Methodenartikel

Identificatie van enhancer-promotor contacten in embryoïide lichamen door kwantitatieve chromosoomconformatie Capture (4C)

8.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60960

⸱

29 april 2020

 ,  ,  , 
1Center for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology, 2Universitat Pompeu Fabra, 3Vall d'Hebron Institute of Oncology

In dit artikel

Samenvatting

We rapporteren de toepassing van kwantitatieve chromosoomconformatievangst gevolgd door high-throughput sequencing in embryoïndische lichamen gegenereerd uit embryonale stamcellen. Deze techniek maakt het mogelijk om de contacten tussen putatieve versterkers en promotorgebieden van een bepaald gen te identificeren en te kwantificeren tijdens embryonale stamceldifferentiatie.

Samenvatting

Tijdens de ontwikkeling van zoogdieren, cel lot worden bepaald door de oprichting van regelgevende netwerken die de specificiteit, timing en ruimtelijke patronen van genexpressie te definiëren. Embryoïteielichamen (EB's) afkomstig van pluripotente stamcellen zijn een populair model om de differentiatie van de drie belangrijkste kiemlagen te bestuderen en regulerende circuits te definiëren tijdens de specificatie van het cellot. Hoewel het bekend is dat weefselspecifieke versterkers een belangrijke rol spelen in deze netwerken door interactie met promotors, blijft het nog steeds een uitdaging om ze toe te kennen aan hun relevante doelgenen. Om dit mogelijk te maken, zijn kwantitatieve benaderingen nodig om de contacten tussen verbeterveen en hun dynamiek tijdens de ontwikkeling te bestuderen. Hier hebben we een 4C-methode aangepast om versterkers en hun contacten met cognate promotors te definiëren in het EB-differentiatiemodel. De methode maakt gebruik van vaak snijden beperking enzymen, sonicatie, en een geneste-ligatie-gemedieerde PCR protocol compatibel met commerciële DNA bibliotheek voorbereiding kits. Vervolgens worden de 4C-bibliotheken onderworpen aan high-throughput sequencing en bio-informatica geanalyseerd, waardoor detectie en kwantificering van alle sequenties die contacten hebben met een gekozen promotor. De resulterende sequencing gegevens kunnen ook worden gebruikt om informatie te verkrijgen over de dynamiek van versterker-promotor contacten tijdens differentiatie. De techniek beschreven voor het EB differentiatie model is eenvoudig te implementeren.

Inleiding

Bij muizen bevat de binnencelmassa (ICM) van 3,5 dagen oude embryo's embryonale pluripotente stamcellen. De ICM ontwikkelt zich verder tot de epiblast op dag 4.5, het genereren van ectoderm, mesoderm, en endoderm cellen, de belangrijkste drie kiemlagen in het embryo. Hoewel pluripotente cellen in de ICM slechts tijdelijk in vivo bestaan, kunnen ze in cultuur worden gevangen door de oprichting van embryonale stamcellen van muizen (mESC's)1,2,3. De mSCs blijven in een ongedifferentieerde toestand en vermenigvuldigen zich voor onbepaalde tijd, maar bij intrinsieke en extrinsieke stimuli zijn ze ook in staat om de pluripotentietoestand te verlaten en cellen van de drie ontwikkelingskiemlagen2,4tegenereren . Interessant is dat wanneer gekweekt in suspensie in kleine druppeltjes, mESC's vormen driedimensionale aggregaten (dat wil zeggen, EBs) die zich onderscheiden in alle drie kiemlagen5. De EB-vormingstest is een belangrijk instrument om het proces van vroege afstammingsspecificatie te bestuderen.

Tijdens de afstammingsspecificatie krijgen cellen van elke kiemlaag een specifiek genexpressieprogramma4. De precieze spatiotemporale expressie van genen wordt gereguleerd door diverse cis-regulerende elementen, waaronder kernpromotors, versterkers, dempers en isolatoren6,7,8,9. Versterkers, regelgevende DNA-segmenten meestal verspreid over een paar honderd basisparen, coördineren weefsel-specifieke genexpressie8. Versterkers worden geactiveerd of tot zwijgen gebracht door binding van transcriptiefactoren en cofactoren die de lokale chromatinestructuur8,10reguleren . Veelgebruikte technieken om putatieve versterkers te identificeren zijn genoombrede chromatineimmunoneerslag, gevolgd door sequencing (ChIP-seq) en de test voor transposase-toegankelijke chromatine met behulp van sequencing (ATAC-seq) technieken. Zo worden actieve versterkers gekenmerkt door specifieke actieve histone-tekens en door verhoogde lokale DNA-toegankelijkheid11,12,13,14. Bovendien, ontwikkelingsbevorderende versterkers worden verondersteld om fysieke interactie met hun cognate promotor8,9. Inderdaad, het is aangetoond dat enhancer varianten en schrappingen die verstoren versterker-promotor contacten kan leiden tot ontwikkelingsmisvormingen15. Daarom is er behoefte aan nieuwe technieken die aanvullende informatie bieden voor de identificatie van functionele versterkers die ontwikkelingsgenexpressie controleren.

Sinds de ontwikkeling van de chromosoombevleesing (3C) techniek16, is het in kaart brengen van chromosomale contacten intensief gebruikt om de fysieke afstand tussen regelgevende elementen te beoordelen. Belangrijk is dat er onlangs varianten van 3C-technieken met een hoge doorvoer zijn ontwikkeld, die verschillende strategieën bieden voor fixatie, spijsvertering, ligatie en herstel van contacten tussen chromatinefragmenten17. Onder hen, in situ Hi-C is uitgegroeid tot een populaire techniek waardoor de volgorde van 3C ligatieproducten genoom-brede18. De hoge sequencingkosten die nodig zijn om tot een oplossing te komen die geschikt is voor de analyse van contacten tussen de versterker-promotoren, maken deze techniek echter onpraktisch voor de studie van specifieke loci. Daarom werden alternatieve methoden ontwikkeld om gerichte loci te analyseren bij hogere resolutie19,20,21,22. Een van deze methoden, namelijk 4C, bekend als een een versus alle strategie, maakt detectie van alle sequenties die contact opnemen met een site geselecteerd als gezichtspunt. Echter, een nadeel van de standaard 4C-techniek is de omgekeerde PCR vereist, die verschillende grootte fragmenten versterkt, ten gunste van kleine producten en biasing kwantificering na high-throughput sequencing. Onlangs is UMI-4C, een nieuwe variant van de 4C-techniek met behulp van unieke moleculaire identificatiemiddelen (UMI) ontwikkeld voor kwantitatieve en gerichte chromosomale contactprofilering die dit probleem omzeilt23. Deze benadering maakt gebruik van frequente snijders, sonicatie, en een geneste-ligatie-gemedieerde PCR-protocol, waarbij versterking van DNA-fragmenten met relatief uniforme lengte verdeling. Deze homogeniteit vermindert vooroordelen in het versterkingsproces van PCR-voorkeuren voor kortere sequenties en maakt efficiënt herstel en nauwkeurige telling van ruimtelijk verbonden moleculen/fragmenten mogelijk.

Hier beschrijven we een protocol dat de UMI-4C-techniek aanpast om chromatinecontacten tussen promotors en versterkers van lineage-leerzame transcriptiefactoren tijdens EB-differentiatie te identificeren en te kwantificeren.

Protocol

1. Embryoïde lichaamsgeneratie uit embryonale stamcellen van muizen

  1. Bereid mESC serumvrij kweekmedium voor: DMEM/F12 en neurobasaal medium gemengd met een verhouding van 1:1. Het kweekmedium wordt aangevuld met MEM niet-essentiële aminozurenoplossing (1x), natriumpyruvaat (1 mM), L-glutamine (2 mM), penicilline-streptomycine (100 U/mL), bèta-mercaptoethanol (50 μM), N2 en B27 supplementen (1x), PD0325901 (1 μM), CHIR99021 (3 μM) en leukemieremmende factor (LIF) (1.000 U/mL).
  2. Eb-differentiatiemedium voorbereiden: DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), MEM niet-essentiële aminozuren (1x), natriumpyruvaat (1 mM), L-glutamine (2 mM), penicilline-streptomycine (100 U/mL), bèta-mercaptoethanol (50 μM).
  3. Kweek mESC's op 10 cm plastic gerechten voorgecoat met 0,1% (w/v) gelatine in mESC cultuur serum-vrij medium.
  4. Wanneer mESCs 60% samenvloeiing bereiken, verwijder kweekmedium en was voorzichtig 1x met 2 mL gesteriliseerde PBS.
  5. Verwijder PBS volledig en voeg 2 mL cellosmiddel toe. Incubeer het kweekgerecht bij 37 °C gedurende 5 min.
  6. Activeer de reactie door 8 mL EB-differentiatiemedium in de schotel toe te voegen.
  7. Dissocieren mESC kolonies door pipetteren op en neer 15-20 keer om een eencellige suspensie te verkrijgen.
  8. Centrifugeer de cellen op 300 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min en verwijder de supernatant voorzichtig.
  9. Cellen tellen (bijvoorbeeld met behulp van een hemocytometer).
  10. Stel de celpellet opnieuw op met EB-differentiatiemedium en pas de concentratie aan op 2 x 104 cellen/mL.
  11. Draai het deksel van een kweekschaal van 15 cm om en gebruik een 200 μL meerkanaals pipet om 20 μL druppels geresuspendeerde cellen (~400 cellen/drop) op het deksel te deponeren.
  12. Draai het deksel voorzichtig om op de onderste kamer en broed de schotel in met hangende druppels bij 37 °C met 5% CO2 en 95% vochtigheid gedurende 3 dagen.
  13. Verzamel de EB's door het deksel voorzichtig te wassen met 10 mL PBS en breng de EB-bevattende suspensie over op een kunststof buis van 50 mL.
  14. Plaats de buis op RT voor 30 min, zodat de KMO's zal zinken naar de bodem door de zwaartekracht. Verwijder voorzichtig de supernatant.
  15. Zet de EB voorzichtig op met 10 mL vers EB differentiatiemedium en breng over op een bacteriologische petrischaal van 10 cm.
  16. Controleer EB formatie 3-6 dagen later met behulp van een omgekeerde microscoop. De gegenereerde DEEL-E's moeten rond en homogeen zijn.
  17. Incubeer de culturen bij 37 °C met 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid. EB's zullen zich blijven onderscheiden in de drie kiemlagen en kunnen op verschillende tijdspunten worden verzameld voor analyse.

2. Dissociatie van DE B's

  1. Verzamel de E's van twee tot drie 10 cm afwas in een plastic buis van 50 mL. Centrifugeer de B's op 300 x g bij RT gedurende 5 min en verwijder de supernatant voorzichtig.
  2. De B's opnieuw opschorten met 10 mL PBS. Centrifugeer DE B's op 300 x g bij RT gedurende 3 min en verwijder de supernatant.
  3. Voeg 2 mL trypsin-EDTA toe (0,25%) pellet en de buis bij 37 °C incuberen gedurende 15 min. Pipette elke 3 min op en neer om een eencellige suspensie te verkrijgen.
  4. Voeg 8 mL EB differentiatie medium toe om de trypsine reactie te stoppen. Controleer EB dissociatie onder de microscoop en tel de cellen.

3. Fixatie

  1. De cellen opnieuw opschorten in vers EB-kweekmedium bij 1 x 106 cellen/mL. Gebruik voor een buis van 50 mL maximaal 4,5 x 107 cellen in 45 mL medium.
  2. Voeg paraformaldehyde uit een voorraad van 37% (niet ouder dan 6 maanden) toe aan een uiteindelijke concentratie van 1%.
    LET OP: Volg de juiste gezondheids- en veiligheidsvoorschriften tijdens het hanteren van paraformaldehyde omdat het een gevaarlijke chemische stof is.
  3. Incubatie voor 10 min bij RT onder rotatie.
  4. Blus het formaldehyde door glycine toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 0,125 M.
  5. Incubeer voor 5 min bij RT onder rotatie.
  6. Breng de vaste cellen over naar het ijs en houd het voortaan koud op 4 °C.
  7. Pellet de cellen op 300 x g voor 5 min in een gekoelde centrifuge.
  8. Gooi de supernatant weg en stop de pellet opnieuw in koude PBS (1 mL voor 5 x 106 cellen), en breng vervolgens over op 1,5 mL safe-lock buizen.
  9. Pellet de cellen op 300 x g voor 5 min bij 4 °C, gooi de supernatant, en snap-freeze de pellets in vloeibare stikstof. Bewaar op -80 °C of ga verder met het onderstaande protocol.

4. Cellyse en beperking enzym verteren

  1. Zet de celpellet voorzichtig opnieuw op in 0,25 mL vers bereide ijskoude lysisbuffer (10 mM Tris-HCl pH = 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% Igepal CA630 en 1x proteaseremmers) per 2-5 x 106 cellen. Zie Tabel 1voor te bereiden op 5 mL lysisbuffer.
  2. Incubeer de cellen gedurende 15 min op ijs.
  3. Centrifugeer op 1.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg en bewaar de pellet, die de kernen bevat.
  4. Was de pelleted kernen met 500 μL koude lysisbuffer.
  5. Hang de pellet voorzichtig op in een buis van 1,5 mL met 50 μL van 0,5% SDS in 1x buffer 2 en broed de buis vervolgens in een verwarmingsblok op 62 °C gedurende 10 min.
  6. Haal de buizen uit het verwarmingsblok en voeg 170 μL vergistingsbuffer toe met 25 μL van 10% triton X-100 om de SDS te doven. Meng goed door pipetteren, het vermijden van overmatig schuimen.
  7. Incubeer bij 37 °C gedurende 15 min.
  8. Voeg 25 μL spijsverteringsbuffer toe, meng door omte keren en neem 8 μL als onverteerd eis. Houd het onverteerd controlemonster op -20 °C. Voeg 100 U MboI-restrictieenzym (4 μL van een 25 U/μL-voorraad) toe aan de resterende kernen en verteer de chromatine gedurende 2 uur bij 37 °C onder rotatie. Voeg nog een aliquot van 100 U van MboI en incubeer voor een extra 2 uur.
  9. Voeg nog eens 100 U van MboI en incubeer onder rotatie 's nachts bij 37 °C.
  10. Voeg de volgende dag nog eens 100 U van MboI toe en incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C onder rotatie.
  11. Neem 8 μL als een verteerd controlemonster. De-crosslink verteerde controlemonsters en de onverteerde controlemonsters uit stap 4.8 door toevoeging van 80 μL TE-buffer (10 mM Tris pH = 8, 1 mM EDTA) en 10 μL proteinase K (10 mg/mL). Incubeer bij 65 °C gedurende 1 uur.
  12. Voer 20 μL aliquots uit op een gel van 0,6% om de spijsverteringsefficiëntie te controleren. Succesvolle spijsverteringen tonen vooral fragmenten in het 3,0-0,5 kb bereik.

5. Nabijheidsligatie en crosslink omkering

  1. Incubeer de MboI-verteerde monsters bij 65 °C in een verwarmingsblok gedurende 20 min om MboI te inactiveren en koel vervolgens af naar RT.
  2. Centrifugeer de buizen gedurende 5 min bij 1.000 x g bij RT, verwijder de supernatant en los de pellet op in 200 μL verse ligasebuffer.
  3. Voeg 1.000 μL van de ligatiemastermix toe aan elk monster. Zie Tabel 2om 1.000 μL van de ligatiemastermix voor te bereiden.
  4. Meng door 's nachts bij RT om te keren en in te broeden met langzame rotatie (9 rpm).
  5. Elimineer RNA- en eiwitresten door 100 μL proteinase K (10 mg/mL) en 10 μL RNase A (10 mg/mL) toe te voegen. Incubeer monsters bij 55 °C gedurende 45-60 min.
  6. Blijf de monsters bij 65 °C uitbroeden gedurende nog eens 4 uur.

6. DNA-afschutering en grootteselectie

  1. Koele buizen naar RT.
  2. Centrifugeer gedurende 5 min bij 1.000 x g bij 4 °C.
  3. Splits het monster in drie 400 μL aliquots in 2 mL buizen en voeg 2 μL glycogeen (20 mg/m), 40 μL natriumacetaat (3 M, pH = 5,2) en 2,5 x volumes (1 mL) van 100% ethanol toe aan elke buis. Meng door om te keren en in te broeden op -80 °C gedurende 45-60 min.
  4. Centrifugeer op 16.000 x g bij 4 °C gedurende 25 min. Houd de buizen na het spinnen op ijs en verwijder de supernatant voorzichtig door te pipetteren.
  5. Was de DNA-pellets door het opnieuw op te schorten in 800 μL van 70% ethanol. Centrifugeer bij 16.000 x g bij 4 °C gedurende 5 min.
  6. Verwijder de supernatant en voer de was nog eens uit met 800 μL van 70% ethanol.
  7. Los de pellet op in 130 μL 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) en incubeer bij 37 °C gedurende 15 min om het DNA volledig op te lossen. Gebruik indien nodig pipettering om eventuele neerslag opnieuw op te schorten.
  8. Meet de DNA-opbrengst; 2,5-5 μg chromatine kan worden verwacht voor 1 x 106 cellen. Controleer de ligatie door ± 200 ng van het 3C-product op een agarosegel van 0,6% te laten draaien. Succesvolle ligaties tonen meestal DNA-fragmenten > 3 kb. Bewaar de monsters op -20 °C.
  9. Verdun een monster in een buis van 0,65 mL die geschikt is voor sonicatie tot 10 ng/μL in 100 μL van 1x Tris buffervolume (1 μg per buis). De standaardhoeveelheid die wordt gebruikt voor de voorbereiding van de bibliotheek is 3 μg, dus voer de sonicatie uit in drie afzonderlijke buizen indien nodig.
  10. Schuif DNA tot een grootte van 150-700 bp (gemiddeld = 400-500 bp) met behulp van de volgende parameters op de sonicator: Cycli: 6-8 van 20 s op -60 s off. Dit moet het DNA geschikt maken voor high-throughput sequencing bibliotheek voorbereiding met behulp van Illumina sequencers.
  11. Breng het gepureerde DNA over naar een normale nieuwe veilige-lock buis. Bundel meerdere sonicaties van hetzelfde monster.
  12. Verwarm een fles DNA-zuiveringskralen bij RT. Gebruik voortaan lage bindingstips.
  13. Voeg 1,8x volumes kralen toe aan de DNA-buis en beweeg voorzichtig opnieuw.
  14. Incubeer bij RT voor 5 min.
  15. Verzamel de kralen met een magnetisch rek. Was de kralen 2x met 1 mL vers bereide 80% ethanol terwijl de buizen in het magnetische rek blijven.
    LET OP: Verwijder alle ethanol, inclusief restdruppels.
  16. Droog de kralen kort (2-3 min) bij RT.
    LET OP: Droog kralen niet langer dan 5 min. Dit zal de DNA-opbrengst verminderen.
  17. Hang de kralen opnieuw op met 90 μL 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) om het DNA te ontleden.
  18. Meet de DNA-opbrengst en analyseer een 5 μL aliquot op een 1,5% gel. Er moet zeer weinig verlies in vergelijking met de presonication opbrengst.

7. Bibliotheekvoorbereiding voor sequencing

  1. Voeg 15 μL mastermix toe uit de voorbereidingskit van de bibliotheek. Om de uiteinden van het gepureerde DNA te herstellen, combineert u 10 μL van 10x end repair reaction buffer en 5 μL end repair enzymmix.
  2. Incubatie bij RT voor 30 min.
  3. Voeg 1,1x volume DNA-zuiveringskralen toe en hang voorzichtig op.
  4. Incubeer bij RT voor 5 min.
  5. Verzamel de kralen met een magnetisch rek. Was de kralen twee maal met 1 mL vers bereide 80% ethanol terwijl de buizen in het magnetische rek blijven. Verwijder ethanol.
  6. Droog de kralen gedurende 2-3 min bij RT. Resuspend de kralen met 42 μL van 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) om het DNA los te maken.
  7. Voeg 8 μL dA-tailing master mix toe aan elk monster. Om de dA-tailing master mix voor te bereiden, combineer t.a.v. 5 μL van 10x dA-tailing reactiebuffer en 3 μL Klenow fragment exo minus.
  8. Incubatie bij 37 °C gedurende 30 min.
  9. Voeg 2 μL kalverdarmalkalische fosfatase (CIP) toe om DNA te desfoyleren.
  10. Incubatie gedurende 30 min bij 37 °C, dan 60 min bij 50 °C.
  11. Voeg 1.1x volumes van DNA-zuivering kralen en voorzichtig opnieuw opschorten.
  12. Incubeer bij RT voor 5 min.
  13. Verzamel de kralen met een magnetisch rek. Was de kralen 2x met 1 mL vers bereide 80% ethanol terwijl de buizen in het magnetische rek blijven.
  14. Droog de kralen kort (2-3 min) bij RT. Resuspend kralen met 35 μL van 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) om het DNA los te maken.
  15. Voer de ligaatiereactie van de adapter uit. Gebruik verlaagde adapter/ligaseconcentraties zoals vermeld in tabel 3.
  16. Incubeer bij 20 °C gedurende 15 min.
  17. Voeg 3 μL van het mengsel van uracil DNA glycosylase en DNA glycosylase lyase endonuclease VII (bijvoorbeeld USER) enzym toe, meng door pipetteren en incubeer bij 37 °C gedurende 15 min.
  18. Verhoog het volume tot 100 μL met water, kook 5 min bij 96 °C en houd de monsters op ijs.
  19. Voeg 1.1x volumes van DNA-zuivering kralen en voorzichtig opnieuw opschorten.
  20. Incubeer bij RT voor 5 min.
  21. Verzamel de kralen met een magnetisch rek. Was de kralen 2x met 1 mL vers bereide 80% ethanol terwijl de buizen in het magnetische rek blijven.
  22. Droog de kralen gedurende 2-3 min bij RT. Resuspend de kralen met 50 μL van 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH = 8) om het DNA los te maken.

8. 4C chromatine interactie bibliotheek versterking en zuivering

  1. Versterk de 4C-bibliotheek met 10 μL bibliotheek om de eerste PCR uit te voeren. De PCR-installatie en het pcr-programma zijn te vinden in tabel 4.
  2. Nestdpcr uitvoeren. De geneste PCR-installatie en -programma zijn te vinden in tabel 5.
  3. Pool PCR producten voor elke bibliotheek en zuiveren met een 1.1x DNA zuivering kralen.
  4. Meet de DNA-opbrengst en analyseer een 5 μL aliquot op een 1,5% gel.
  5. Pas de bibliotheekconcentratie aan en volg de bibliotheek. Als deze geïndexeerd is, kunnen de bibliotheken worden samengevoegd voordat ze worden gesommeerd.

Resultaten

Zes dagen na de inductie van ESC-differentiatie in de hangende druppels, kregen we een homogene populatie van EB's die werden gebruikt voor verdere analyses (Figuur 1). We hebben de UMI-4C methode23 aangepast om specifieke chromatineinteractie te kwantificeren bij promotors van lineage specifieke genen in EBs24. Een schematisch overzicht van het protocol met representatieve kwaliteitscontrolegels in verschillende stappen wordt weergegeven in figuur 2A. De eerste kwaliteitscontrole werd uitgevoerd om de efficiëntie van de MboI beperking enzym vertering te bepalen. Efficiënte spijsvertering toonde een fragmentgrootte van minder dan 3 kbp(figuur 2B). Van nota, mESC en EB chromatine spijsvertering was moeilijk en soms resterende onverteerd chromatine bleef bestaan. De tweede kwaliteitscontrole werd uitgevoerd na ligatie om te controleren of de meeste fragmenten waren nu > 3 kbp (Figuur 2B). Vervolgens werden chromatinefragmenten verkregen na sonicatie geanalyseerd door gelelektroforese. Fragmentgroottes van 400-500 bp werden verwacht (figuur 2B).

Na defosforylatie en single-end adapterligatie werden twee rondes PCR uitgevoerd om de doelstellingen van belang te versterken. Een geneste benadering werd gebruikt om een set van twee primers voor elke locus te ontwerpen. Dit hielp de specificiteit te verbeteren. Elk doel werd afzonderlijk versterkt met twee verschillende primerparen om PCR-omstandigheden te optimaliseren (d.w.z. primerparen A en B voor de Pou5f1-locus en primerparen C en D voor respectievelijk de T-locus) en resulteerde in een DNA-uitstrijkje rond 400 bp T (figuur 2C). Als alternatief werd multiplex PCR uitgevoerd om de doelstellingen A en C tegelijkertijd te versterken(figuur 2D) en resulteerde dit in een vergelijkbare fragmentgrootte na zuivering (figuur 2D). Primers die worden gebruikt voor 4C bibliotheek voorbereiding (loci van Pou5f1 en T)zijn te vinden in tabel 6.

Voor data-analyse werden raw sequencing reads eerst uitgelijnd met het herhek mm10 muisgenoom, werden ze allemaal gedupliceerd en werden de gelezen reads van lage kwaliteit (< 20) verwijderd. Voor elk aas werd de informatie over elk beperkingsfragment verkregen door het aantal leesfragmenten te berekenen en werd een ruw contactprofiel verkregen. Vervolgens werd de regio van belang gedefinieerd als alle beperking fragmenten met 2 kbp en 250 kbp afstand tot het aas. De omvang van elk beperkingsfragment werd vergroot door de aangrenzende beperkingsfragmenten achtereenvolgens samen te voegen om de profielen glad te maken totdat een drempel van 5% van het totale aantal ruwe contacten in de regio van belang werd bereikt. Om ervoor te zorgen dat de replica's werden geïntegreerd, en de voorwaarden werden vergeleken, hebben we zowel hellingen en willekeurige onderscheppingen op de beperking fragment niveau. Het gemiddelde profiel per aandoening en de vouwverandering tussen deze omstandigheden werden uitgezet, zoals weergegeven in figuur 3. Tijdens EB differentiatie, de contacten tussen de versterkers en de promotor van de pluripotentie gen Pou5f1 afgenomen, terwijl versterker-promotor contacten van mesendoderm lineage leerzame transcriptie factor T verhoogd (Figuur 3), het verstrekken van functionele inzichten over deze ontwikkeling versterkers.

figure-results-1
Figuur 1: Representatieve afbeeldingen van mESC en afgeleide embryoidlichamen. Dag 0 mESC gekweekt in serumvrije omstandigheden (links) en homogene dag 6 EB's (rechts) waargenomen door een omgekeerde microscoop. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: 4C-workflow en representatieve afbeeldingen van de belangrijkste stappen van het protocol. (A) Schematische workflow van de kwantitatieve 4C. RS = beperkingssite; VS = stroomopwaarts; DS = stroomafwaarts; UP = universele primer; D = de afstand tussen RS en DS moet idealiter 5-15 bp. (B) Voorbeelden van MboI-verteerd chromatine (I), in-kernen ligated chromatine (II), en gesoniceerde chromatine (III). De nummers aan de linkerkant geven de DNA-maten bepaald door de DNA-ladder lopen voor elk monster. (C) Voorbeelden van PCR-versterking in de twee loci: Pou5f1 (primers A en B) en T (primer C en D). (D) Voorbeelden van multiplex PCR-versterking bij Pou5f1 en T loci met behulp van primers A en C. ES = embryonale stamcellen; EB = embryoïnde lichamen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Voorbeelden van 4C-profielen. Kwantitatieve 4C profielen voor aas gelegen op de Pou5f1 en T gen promotors zoals gezegd in mESCs en Dag 6 EBS. Het bovenste paneel toont percelen van gemiddelde contacten gegenereerd uit twee onafhankelijke biologische repliceert; het onderste paneel toont de gemiddelde contactvouwwijziging van dag 6-EB's ten opzichte van mESCs (gemiddelde van de twee replica's). Lichtblauwe boxen geven de locatie aan van versterkers met dynamische veranderingen tijdens differentiatie. Figuur aangepast van Tian et al.24. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Voor 5mL
1M Tris-HCl, pH8.050 μL
5M NaCl10 μL
10% Igepal CA630100 μL
50x Roche complete proteaseremmers100 μL
MilliQ Water4,74 mL

Tabel 1: Lysis buffer.

Voor 1000μL
MilliQ Water869 μL
10X NEB T4 DNA Ligase Buffer120 μL
20mg/mL Runderserum Albumine6 μL
2000 U/μL T4 DNA Ligase5 μL

Tabel 2: Ligatie master mix voorbereiding.

Voor 15 μL
5x snelle ligatiereactiebuffer10 μL
NEBNext-adapter3 μL
Snelle T4 DNA ligase2 μL

Tabel 3: Adapterligatiereactie.

PCR-installatie
Adapter ligted library-on-deads10 μL
PCR-kwaliteitwater20,25 μL
10 μM Target specifieke primer3,75 μL
10 μM NEB Index primer3,75 μL
Herculase II 5X buffer10 μL
10 Mm dNTPs1,25 μL
Herculase II polymerase1 μL
Totaal volume50 μL
PCR-programma
Stap 1: 98 °C - 2 min
Stap 2: 98 °C - 20s
Stap 3: 65 °C - 30s
Stap 4: 72 °C - 45s
Stap 5: ga naar stap 2 om een totaal van 15-18 cycli te maken
Stap 6: 72 °C - 3 min
Stap 7: 4 °C – vasthouden

Tabel 4: 4C chromatine interactie bibliotheek versterking, eerste PCR.

Geneste PCR-installatie
DNA-fragment van de eerste PCR10 μL
PCR-kwaliteitwater20,25 μL
10 μM specifieke primer+P5 Illumina primer3,75 μL
10 μM P7 Illumina primer3,75 μL
Herculase II 5X buffer10 μL
10 Mm dNTPs1,25 μL
Herculase II polymerase1 μL
Totaal volume50 μL
Genest PCR-programma
Stap 1: 98 °C - 2 min
Stap 2: 98 °C - 20s
Stap 3: 65 °C - 30s
Stap 4: 72 °C - 45s
Stap 5: ga naar stap 2 om een totaal van 15-18 cycli te maken
Stap 6: 72 °C - 3 min
Stap 7: 4 °C – vasthouden

Tabel 5: 4C chromatine interactie bibliotheek versterking, geneste PCR.

NaamReeks (5'-3')
DS-Oct4-AAATGATACGGACCACCACCACCGAGATACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCTTGCAAAGATAAAGCACCAGGCCAG
VS-Oct4-ATCTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCC
DS-Oct4-BAATGATACGGACCACCACCACCGAGATACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCTGTGATGTCAGGGCGCTGGAGCCGGGCT
VS-Oct4-BACCAGGTGGGGGTGATGGGTCAGGGGGGCT
DS-T-CAATGATACGGACCACCACCACCGAGATACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCTCCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAAAGGAGC
US-T-CGATTACACCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAA
DS-T-DAATGATACGGACCACCACCACCGAGATACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCTGGCTTTGGAGAGGTCAAGGAGACCCGGGAG
US-T-DGCTGAGGCTTTGGAGAGGTCAAGGAGACC
UP-4CCAAGCAGAAGACGGCATACGA
Adap-i1CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAGTGTGATGTGACTGGAGTTCAGAGA
CGTGTGCTCTTCCTCCGATC
Adap-i2CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGA
CGTGTGCTCTTCCTCCGATC
Adap-i3CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGAGA
CGTGTGCTCTTCCTCCGATC
Adap-i4CAAGCAGAAGACGGCGAGAGATTGGTCGGTGACTGGAGTTCAGAGAGA
CGTGTGCTCTTCCTCCGATC

Tabel 6: Primers gebruikt voor 4C bibliotheek voorbereiding.

Discussie

De hangdropcultuurmethode heeft geen extra groeifactoren of cytokines nodig en genereert reproduceerde homogene populaties VAN EB's uit een vooraf bepaald aantal mESCs5. Hier beschrijven we een protocol van kwantitatieve 4C aangepast aan de UMI-4C aanpak om versterker-promotor contact van lijnspecifieke transcriptiefactoren in het EB differentiatiemodel te kwantificeren. We identificeerden chromatineregio's die tijdens EB-differentiatie op dynamische wijze contact opnemen met promotors van Pou5f1- en T-genen. Pou5f1 werd gedownreguleerd tijdens EB differentiatie en de contactfrequentie tussen de Pou5f1 promotor en zijn distale versterker verminderde. Omgekeerd werd T tijdens EB-differentiatie upregulated en hebben we drie versterkers geïdentificeerd waarvoor de contactfrequenties met hun promotor zijn afgenomen (Figuur 3). Om de identificatie te bevestigen, kan een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) test van actieve histone merk H3K27ac worden uitgevoerd24, omdat dit histone merk is aangetoond dat geassocieerd met versterker activering en versterkers verliezen dit merk tijdens hun inactivatie11.

Een standaard 4C techniek is op grote schaal gebruikt om het chromatine contactprofiel van specifieke genomische sites te onderzoeken25. Deze benadering is echter moeilijk kwantitatief te interpreteren, zelfs na uitgebreide normalisatie26,27,28 vanwege de vooroordelen die worden geïntroduceerd door de heterogeniteit van pcr-fragmentatiegrootte en de onmogelijkheid om PCR-duplicaten te onderscheiden. Onze kwantitatieve 4C-methode is grotendeels identiek aan de UMI-4C-techniek die het mogelijk maakt de kwantificering van enkele moleculen met behulp van sonicatie en een geneste-ligatie-gemedieerde PCR-stap om de beperking van de klassieke 4C-aanpak te omzeilen23. Echter, in tegenstelling tot de UMI-4C die gebruik maakt van unieke moleculaire identificatiemiddelen, ons kwantitatieve 4C-protocol maakt de kwantificering van enkele moleculen op basis van de specifieke DNA-breuk geproduceerd door de sonicatie stap. Het maakt ons protocol compatibel met commerciële DNA-bibliotheek voorbereidingkits, waardoor de behoefte aan primers met unieke moleculaire identificatiemiddelen wordt voorkomen.

Ons protocol omvat een aantal belangrijke stappen die moeten worden overwogen. Net als bij de klassieke 4C-methode28zijn kritische factoren van ons protocol de efficiëntie van de spijsvertering en de ligatie tijdens de voorbereiding van de 3C-moleculen. Lage spijsvertering/ligatie-efficiëntie kan de complexiteit van de interactie met een fragment van belang drastisch verminderen, wat resulteert in een verminderde resolutie. Zoals eerder beschreven23, een andere kritische stap van het protocol is het ontwerp van de primers voor de bibliotheek versterking. De tweede PCR reactie primers moeten worden gevestigd 5-15 nt van de ondervraagde beperking site. In een 75 nt sequencing lezen, dit zorgt voor ten minste 40 nt links van de capture lengte voor mapping. De primer die in de eerste PCR-reactie wordt gebruikt, moet stroomopwaarts van de tweede primer worden ontworpen zonder overlap en beide moeten specifiek genoeg zijn om een efficiënte DNA-versterking te garanderen. Voor multiplexing moeten primers onafhankelijk worden ontworpen, met als doel een smelttemperatuur (Tm)van 60-65 °C. Bovendien wordt, net als voor andere 3C-technieken, de resolutie van de kwantitatieve 4C-methode bepaald door het beperkingsenzym dat in protocol25wordt gebruikt . Dit protocol maakt gebruik van een beperking enzym met een 4 bp erkenning site, MboI. De maximale resolutie met dit enzym is ongeveer 500 bp, maar dit is zeer locus afhankelijk en zelden bereikt. Een andere beperking is dat interacties die optreden tussen elementen in hetzelfde beperkingsfragment niet detecteerbaar zijn. Bovendien kunnen interacties die zich op een afstand van één beperkingsplaats voordoen, niet worden onderscheiden van de onverteerde achtergrond. Het gebruik van een invulstap voorafgaand aan de ligatie kan de detectie van deze interacties mogelijk maken.

Kwantitatieve 4C is bij uitstek geschikt om chromatine contacten van gerichte loci te ondervragen. De specifieke PCR-versterkingsstap beperkt echter het aantal loci dat tegelijkertijd kan worden onderzocht. Een manier om het aantal gerichte loci te verhogen is om multiplex de PCR stappen om tegelijkertijd te versterken verschillende doelen, maar dit vereist compatibiliteit van de gebruikte primers en het testen van elk primer paar voorafgaand aan de implementatie. Als globale veranderingen van chromatine architectuur bij promotors gewenst zijn, genoom-brede benaderingen zoals Hi-C, PC Hi-C, of HiChIP zou meer geschikt29,30,31.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen F. Le Dily, R. Stadhouders en leden van het Graf laboratorium bedanken voor hun advies en discussies. G.S. werd ondersteund door een Marie Sklodowska-Curie fellowship (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), T.V.T. door een Juan de la Cierva postdoctoralfellowship (MINECO, FJCI-2014-22946). Dit werk werd ondersteund door de Europese Onderzoeksraad in het kader van het7e Kaderprogramma FP7 (ERC Synergy Grant 4D-Genome, grant agreement 609989 to T.G.), het Spaanse ministerie van Economie, Industrie en Concurrentievermogen (MEIC) aan het EMBL-partnerschap, Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013-2017 en CERCA Program Generalitat de Catalunya.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.1% EmbryoMax gelatinEMD MilliporeES-006-BCelcultuur
0.25% Trypsin-EDTA25200072
AMPure XPBeckman Coulter101362244C/DNA zuivering
B27 supplementGibco17504044Celcultuur
Beta-mercaptoethanolGibco31350010Celcultuur
Bioruptor PicoDiagencodeB010600104C/sonicatie
BSANEBB9000S4C
CHIR99021Selleck ChemicalsS1263Celcultuur
CIPNEBM02124C
cOmplete Protease Inhibitor CocktailRoche46931160014C
DMEM/F12 mediumGibco11320033Celcultuur
dNTPNEBN0447S4C
ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF)EMD MilliporeESG1107Celcultuur
Formaldehyde solution (37%)Sigma252549-25ML4C
GlycinSigmaGE17-1323-014C
GlycogenThermoFischerR05514C
Herculase II Fusion DNA polymeraseAgilent6006754C
IGEPAL CA-630SigmaI3021-50ML4C
Knockout DMEM10829018
L-glutamineGibco25030081Celcultuur
MboINEBR0147M4C
MEM non-essential amino acidsGibco11140050Celcultuur
N2 supplementGibcoA1370701Celcultuur
NEBNext DNA Library prepNEBE60404C
NEBuffer 2.1NEBB7202S4C/digestie
Neurobasal mediumGibco21103049Celcultuur
PD0325901Selleck ChemicalsS1036Celcultuur
Penicillin StreptomycinGibco15140122Celcultuur
Proteinase KNEBP8107S4C
Qubit 4 FluorometerThermoFischerQ332384C
Qubit dsDNA HS Assay KitThermoFischerQ328514C
RNase AThermoFischerEN05314C
Sodium pyruvate solutionGibco11360070Celcultuur
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentGibcoA1110501Celcultuur
T4 DNA Ligase Reaction BufferNEBB0202S4C
T4 DNA Ligase Reaction BufferNEBM0202M4C

Referenties

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Martello, G., Smith, A. The nature of embryonic stem cells. Annual Review Cell and Developmental Biology. 30, 647-675 (2014).
  3. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  4. Loh, K. M., Lim, B., Ang, L. T. Ex uno plures: molecular designs for embryonic pluripotency. Physiological Reviews. 95 (1), 245-295 (2015).
  5. Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells International. 2012, 738910(2012).
  6. Gaszner, M., Felsenfeld, G. Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. Nature Reviews in Genetics. 7 (9), 703-713 (2006).
  7. Lenhard, B., Sandelin, A., Carninci, P. Metazoan promoters: emerging characteristics and insights into transcriptional regulation. Nature Reviews in Genetics. 13 (4), 233-245 (2012).
  8. Long, H. K., Prescott, S. L., Wysocka, J. Ever-Changing Landscapes: Transcriptional Enhancers in Development and Evolution. Cell. 167 (5), 1170-1187 (2016).
  9. Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews in Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
  10. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews in Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  13. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews in Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
  14. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  15. Lettice, L. A., et al. Development of five digits is controlled by a bipartite long-range cis-regulator. Development. 141 (8), 1715-1725 (2014).
  16. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  17. de Wit, E., de Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes and Development. 26 (1), 11-24 (2012).
  18. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  19. Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).
  20. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: from fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  21. Stadhouders, R., et al. Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions. Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).
  22. van de Werken, H. J., et al. Robust 4C-seq data analysis to screen for regulatory DNA interactions. Nature Methods. 9 (10), 969-972 (2012).
  23. Schwartzman, O., et al. UMI-4C for quantitative and targeted chromosomal contact profiling. Nature Methods. 13 (8), 685-691 (2016).
  24. Tian, T. V., et al. Whsc1 links pluripotency exit with mesendoderm specification. Nature Cell Biology. 21 (7), 824-834 (2019).
  25. Chen, H., et al. Dynamic interplay between enhancer-promoter topology and gene activity. Nature Genetics. 50 (9), 1296-1303 (2018).
  26. Apostolou, E., et al. Genome-wide chromatin interactions of the Nanog locus in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Cell Stem Cell. 12 (6), 699-712 (2013).
  27. de Wit, E., et al. The pluripotent genome in three dimensions is shaped around pluripotency factors. Nature. 501 (7466), 227-231 (2013).
  28. Krijger, P. H. L., Geeven, G., Bianchi, V., Hilvering, C. R. E., de Laat, W. 4C-seq from beginning to end: A detailed protocol for sample preparation and data analysis. Methods. , (2019).
  29. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  30. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  31. Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Kwantitatieve 4C methoderestrictie enzymdigestiesonificatie DNA shearinggenest ligatie gemedieerde PCRhigh throughput sequencingbio informatische analysePou5f1 T locus
Identificatie van enhancer-promotor contacten in embryoïide lichamen door kwantitatieve chromosoomconformatie Capture (4C)
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.