We rapporteren een protocol voor het produceren van een hybride lipide membraan op de water/lucht interface door het smeren van de lipide bilayer met koper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) moleculen. Het resulterende hybride lipidemembraan heeft een lipide/CuPc/lipide sandwichstructuur. Dit protocol kan ook worden toegepast op de vorming van andere functionele nanomaterialen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Self-Assembly van hybride lipid membranen doped met hydrofobe organische moleculen op de Water / Air Interface
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vanwege hun unieke eigenschappen, waaronder een ultradunne dikte (3-4 nm), ultrahoge weerstand, vloeibaarheid en zelfassemblagevermogen, kunnen lipidebilayers gemakkelijk worden gefunctionaliseerd en zijn ze gebruikt in verschillende toepassingen zoals biosensoren en bio-apparaten. In deze studie introduceerden we een vlakke organische molecule: koper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-fthalocyanine (CuPc) om lipidemembranen te dope. De CuPc/lipide hybride membraan vormt zich op de water/lucht interface door zelfassemblage. In dit membraan bevinden zich de hydrofobe CuPc-moleculen tussen de hydrofobe staarten van lipidemoleculen, die een lipide/CuPc/lipide sandwichstructuur vormen. Interessant is dat een lucht-stabiele hybride lipide bilayer gemakkelijk kan worden gevormd door de overdracht van het hybride membraan op een Si substraat. We rapporteren een eenvoudige methode voor het opnemen van nanomaterialen in een lipide bilayer systeem, dat een nieuwe methode voor de fabricage van biosensoren en biodevices vertegenwoordigt.
Inleiding
Als essentiële kaders van celmembranen, wordt het binnenland van cellen gescheiden van de buitenkant door een lipide bilayersysteem. Dit systeem bestaat uit amphifiele fosfolipiden, die bestaan uit hydrofiele fosforische ester "hoofden" en hydrofobe vetzuren "staarten". Als gevolg van opmerkelijke vloeibaarheid en zelfassemblage vermogen van lipide bilayers in waterige omgeving1,2, kunstmatige lipide bilayers kunnen worden gevormd met behulp van eenvoudige methoden3,4. Verschillende soorten membraaneiwitten, zoals ionenkanalen, membraanreceptoren en enzymen, zijn opgenomen in de kunstmatige lipidebilayer om de functies van celmembranen na te bootsen en te bestuderen5,6. Meer recent zijn lipidebilayers gedrogeerd met nanomaterialen (bijvoorbeeld metalen nanodeeltjes, grafeen en koolstofnanobuisjes) om functionele hybride membranen te vormen7,8,9,10,11,12,13. Een veelgebruikte methode voor de vorming van dergelijke hybride membranen omvat de vorming van gedopede lipide vluimen, die hydrofobe materialen zoals gemodificeerde Au-nanodeeltjes7 of koolstof nanobuisjes11bevatten, en de resulterende vesikels worden vervolgens samengevoegd tot vlakke ondersteunde lipide bilayers. Deze aanpak is echter complex en tijdrovend, wat het potentiële gebruik van dergelijke hybride membranen beperkt.
In dit werk werden lipidemembranen gedrogeerd met organische moleculen om hybride lipidemembranen te produceren die zich op de water/luchtinterface vormden door zelfassemblage. Dit protocol omvat drie stappen: voorbereiding van de gemengde oplossing, vorming van een hybride membraan op de water/luchtinterface en de overdracht van het membraan op een Si-substraat. In vergelijking met andere eerder gerapporteerde methoden is de hier beschreven methode eenvoudiger en vereist deze geen geavanceerde instrumentatie. Met behulp van deze methode kunnen luchtstalre hybride lipidenmembranen met een groter gebied in een kortere tijd worden gevormd. Het nanomateriaal dat in deze studie wordt gebruikt is een semigeleidend organisch molecuul, koper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-fthalocyanine (CuPc), dat veel wordt gebruikt in een aantal toepassingen, waaronder zonnecellen, fotodetectoren, gassensoren en katalyse14,15. CuPc, een klein organisch molecuul met een vlakke structuur, heeft een hoge affiniteit voor de "staarten" van fosfolipiden duo aan zijn hydrofobe kenmerken. Andere groepen hebben gemeld dat CuPc moleculen zelf kunnen assembleren op single-crystal oppervlakken met de vorming van hoog geordende structuren16,17. Daarom is het zeer mogelijk dat de CuPc moleculen kunnen worden opgenomen in de lipide bilayers door middel van zelfassemblage.
We geven een gedetailleerde beschrijving van de procedures die worden gebruikt om membranen te vormen en geven enkele suggesties voor een soepele uitvoering van deze procedure. Daarnaast presenteren we enkele presentatieve resultaten van de hybride lipidemembranen en bespreken we mogelijke toepassingen van deze methode.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van een hybride oplossing
- Was vier 4 mL wegwerpglas flacons en schroefdoppen (met PTFE gecoate afdichtingen) in een ultrasoon bad gedurende 10 minuten in gedestilleerd water (gezuiverd met een filtratiesysteem), gevolgd door respectievelijk ethanol en chloroform. Droog de glazen flacons en doppen in een stroom stikstofgas.
- Bereid in een anaerobe handschoenenkastje een CuPc-voorraadoplossing (10 mg/mL) in een gewassen glazen flacon door cupc in poedervorm op te lossen.
- Filtreer de CuPc-oplossing door een mem (PTFE) mem (0,2 μm polytetrafluorethyleen).
- Bewaar de gefilterde oplossing in een gewassen glazen flacon gevuld met stikstof en sluit de flacon af met parafilm.
- Neem de gekochte 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPhPC) chloroform oplossing (25 mg/mL) uit de -80 °C koelkast en laat het opwarmen tot kamertemperatuur.
- Roer de DPhPC-oplossing met behulp van een vortexmixer bij 2300 rpm voor 10 s.
- Spoel een glazen microspuit 5 keer af met chloroform.
- Breng 200 μL van de DPhPC chloroform oplossing over in een voorgewassen glazen flacon met behulp van de gewassen spuit. Verdamp het oplosmiddel in de flacon met een zachte stroom stikstof.
- Spoel een glazen microspuit 5 keer af met chloroform.
- Voeg 202,6 μL chloroform toe aan de glazen flacon met DPhPC met behulp van de gereinigde spuit.
- Voeg 47,4 μL gefilterde 10 mg/mL CuPc-oplossing toe aan de DPhPC-oplossing. De kiesverhouding van DPhPC naar CuPc moet 10:1 zijn.
- Spoel de glazen microspuit 5 keer af met chloroform.
- Voeg met de spuit 250 μL hexaan aan de oplossing toe. De uiteindelijke concentratie van de oplossing moet 10 mg/mL zijn.
- Meng de bereide oplossing met behulp van een vortexmixer bij 2300 rpm voor 10 s.
- Filtreer de CuPc-oplossing door een mem (PTFE) mem (0,2 μm polytetrafluorethyleen).
- Sluit de glazen flacon af met parafilm. Doe het in een afgesloten zak gevuld met stikstof en plaats de grip verzegelde zak in een vriezer op -20 °C.
OPMERKING: Na stap 1.13 werden de DPhPC en CuPc opgelost in een gemengd oplosmiddel, dat bestond uit chloroform en hexaan (volumeverhouding van 1:1). Bovendien is de kiesverhouding van DPhPC naar CuPc niet beperkt tot 10:1. Met een constante concentratie lipiden (10 mg/mL) kunnen verschillende kiesverhoudingen worden gebruikt. Volgens eerdere experimentele resultaten heeft een bereik van 10:1 tot 3:1 de voorkeur voor het vormen van een hybride lipidenmembraan van hoge kwaliteit.
2. Vorming van een hybride membraan op de water/luchtinterface
- Snijd Si substraten (3 cm x 3 cm) uit een Si wafer.
- Reinig de 3 cm x 3 cm Si substraten in een ultrasoon bad gedurende 10 minuten in gezuiverd water, gevolgd door ethanol en vervolgens chloroform. Behandel het Si-substraat met een O2-plasma gedurende 5 minuten om geadsorbeerde organische materialen van het oppervlak te verwijderen en hydrofielheid te verbeteren.
- Was een Teflon beker met een binnendiameter van 7,5 cm met stromend gezuiverd water gedurende 3 minuten.
- Doe het gereinigde Si-substraat in het gewassen PTFE bekerglas. Het substraat wordt gekanteld onder een hoek van 30° naar het horizontale vlak.
- Giet een voldoende hoeveelheid gezuiverd water in de Teflon beker tot het gehele Si substraat is ondergedompeld.
- Haal de bereide hybride oplossing uit de vriezer en laat deze opwarmen tot kamertemperatuur.
- Roer de hybride oplossing met behulp van een vortex mixer bij 2300 rpm voor 15 s.
- Spoel een glazen microspuit (50 μL) 5 keer af met chloroform.
- Laat 3-5 μL van de hybride oplossing op het wateroppervlak vallen met behulp van de spuit om een drijvend hybride lipidemembraan te vormen.
LET OP: Wanneer de oplossing wordt gedropt, is het belangrijk om de druppel dicht bij (minder dan 1 cm) het wateroppervlak te houden. Opgemerkt moet ook worden dat een enkellaags hybride membraan niet zichtbaar is met het blote oog, maar het meerlaagse hybride membraan verschijnt als dunne, blauwgekleurde film. Om het meerlaagse hybride membraan over te brengen naar het Si substraat, is het belangrijk om de gemengde oplossing zo dicht mogelijk bij het Si-substraat te laten vallen.
3. Het membraan overbrengen op een Si-substraat
- Na de verdamping van organisch oplosmiddel (het duurt minder dan 2 seconden), verlaag het waterniveau met een snelheid van 3 mm/min door het water door een rubberen buis te pompen die wordt aangedreven door een peristaltische pomp, om het drijvende hybride membraan op het Si-substraat over te brengen.
- Nadat het overdrachtsproces is voltooid (ongeveer 5 min), plaats het Si substraat op een cleanroomwisser en laat al het resterende water verdampen.
OPMERKING: Het verlagen van het waterpeil bij zo'n laag tarief dient om de turbulentie van water te minimaliseren en het membraan te beschermen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het as-gevormde membraan heeft een uniforme lichtblauwe kleur als gevolg van de aanwezigheid van CuPc moleculen. Het gebied van het gekleurde membraan is normaal meerdere vierkante centimeters. In figuur 1A en figuur 1Btonen we een microscopisch beeld en een atomair krachtmicroscoop (AFM) beeld (inclusief een hoogteprofiel) van het hybride lipidemembraan op een Si-substraat. In het AFM-beeld is het membraan linksboven dik, met een dikte van 79,4 nm en rechtsonde...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In de voorloperoplossing van het hybride membraan wordt een gemengd organisch oplosmiddel (chloroform en hexaan) in plaats van zuiverchloroform gebruikt om lipiden en CuPc op te lossen. Als zuivere chloroform wordt gebruikt, zou de dichtheid van de precursoroplossing hoger zijn dan water. Daarom is het zeer waarschijnlijk dat de oplossing zou zinken naar de bodem van het water in plaats van verspreid over het wateroppervlak. Het toevoegen van hexaan, een oplosmiddel met een lage dichtheid, aan de precursoroplossing, zorg...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het CREST-programma van het Japan Science and Technology Agency (JPMJCR14F3) en Grant in-Aids van de Japan Society for the Promotion of Science (19H00846 en 18K14120). Dit werk werd deels uitgevoerd in het Laboratorium voor Nano-elektronica en Spintronica, Research Institute of Electrical Communication, Tohoku University.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Chloroform | Wako Chemicals | 033-08631 | |
| CuPc | Sigma-Aldrich | 423165 | |
| DPhPc | Avanti Polar Lipids | 850356C | |
| Glas vials met schroefdop | Nichiden-Rike Glass Co., Ltd | 6-29801 | |
| Hexaan | Wako Chemicals | 084-03421 | |
| Membraanfilters | Merck Millipore Ltd. | R8CA42836 | |
| Micro-spuit | Hamilton | 80530 | |
| Peristaltiekpomp | Tokyo Rikakikai Co., Ltd. | 11914199 | |
| Vortexmixer | Scientific Industries, Inc. | SI-0286 |
Referenties
- Israelachvili, J. N., Mitchell, D. J., Ninham, B. W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 470 (2), 185-201 (1977).
- Venable, R. M., Zhang, Y., Hardy, B. J., Pastor, R. W. Molecular dynamics simulations of a lipid bilayer and of hexadecane: an investigation of membrane fluidity. Science. 262 (5131), 223-226 (1993).
- Ide, T., Ichikawa, T. A novel method for artificial lipid-bilayer formation. Biosensors and Bioelectronics. 21 (4), 672-677 (2005).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
- Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
- Demarche, S., Sugihara, K., Zambelli, T., Tiefenauer, L., Voros, J. Techniques for recording reconstituted ion channels. Analyst. 136 (6), 1077-1089 (2011).
- Sakaguchi, N., Kimura, Y., Hirano-Iwata, A., Ogino, T. Fabrication of Au-nanoparticle-embedded lipid bilayer membranes supported on solid substrates. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (17), 4474-4481 (2017).
- Schulz, M., Olubummo, A., Binder, W. H. Beyond the lipid bilayer: interaction of polymers and nanoparticles with membranes. Soft Matter. 8 (18), 4849-4864 (2012).
- Wang, J., Wei, Y., Shi, X., Gao, H. Cellular entry of graphene nanosheets: the role of thickness, oxidation and surface adsorption. RSC Advances. 3 (36), 15776-15782 (2013).
- Vögele, M., Köfinger, J., Hummer, G. Molecular dynamics simulations of carbon nanotube porins in lipid bilayers. Faraday Discussions. 209, 341-358 (2018).
- Kanomata, K., Deguchi, T., Ma, T., Haseyama, T., Miura, M., Yamaura, D., Tadaki, D., Niwano, M., Hirano-Iwata, A., Hirose, F. Photomodulation of electrical conductivity of a PCBM-doped free-standing lipid bilayer in buffer solution. Journal of Electroanalytical Chemistry. 832, 55-58 (2019).
- Barnoud, J., Rossi, G., Monticelli, L. Lipid Membranes as Solvents for Carbon Nanoparticles. Physical Review Letters. 112, 068102(2014).
- Dichello, G. A., et al. Preparation of liposomes containing small gold nanoparticles using electrostatic interactions. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 105, 55-63 (2017).
- Sullivan, P., Heutz, S., Schultes, S. M., Jones, T. S. Influence of codeposition on the performance of CuPc−C60 heterojunction photovoltaic devices. Applied Physics Letters. 84 (7), 1210-1212 (2004).
- Miyata, T., Kawaguchi, S., Ishii, M., Minami, T. High sensitivity chlorine gas sensors using Cu−phthalocyanine thin films. Thin Solid Films. 425 (1-2), 255-259 (2003).
- Barrena, E., de Oteyza, D. G., Dosch, H., Wakayama, Y. 2D supramolecular self-assembly of binary organic monolayers. ChemPhysChem. 8 (13), 1915-1918 (2007).
- Xiao, K., et al. Surface-induced orientation control of CuPc molecules for the epitaxial growth of highly ordered organic crystals on graphene. Journal of the American Chemical Society. 135 (9), 3680-3687 (2013).
- Feng, X., Ma, T., Yamaura, D., Tadaki, D., Hirano-Iwata, A. Formation and characterization of air-stable lipid bilayer membranes incorporated with phthalocyanine molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6515-6520 (2019).
- Wu, Y., He, K., Ludtke, S. J., Huang, H. W. X-ray diffraction study of lipid bilayer membranes interacting with amphiphilic helical peptides: diphytanoyl phosphatidylcholine with alamethicin at low concentrations. Biophysical Journal. 68 (6), 2361-2369 (1995).
- Zaitseva, S. V., Bettini, S., Valli, L., Kolker, A. M., Borovkov, N. Y. Atypical film-forming behavior of soluble tetra-3-nitro-substituted copper phthalocyanine. ChemPhysChem. 20 (3), 422-428 (2019).
- Ghani, F., Gojzewski, H., Riegler, H. Nucleation and growth of copper phthalocyanine aggregates deposited from solution on planar surfaces. Applied Surface Science. 351, 969-976 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
