Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Voorbereiding van Drosophila Larval en Pupal Testes voor analyse van celafdeling in levend, intact weefsel

8.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60961

⸱

19 mei 2020

 , 
1Department of Anatomy, Physiology, and Genetics, F. Edward Hébert School of Medicine, Uniformed Services University of the Health Sciences

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om celdeling in intact weefsel te analyseren door levende en vaste celmicroscopie met drosophila meiotic spermatocyten. Het protocol laat zien hoe hele, intacte teelballen van Drosophila larven en vroege poppen te isoleren, en hoe ze te verwerken en te monteren voor microscopie.

Samenvatting

Experimentele analyse van cellen die zich verdelen in levende, intacte weefsels en organen is essentieel voor ons begrip van hoe celdeling integreert met ontwikkeling, weefselhomeostase en ziekteprocessen. Drosophila spermatocyten die meiose ondergaan zijn ideaal voor deze analyse omdat (1) hele Drosophila-testes die spermatocyten bevatten relatief eenvoudig te bereiden zijn op microscopie, (2) de grote afmetingen van de spermatocyten maken ze zeer geschikt voor beeldvorming met hoge resolutie en (3) krachtige Drosophila genetische hulpmiddelen kunnen worden geïntegreerd met in vivo analyse. Hier presenteren we een gemakkelijk toegankelijk protocol voor de voorbereiding van hele teelballen van Drosophila derde instar larven en vroege poppen. We beschrijven hoe je meiotische spermatocyten identificeren in voorbereide hele teelballen en hoe ze in beeld kunnen worden gebracht door time-lapse microscopie. Protocollen voor fixatie en immunostaining hele teelballen zijn ook voorzien. Het gebruik van larve teelballen heeft verschillende voordelen ten opzichte van beschikbare protocollen die volwassen teelballen gebruiken voor spermatocytenanalyse. Het belangrijkste is dat larve teelballen kleiner en minder vol zijn met cellen dan volwassen teelballen, en dit vergemakkelijkt sterk hoge resolutie beeldvorming van spermatocyten. Om deze voordelen en de toepassingen van de protocollen aan te tonen, presenteren we resultaten die de herverdeling van het endoplasmatische reticulum tonen met betrekking tot spindelmicrotubuli tijdens celdeling in een enkele spermatocyten die zijn afgebeeld door time-lapse confocale microscopie. De protocollen kunnen worden gecombineerd met expressie van een willekeurig aantal fluorescerende gelabelde eiwitten of organellemarkers, evenals genmutaties en andere genetische hulpmiddelen, waardoor deze benadering bijzonder krachtig is voor de analyse van celdelingmechanismen in de fysiologische context van hele weefsels en organen.

Inleiding

Celdeling wordt vaak bestudeerd met behulp van cellijnen gekweekt in cultuur1. Hoewel we een schat aan waardevol inzicht en begrip van fundamentele mechanismen uit deze studies hebben opgedaan2,kunnen cellen die in cultuur worden gekweekt de fysiologie van celdeling niet volledig samenvatten omdat het voorkomt in intact, levend weefsel. In intacte weefsels en organen moeten cellen zich bijvoorbeeld op de juiste plaats en op het juiste moment verdelen, zodat nageslachtcellen zich goed in het weefsel bevinden, zodat ze passende differentiatie of functionele programma's kunnen ondergaan, zodat celproliferatie goed wordt gecoördineerd met weefselgroei of homeostase3. Voor cellen die in cultuur worden gekweekt, wordt celdeling over het algemeen geregeld door groeifactoren in het kweekmedium4, en dus kunnen we niet van deze cellen leren hoe in vivo omgevingsfactoren zoals weefselarchitectuur of ontwikkelingssignalering het delingproces beïnvloeden. Het is ook belangrijk op te merken dat veel van de cellijnen die worden gebruikt om celdeling te bestuderen, zoals HeLa en U2OS-cellen, waren afgeleid van gemetastaseerde tumoren5. Daarom zijn veel aspecten van de basisfysiologie van deze kankercellen, zoals celcyclus regulerende mechanismen en chromosomale stabiliteit, waarschijnlijk veranderd in vergelijking met gezonde cellen. Volledig begrip van de fysiologie van de celdeling hangt daarom af van ons vermogen om delende cellen in hun eigen, in vivo omgevingen te bestuderen die fysiologische regulerende mechanismen en weefselarchitectuur behouden.

Vooruitgang bij het begrijpen van de werking van celdeling in intacte weefsels en organen wordt belemmerd door moeilijkheden die inherent zijn aan in vivo of ex vivo analyse. Ten eerste kan het moeilijk of onmogelijk zijn om toegang te krijgen tot delende cellen voor microscopische analyse in grote organen of dikke weefsels. Ten tweede is het vaak moeilijk te voorspellen wanneer individuele cellen zich in vivo zullen verdelen. Ten derde kan de weefselfysiologie snel verslechteren tijdens de ex vivo-cultuur. In dit protocol beschrijven we gemakkelijk toegankelijke methoden voor live en vaste analyse van Drosophila melanogaster spermatocyten omdat ze meiotische celdelingen ondergaan binnen volledig intacte teelballen. Deze cellen zijn ideaal voor live, ex vivo analyse omdat ze gemakkelijk toegankelijk zijn met standaard optische methoden zoals confocale microscopie, ze verdelen op voorspelbare tijden en locaties, en intacte teelballen kunnen worden gehandhaafd in ex vivo cultuur voor ongeveer 24 uur. Bovendien zijn Drosophila spermatocyten grote ronde cellen (ongeveer 20-30 μm in diameter) die niet van vorm veranderen wanneer ze zich verdelen, waardoor ze ideaal zijn voor hoge resolutie, time-lapse beeldvorming van cellulaire componenten zoals het spindelapparaat en cytoplasmale organellen. Hoewel deze cellen meiose ondergaan in tegenstelling tot mitose, zijn veel van de essentiële celdelingprocessen zeer vergelijkbaar tussen deze twee celdelingmechanismen6. Deze voordelen, gecombineerd met krachtige Drosophila genetische hulpmiddelen, hebben Drosophila spermatocyten een veelgebruikt model voor ex vivo analyse van essentiële celdelingprocessen met inbegrip van asvorming en regelgeving, cytokinese, en organelle het remodelleren en het verdelen7gemaakt,8,9,10,11.

Spermatocyten zijn cellen die zich in het meinotische stadium van spermatogenese bevinden. In Drosophilabegint spermatogenese met een groep kiembaanstamcellen die zich in een klein gebied bevinden of "hub" op één pool van de testis12,13. Deze cellen delen door een asymmetrische mitose, die aanleiding geeft tot een enkele gedifferentieerde spermatogonium. Spermatogonia ondergaan vervolgens vier synchrone mitosen om een groep van 16 cellen te produceren die nauw verbonden blijven binnen een enkele cyste. In dit stadium gaan de cellen over van een mitotische naar een menotische celcyclus en worden ze spermatocyten genoemd. Spermatocyten brengen ongeveer twee tot drie dagen door in een verlengde G2-fase van de celcyclus, waarin ze dramatisch groeien en cytologische veranderingen ondergaan in de voorbereiding op de twee meiotische divisies en de daaropvolgendezaadsperma13,14. De hele groep van 16 spermatocyten binnen een enkele cyste gaat vervolgens tegelijkertijd de eerste meiotische divisie in. Zo kunnen verschillende meiotische spermatocyten tegelijkertijd worden afgebeeld terwijl ze door celdeling gaan. De eerste meiotische divisie gaat ongeveer 1,5 uur te werk en wordt vrijwel onmiddellijk gevolgd door de tweede menotische divisie, die in totaal 64 spermatids oplevert die zich gaan onderscheiden in volwassen spermatozoa.

Een uniek voordeel van het gebruik van spermatocyten om celdeling in levend, intact weefsel te bestuderen, is dat groepen of cysten van cellen voortdurend vooruitgang boeken in de verschillende stadia van spermatogenese, en cellen in alle stadia van spermatogenese kunnen meestal worden geïdentificeerd in een bepaalde testis (zie figuur 3A). Daarom is het relatief eenvoudig om meiotische cellen in hele teelballen te vinden. Over het algemeen richten we onze analyses op de eerste in plaats van op tweede meiose, omdat deze cellen veel groter en beter vatbaar zijn voor beeldvorming met hoge resolutie, maar het hele proces dat beide meiotic-divisies omvat, kan met succes worden weergegeven. Er moet ook worden opgemerkt dat het algemene protocol voor testisvoorbereiding en -cultuur ook kan worden gebruikt om andere processen van spermatogenese te analyseren, zoals de eerdere mitotische stamcel- of spermatogonale divisies of de cytologische veranderingen die optreden als spermatids rijpen in spermatozoa15. Veel van deze aspecten van spermatogenese zijn zeer bewaard gebleven tussen Drosophila en mensen16.

Drosophila spermatocyten beginnen de meiotische fase van spermatogenese te bereiken tijdens het derde instar larve stadium van Drosophila ontwikkeling13. Daarom kunnen teelballen geïsoleerd vanaf levenscyclusstadia die beginnen met derde instarlarven en met inbegrip van poppen en volwassenen worden gebruikt voor de analyse van delende spermatocyten. Er zijn verschillende uitstekende protocollen beschikbaar voor de extractie van teelballen van volwassen mannelijke vliegen voor levende en vaste analyse van spermatogenese17,18,19. Deze protocollen kunnen de voorkeur hebben voor het bestuderen van late stadia van spermatogenese of als genetische markers die alleen zichtbaar zijn bij volwassenen moeten worden gebruikt. Het protocol richt zich in plaats daarvan op testisvoorbereiding van larven en vroege poppen, omdat teelballen in deze stadia verschillende voordelen hebben die specifiek relevant zijn voor celdelinganalyse door hoge resolutie, time-lapse microscopie. Ten eerste zijn teelballen van larven en poppen kleiner dan die van volwassenen en zijn de cellen in het orgaan minder druk. Hierdoor kunnen delende spermatocyten vaak worden afgebeeld in de buurt van het buitenoppervlak van larve teelballen, zonder dat ze door meerdere lagen lichtverstrooiend weefsel hoeven te dringen. Ten tweede bewegen volwassen teelballen ritmisch als gevolg van samentrekkingen van de bijgevoegde accessoireorganen, en deze bewegingen maken time-lapse beeldvorming van individuele cellen uitdagend. En ten derde, larve teelballen zijn voordelig bij het bestuderen van genmutaties die pop of volwassen dodelijkheid veroorzaken. Onze methoden zijn geoptimaliseerd voor de lange termijn cultuur van teelballen op de microscoop fase, waardoor beeldvorming van meerdere rondes van celdeling of de progressie van individuele cellen door meerdere stadia van spermatogenese in hetzelfde preparaat. We beschrijven ook een protocol voor fixatie en immunostaining van hele teelballen. Over het algemeen zijn onze protocollen bijzonder nuttig voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van celdeling in intact weefsel, en de mogelijkheid om spermatocytenanalyse te combineren met zeer hardnekkige Drosophila genetische hulpmiddelen maakt dit een bijzonder krachtige aanpak.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Dieren, hulpmiddelen en media voorbereiden op dissectie

  1. Kruis mannelijke en vrouwelijke vliegen om nakomelingen van het gewenste genotype te verkrijgen. Nuttige transgene markers voor de identificatie en enscenering van meiotische spermatocyten omvatten GFP-tubuline om de meiotische spindel en RFP-histone 2A te labelen om chromsomes8te etiketteren. Gebruik vijf tot tien vrouwtjes per kruis en onderhoud kruisen op standaard vliegvoedsel in flacons in een 25 °C incubator totdat derde instar larven beginnen te kruipen langs de zijkanten van de flacon (4-5 dagen). Vroege witte poppen zal beginnen vormen een dag later.
  2. Verkrijg twee paar rechte tangen met fijne tips. Zorg ervoor dat de tips scherp zijn, zelfs in lengte, en recht(figuur 1A). Gebruik deze tangen alleen voor dissecties, en dop met 10 μL pipet tips wanneer niet in gebruik.
  3. Bereid een scalpel gereedschap voor.
    1. Steek het stompe uiteinde van een zwarte geanodiseerde stalen insectpen in een pinhouder en draai de schroef van de houder om de pin op zijn plaats te zetten. Met behulp van een paar tangen en onder een ontledenmicroscoop, pak de insectenspeld in het midden en buig deze om een interne hoek van 135° (Figuur 1B) te vormen. Het scherpe uiteinde is voor snijweefsel, terwijl de rand wordt gebruikt voor het overbrengen van teelballen tussen druppels media.
    2. Dop met een 1.000 μL pipettip wanneer deze niet in gebruik is.
  4. Werken in een weefselkweekkap, bereid 5 mL aliquots van Schneider's media en bewaar op 4 °C tot het moment van gebruik. Wanneer klaar om te beginnen dissecties, warm een 5 mL media aliquot tot kamertemperatuur. Breng vervolgens de opgewarmde dissectiemedia over op een spuit van 10 mL en bevestig een spuitfilter van 0,22 μm.

2. Dissectie van testes van larven en vroege poppen

  1. Gebruik de met media gevulde filterspuit om drie druppels media (elk 50 μL) aan de boven-, midden- en onderkant van een glazen schuif te verdrijven.
  2. Gebruik een ontledensonde om vijf tot tien derde instar larven of vroege poppen (poppen die nog steeds wit of geel) naar de bovenste druppel. Roer de larven en poppen voorzichtig in de media met de ontledende sonde om voedsel of vuil te verwijderen.
  3. Onder een ontledenmicroscoop, draai een enkele larve of pop op zijn kant met een ontleden sonde om de twee bilaterale teelballen te identificeren indien aanwezig, die verschijnen als ovale gevormde doorschijnende structuren in het achterste derde van het lichaam (Figuur 2A, B). Dieren die geen teelballen hebben, zijn vrouwelijk en moeten worden weggegooid.
  4. Wanneer een mannelijke larve of pop wordt gevonden en schoon is, verplaats het naar de tweede druppel media. Herhaal dit totdat 3 of 4 mannelijke larven en/of poppen zijn overgebracht naar de tweede druppel media.
  5. Werken in de tweede druppel van de media, pak een enkele mannelijke larve of pop met een paar tangen in het midden van het gebied, net voorste aan de teelballen. Gebruik het tweede paar tangen om het dier voorzichtig doormidden te scheuren.
  6. Houd het achterste uiteinde van de larve of pop naar beneden op de glazen glijbaan met een paar tangen. Begin net naast de tangen, duw naar beneden op de cuticula met behulp van de rand van de scalpel tool en beweeg de scalpel naar de cut-end van het dier. Dit zal verdrijven van het dier interne organen, waaronder de ingewanden, vetlichamen, en teelballen.
  7. Plaag voorzichtig de teelballen van de rest van de organen. De teelballen zijn heldere, ovale organen ingebed in linten van vet lichaam (Figuur 2C).
  8. Breng de teelballen een voor een naar de derde druppel media. Om dit te bereiken, steek de rand van de scalpel onder het vetlichaam, til het weefsel uit de media, en snel verplaatsen naar de derde druppel.
  9. Als alternatief, als er niet genoeg vet lichaam nog steeds aan de teelballen om met succes het weefsel op te heffen, voorzichtig overdracht van het weefsel met behulp van een glazen Pasteur pipet dat is voorbevochtigd met dissectie media.
  10. Gebruik het scherpe uiteinde van de scalpel tool om voorzichtig weg te snijden overtollig vet lichaam uit de teelballen, waardoor slechts een kleine rand van vet lichaam rond de randen(figuur 2C). Het is niet nodig om al het vetlichaam te verwijderen, en een poging om dit te doen zal waarschijnlijk resulteren in beschadiging of scheuren van de teelballen.
  11. Herhaal de bovenstaande stappen voor alle mannelijke larven op de glazen glijbaan.
  12. Ga door naar stap 3 of stap 5.

3. Montage Testes voor Live Microscopische beeldvorming

LET OP: Deze montageprocedure werd aangepast van een recent gepubliceerd protocol voor beeldvorming van Drosophila larve hersenen neuroblasten20. Aanvullende details zijn te vinden in deze referentie.

  1. Gebruik de filterspuit om een enkele druppel media van Schneider (ongeveer 30 μL) op het midden van een 50 mm gasdoorlatende kweekschotel te deponeren.
  2. Gebruik een voorbevochtigde Pasteur pipet om de bereide teelballen over te brengen naar de druppel op de gasdoorlatende schotel. De teelballen zullen over het algemeen drijven naar het oppervlak van de druppel.
  3. Gebruik het scalpelgereedschap om de teelballen voorzichtig op het gasdoorlatende membraan te duwen. Zorg ervoor dat u het gasdoorlatende membraan niet scheurt met het scherpe punt van de scalpel. Duw alle teelballen naar het midden van de druppel.
  4. Gebruik een 1 mL spuit gevuld met halocarbon olie om vier druppels olie te maken, ongeveer 30 μL per stuk, op het gas doorlatende membraan. Plaats de druppels olie rond de druppel media die de teelballen bevatten, om overeen te komen met de vier hoeken van een 22 mm glazen afdekking.
  5. Line-up van de hoeken van een 22 mm glazen coverslip met de vier druppels halocarbon olie en zachtjes lager de coverslip op de media en olie. Laat het afdekkingsformulier bezinken en laat de media die de teelballen bevatten zich tussen de druppels olie verspreiden.
  6. Verwijder overtollige media zodat het uitglijder zich op het oppervlak van de teelballen kan nestelen. Tijdens het observeren van de teelballen onder een ontleden microscoop, steek de hoek van een delicate taak veeg in de media onder de coverslip af te voeren een kleine hoeveelheid vloeistof. Wick weg genoeg media totdat de glazen coverslip maakt gewoon contact met het oppervlak van de grootste testis. Het is van cruciaal belang om niet te veel media te verwijderen en het uitglijder te ver te laten zakken, omdat dit druk uitoefent op de teelballen en ervoor zorgt dat ze scheuren (zie figuur 5).

4. Live imaging van Meiotic Spermatocyten

LET OP: Spermatocyten kunnen worden afgebeeld met behulp van een laser scannen of spinnen schijf confocale microscoop. Het systeem moet voldoende snelheid en gevoeligheid hebben om fotobleekte van fluorescerende eiwitten of fotoschade van het weefsel te voorkomen.

  1. Plaats een druppel onderdompelingsolie op de glazen afdekking net boven de teelballen. Flip over de schotel en plaats het op de microscoop fase en verplaats de microscoop doelstelling (40x of 60x) in de olie totdat het net onder de teelballen. Gebruik uitgezonden licht om een enkele testis te vinden en in beeld te brengen.
  2. Terwijl u snelle beelden vastlegt met de confocale, verplaatst u de testis om de organisatie van de cellen te onderzoeken. Het ene uiteinde van de testis zal veel kleine, dicht opelkaar gepakte cellen hebben. Dit uiteinde bevat de kiembaan stamcellen en spermatogonie. Bewegen naar het andere uiteinde van het orgaan, identificeren geleidelijk grotere cellen georganiseerd in discrete clusters of cysten. Deze grote cellen zijn de spermatocyten (figuur 3A).
  3. Als beeldvorming GFP-tubulin, identificeren spermatocyten die meiose zal beginnen binnen 30-60 min door de aanwezigheid van twee heldere microtubuli asters (dat wil zeggen, centrosomen) gelegen in de cortex van de cel (Figuur 3B, C).
  4. Zodra een cyste van meiotische spermatocyten is geïdentificeerd, het opzetten van acquisitie parameters om z-stapels beelden vast te leggen na verloop van tijd. Typisch, verwerving van 15-20 beelden verdeeld 1,5 μm uit elkaar in de z-dimensie is voldoende om het volledige volume van verschillende spermatocyten binnen dezelfde cyste vast te leggen.
  5. Verwerf volledige z-stacks om de 2 min als beeldvorming van de gehele eerste meiotische divisie, die duurt ongeveer 1,5 uur. Het is mogelijk om snellere acquisitietarieven te gebruiken, vooral als alleen een specifieke gebeurtenis van meiose moet worden geanalyseerd. Zorg er echter voor dat het geen fotobleekte of fotoschade veroorzaakt als gevolg van herhaalde blootstelling van het monster aan laserexcitatie.
  6. Gebruik een continu, automatisch focuscontrolesysteem om brandpuntsdrift over de lange tijdsloop van acquisitie te voorkomen. Temperatuurregeling van het monster op het microscoopstadium is over het algemeen niet nodig, uitgaande van een kamertemperatuur van ongeveer 22-23 °C. Als er temperatuurregeling beschikbaar is, houdt u het monster op 25 °C op het microscoopstadium.
  7. Als er geen meiotische spermatocyten worden gevonden, bewaar het monster dan enkele uren of 's nachts in een couveuse van 25 °C en afbeelding opnieuw.

5. Fixatie en immunostaining

  1. Gebruik vanaf stap 2.10 een glazen Pasteur pipet om te testen over te brengen naar een put in een 9-well glazen ontleedschaal met 0,5 mL van 8% paraformaldehyde in PBSTx (fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,3% Triton X-100). Zorg ervoor dat de teelballen op de bodem van de schotel liggen.
    LET OP: Paraformaldehyde is giftig en moet worden behandeld met handschoenen in een rookkap.
  2. Bevestig de teelballen gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
  3. Breng de teelballen over naar een put met 0,5 mL PBSTx. Was gedurende 5 min met zachte agitatie. Herhaal de wasstap in nieuwe putten met verse PBSTx nog twee keer.
  4. Verdun het primaire antilichaam tot de gewenste concentratie in 0,5 mL PBSTx met 5% runderserumalbumine (BSA) in een microcentrifugebuis van 1,5 mL. Breng tegoeden van de 9-well glasontleden naar de buis van verdund primair antilichaam en incubeer 's nachts bij 4 °C met zachte schommeling of noot.
  5. Was de teelballen in 0,5 mL PBSTx gedurende 5 min in een put van een 9-well glazen ontleedschaal. Herhaal de wasstap nog twee keer met verse PBSTx.
  6. Verdun secundair antilichaam in 250 μL PBSTx met 5% BSA en bedien in een schone put van een 9-well glazen ontleedschaal. Voeg indien gewenst DAPI toe aan het dna te bevlekken. Breng tegoeden naar de put met secundair antilichaam, dek af met plastic folie en inhet donker met zachte agitatie gedurende 4 uur bij kamertemperatuur.
  7. Breng de teelballen over naar een schone put gevuld met 0,5 mL PBSTx. Was twee keer met verse PBSTx gedurende 5 min en een derde keer gedurende 30 min.

6. Montage vaste teelballen

  1. Breng de teelballen van de laatste wasbeurt over op een glazen microscopieplaat met behulp van een Pasteur pipet. Gebruik indien nodig de rand van het scalpelgereedschap om de teelballen op het oppervlak van de dia naar beneden te duwen.
  2. Gebruik de hoek van een delicate taak af te vegen om afvoer van overtollige vloeistof uit de teelballen. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof.
  3. Breng een 30-50 μL-val van microscopiemontagemedium aan op de teelballen.
  4. Plaats een afdekkingsslip van 22 mm op de val van het bevestigingsmedium en laat het afdekkingsformulier zich nestellen en het montagemedium zich onder het afdekkingsformulier verspreiden. Breng indien nodig een zachte druk uit op het uitglijder om overtollig montagemedium uit te persen en laat het uitglijder op het oppervlak van de teelballen rusten.
  5. Gebruik nagellak om de randen van de coverslip te verzegelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Wanneer dit protocol met succes wordt uitgevoerd, blijven teelballen volledig intact voor beeldvorming door confocale microscopie of andere fluorescentiemicroscopiemethoden. Zoals te zien in figuur 3A, wordt de cellulaire organisatie van de teelballen bewaard en is de progressie van celdifferentiatie van het ene uiteinde van de testis naar de andere, waaronder spermatogonie, spermatocyten en haploid-spermatids zichtbaar. GFP-tubulin is een nuttige marker voor het identificeren van delende sp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben een protocol beschreven voor de voorbereiding van larve of vroege pupal Drosophila-teelballen, geoptimaliseerd voor langdurige, live beeldvorming van spermatocytenceldeling. Dit is een krachtige methode voor de analyse van celdeling in de fysiologische context van intact weefsel. De kracht van deze methode wordt verder uitgebreid in combinatie met Drosophila genetische hulpmiddelen, zoals specifieke genmutaties, weefselspecifieke RNAi-gemedieerde onderdrukking en fluorescerend gelabelde eiwit-...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Defensie start-up fondsen aan J.T.S.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5" Dissecting ProbeFisher08-965-A
5.75" Glass Pasteur PipetFisher13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA)FisherBP9703-100
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11252-20Rechte pincetten met fijne uiteinden
Frosted Microscope SlidesFisher12-544-2Glijmiddel voor het bevestigen van vast weefsel, met bevroren schrijfoppervlak
Halocarbon oil 700SigmaH8898-100 mL
Lumox Dish 50SarstedtSAR946077410Gasdoorlatende weefselkweekschaal
Microscope Cover GlassFisher12-541-B22 mm x 22 mm, #1.5 glazen dekglas
Minutien PinsFine Science Tools26002-15Insectenpins gebruikt om een scalpel te maken
Nickel Plated Pin HolderFine Science Tools26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM GradeElectron Microsocopy Sciences15714
Plan Beveled Edge Microscope SlidesFisher12-549-5Glijmiddel voor dissecties
PYREX Spot PlatesFisher13-748B9-wels glazen dissectieschaal
Schneider's Drosophila mediumFisher21720-024
Syringe Filter, 0.22 µmEMD MilliporeSLGS033SB
Triton X-100FisherBP151-500
VectashieldVector LabsH-1000Montagemiddel voor microscopie

Referenties

  1. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
  2. Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).
  3. Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).
  4. Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).
  5. Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14 (4), 111(2013).
  6. Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
  7. Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69 (11), Hoboken, N.J. 869-881 (2012).
  8. Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 12456(2019).
  9. Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).
  10. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2 (1), 8(2004).
  11. Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5 (8), (2015).
  12. Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), San Diego, Calif. 218-227 (2014).
  13. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. 71-147 (1993).
  14. Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10 (12), 1001460(2012).
  15. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
  16. Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).
  17. Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
  18. Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058(2014).
  19. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
  20. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  21. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).
  22. Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).
  23. Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
  24. Tates, A. D. Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).
  25. Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868(2014).
  26. Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).
  27. Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).
  28. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).
  29. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Drosophila-testeslive imagingtime-lapse microscopiedissectie van de testisspermatocytanalyseconfocale microscopiefluorescentiemicroscopieweefselpreparatiegenetische tools
Voorbereiding van Drosophila Larval en Pupal Testes voor analyse van celafdeling in levend, intact weefsel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.