meeste dieren hebben 1-2 injecties nodig om diepe sedatie en anesthesie te bereiken.
2. Scheer het haar op de chirurgische plaats gelegen op de rechter laterale thoracale gebied onder de rechter oksel.
3. Stabiliseer het dier door voorzichtig alle vier de ledematen op het plastic bord te tappen. Voer vervolgens endotracheale intubatie uit met een 16 G angiocath. Nadat het dier met succes is geïntubeerd, start u mechanische ventilatie met getijdenvolumes van 2 mL bij 50 cycli/min en FiO₂ van 21%. Kijk voor de symmetrische stijging van de borstwand met elke adem.
4. Draai het dier langzaam te liggen op de linker zijdekant, en buig de staart in een U-vorm manier en stabiliseren door zachtjes taping het naar de plastic boord. Dan ga je gang en ontsmet het geschoren gebied met actuele toepassing van povidone-jodium.
5. Infiltreren in de huid op de incisie plaats met 50/50 mix door volume van 1-2% Lidocaine/0,25-0,5 % Bupivacaine als preventieve analgesie voor het maken van de incisie.
6. Voer een rechter horizontale huid incisie, 1-2 centimeter lang, in de rechter oksel gebied 1 cm onder de rechter oksel. Ontleed vervolgens de borstspierlaag tot ze de borstribbenkooi bereiken. Maak een thoracotomie van 1 cm tussen de^2e en^3e ribbenkast.
   1. Tijdens het ontleden van de spierlaag van de borst, wees voorzichtig en vermijd letsel van de rechter okselslagader, die loopt onder de rechter oksel.
      OPMERKING: Thoracotomie uitgevoerd tussen de 1^e en de^2e rib draagt het risico van banding de juiste brachiocephalic slagader in plaats van de opgaande aorta. Thoracotomie tussen de^3e en de vierde rib maakt het moeilijk te visualiseren en band de opgaande aorta, als de exploitant zal kijken naar de rechter atrium.
      LET OP: Vermijd de uitbreiding van de thoracotomie te mediaal naar het borstbeen om te voorkomen dat ontleden en verwonden van de juiste interne borstslagader.
7. Ontleed de twee lobben van de thymus voorzichtig en duw ze uit elkaar aan de zijkant. Identificeer dan de opgaande aorta en isoleer het van de superieure vena cava door stompe dissectie via een gebogen Graefe tangen.
   OPMERKING: Significante manipulatie van de thymus zal het gezwollen maken en maakt het moeilijk om de opgaande aorta te visualiseren.
   1. Ontleed de superieure vena cava uit de aorta met extra voorzichtigheid om letsel of breuk van de superieure vena cava te voorkomen, wat fataal is. Dit kan het lastigste deel van de procedure en zal naar verwachting gebeuren van tijd tot tijd, zelfs in de meest ervaren handen, maar vaak met beginners en studenten.
8. Til voorzichtig de opgaande aorta met een gebogen Graefe tangen en plaats de vasculaire clip rond de opgaande aorta.
   1. Pas het vaathemoclipligatiegereedschap aan via een kunststof voorgesneden 7"-stuk om een vasculaire clip van het gewenste interne gebied van 1,5 mm² of 2 mm²te verkrijgen, afhankelijk van welk HF-model gewenst is.
9. Hecht de thorax via een Vicryl 2-0 monofilament hechting. Dan hechting van de gespierde laag van de borst via een 3-0 Vicryl taper hechting. Dan hechting van de huid incisie via een nylon 3-0 monofilament hechting.
10. Een combinatie van de volgende geneesmiddelen na voltooiing van de operatie gedurende 48-72 uur toe dienen als analgesie in de postoperatieve periode: 1) Buprenorfine 0,01-0,05 mg/kg onderhuids om de 8-12 u, 2) Meloxicam 2 mg/kg onderhuids elke 12h, en 3) Morfine 2.5 mg/kg onderhuids elke 2-4h als nodig voor ernstige pijn.
    LET OP: Laat het dier onder regelmatig toezicht herstellen op een verwarmingskussen. Zodra het dier tekenen van herstel van anesthesie vertoont (in staat om spontaan te ademen - zonder bewijs van hijgen of het gebruik van accessoirespieren gedurende meer dan twee minuten - en goede reflexen, rode en warme ledematen heeft), extuberen het dier en terug te keren naar de kooi.

3. Echocardiografie

1. Verdofeer het dier met intraperitoneale injectie van 80-100 mg/kg ketamine. Zorg voor een adequate sedatie voor een goede aanschaf van echobeelden van goede kwaliteit.
   OPMERKING: Het gebruik van isofluraan als verdovingsmiddel wordt ontmoedigd om het cardiodepressor-effect, vooral bij het instellen van ernstige overbelasting van de druk en kan een verkeerde indruk geven van LV-dilatatie en systolische disfunctie die oplost zodra het dier uit de verdoving is.
   1. Wees voorzichtig en toewijs de helft of zelfs een derde van de dosis ketamine bij dieren die dyspneu en tachypneic er uitzien met het vermoeden dat ze het HFrEF fenotype hebben ontwikkeld.
2. Scheer het haar van de borst, anteriorly, in het volledig verdoofde dier.
3. Leg het dier op zijn rug en stabiliseer het op de plastic plank.
4. Verwerven 2D parasternale lange as en 2D parasternale korte as weergave clips op het niveau van de papillaire spier. Ook verkrijgen M-mode beelden van de korte parasternale as weergave op het niveau van de papillaire spier te meten LV septal en achterste wanddikte in diastole evenals LV einde-diastolische en eind-systolische diameter.
   1. Verwerf afbeeldingen of clips met een hartslag van 370 - 420 slagen per minuut om een goede beoordeling van de LV-grootte en -functie te garanderen. Verwerving van beelden bij lagere hartslag zal leiden tot een verkeerde indruk van depressieve LV-functie en LV-dilatatie.
      OPMERKING: Aanschaf van verkorte 2D lange parasternale asweergavebeelden/clips leiden tot foutieve metingen. Zorg er voor kwaliteitscontrole voor dat de LV-top en de aorto-mitralishoek binnen dezelfde vlaksnede worden gevisualiseerd.
   2. Verwerven 2D korte parasternale as bekijken beelden / clips op het niveau van de middelste papillaire spier. Dit zal dienen als referentie voor het verkrijgen van betrouwbare seriële en daaropvolgende LV-metingen, terwijl de dieren gedurende de loop van de studieperiode worden gevolgd.
5. Verkrijg M-modus beelden in lange parasternale as weergave op het niveau van de aortaklep om de relatieve aorta naar links atrium (LA) diameter aan het einde systole te beoordelen.
   OPMERKING: Dieren met de MOD- en HFrEF-fenotypen moeten aantonen dat de LA-dilatatie met DE/Ao-verhouding ≥1,25 en <1,5 in MOD HF-fenotype en ≥1,5 in het HFrEF-fenotype¹⁰is .

Resultaten

Karakterisering van de HF fenotypes, die 8-12 weken na AAB ontwikkelen, kon gemakkelijk worden uitgevoerd via echocardiografie. Representatieve M-mode beelden van Sham, Week 3 post-AAB, MOD en HFrEF fenotypes worden gepresenteerd in figuur 1A. Figuur 1B en figuur 1C tonen de vasculaire clipgrootte voor de creatie van respectievelijk het MOD HF fenotype en hfref f...

Discussie

Na PO in verband met AAB bij ratten, de LV ondergaat concentrische renovatie door het verhogen van LV wanddikte, bekend als concentrische LVH, als een compenserend mechanisme tegen te gaan voor de toename van LV muur stress. Toename van de LV wanddikte wordt merkbaar tijdens de eerste week na AAB en bereikt de maximale dikte op 2-3 weken na-AAB. Gedurende deze periode, activering van onaangepaste signaal transductie trajecten leiden tot progressieve uitbreiding van de LV met een toename van de LV volumes, een proces beke...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Adson forceps	F.S.T.	11019-12	chirurgisch instrument
Alm borst retractor met stompe tanden	ROBOZ	RS-6510	chirurgisch instrument
Graefe forceps, gebogen	F.S.T.	11152-10	chirurgisch instrument
Halsted-Mosquito Hemostats, recht	F.S.T.	13010-12	chirurgisch instrument
Verharde fijne iris schaar, recht	Fine Science Tools F.S.T.	14090-11	chirurgisch instrument
hemoclip traditionele roestvrijstalen ligatieklemmen	Weck	523735	chirurgisch instrument
Mayo-Hegar naaldhouder	F.S.T.	12004-18	chirurgisch instrument
mechanische ventilator	CWE inc	SAR-830/AP	mechanische ventilator voor kleine dieren
Weck roestvrijstalen Hemoclip ligatie	Weck	533140	chirurgisch instrument