Extracellulaire multi-unit opname van de olfactorische zenuw van Teleosts

Summary

Extracellulaire multi-unit opname van de reukzenuw is een gevoelige, robuuste en reproduceerbare methode voor het beoordelen van reukgevoeligheid bij zeevissen. Het registreert primaire zintuiglijke input en is onafhankelijk van extern zoutgehalte.

Abstract

Recente studies hebben aangetoond dat verzuring van de oceaan reukgedreven gedrag bij vissen beïnvloedt. Dit kan deels te wijten zijn aan een vermindering van de reukgevoeligheid in hoog PCO₂/laag pH-water. Om de effecten van verzuring van de oceaan te beoordelen, of reukgevoeligheid bij zeevissen in het algemeen, stellen we voor dat extracellulaire multi-unit opname van de reukzenuw de methode van keuze is. Hoewel invasief, het is gevoelig, robuust, reproduceerbaar en onafhankelijk van externe zoutgehalte (in tegenstelling tot de elektro-olfactogram [EOG], bijvoorbeeld). Bovendien registreert het een primaire zintuiglijke input in het CZS, voorafgaand aan een centrale verwerking. We tonen aan dat deze methode een vermindering van reukgevoeligheid kan laten zien die zowel tijdelijk als geurafhankelijk is, met behulp van een reeks aminozuren om concentratie-responscurven te construeren en de detectiedrempels te berekenen.

Introduction

Vissen zijn sterk afhankelijk van olfaction voor vele aspecten van hun leven, waaronder het vinden van voedsel, het vermijden van roofdieren, het beoordelen van potentiële partners en migratie, onder andere^1,2,3. Daarom, het beoordelen van reukgevoeligheid bij vissen (Wat ruiken ze? Hoe gevoelig zijn ze voor deze verbindingen?) is van vitaal belang om deze processen volledig te begrijpen. Bovendien kunnen antropogene effecten op het milieu, zoals verzuring en vervuiling van de oceaan, ingrijpende gevolgen hebben voor het reuksysteem, zelfs op subletale niveaus, omdat het noodzakelijkerwijs in nauw contact staat met het omringende water⁴. In vivo elektrofysiologie is de experimentele benadering van keuze om de reukgevoeligheid bij vissen te beoordelen. Er zijn drie belangrijke technieken beschikbaar: het elektro-olfactogram (EOG), het elektro-encefalogram (EEG) dat is opgenomen uit de olfactorische bol, en multi-unit opname van de reukzenuw⁵.

De EOG is de meest gebruikte van deze drie⁶. Het is een gelijkstroom (DC) veld potentieel geregistreerd boven de olfactorische epitheel en wordt verondersteld om de samengevat generator potentieel van die olfactorische receptor neuronen (ORN' s) reageren op een bepaalde geur. Echter, als het wordt geregistreerd in het water, in plaats van in de vis, de amplitude van de reactie is niet alleen afhankelijk van het signaal gegenereerd door de vis, maar ook van de geleidbaarheid van het omringende water; hoe hoger de geleidbaarheid (of hoe lager de weerstand), hoe lager de amplitude zal zijn. Dit kan betekenen dat de EOG een minder gevoelige methode is in zeewater dan zoet water⁷.

De EEG opgenomen uit de olfactorische bol wordt ook veel gebruikt in het onderzoek naar olfactie bij vissen. De olfactorische bol is echter het eerste verwerkingscentrum voor olfactorische sensorische input⁸; het is zeer georganiseerd in glomeruli, en bijgevolg hangt de opgenomen reactie sterk af van de positie van de opnameelektroden. Zo wordt de input van ORN's die aminozuren detecteren verwerkt door glomeruli in het laterale gebied van de reukbollen , terwijl die van chemische stoffen die van conspecificeerde afgeleid zijn, naar het mediale gebied^9,10,11,12is gericht . Feromonale input kan worden gericht op sterk gelokaliseerde glomeruli binnen de olfactorische bol. Afhankelijk van de anatomie van de soort in kwestie, is de ideale opnamepositie voor een bepaalde geurstof mogelijk niet gemakkelijk toegankelijk.

Multi-unit opname van de reukzenuw omzeilt de belangrijkste problemen met de EOG en EEG hierboven beschreven. Als het registreert acties potentials doorgeven van de axonen van de ORN's van het epitheel naar de lamp, het is een primaire zintuiglijke signaal. En aangezien het in de vissen wordt geregistreerd, is de amplitude van reactie onafhankelijk van extern zoutgehalte. Toch heeft het natuurlijk een aantal nadelen. Ten eerste, afhankelijk van de anatomie van de soort, is een uitgebreidere operatie nodig om de reukzenuw bloot te leggen dan voor de EOG. Ten tweede, omdat het signaal kleiner is dan de EOG, vereist het iets geavanceerder, en dus duur, apparatuur. Een algemene beschrijving van andere experimentele benaderingen wordt gegeven door John Caprio⁵. Het doel van dit artikel is om te schetsen hoe extracellulaire multi-unit reacties van de reukzenuw van de zeebraam(Sparus aurata) in vivo te identificeren om aminozuur geurstoffen als een voorbeeld van deze techniek, en hoe te identificeren, en te overwinnen, enkele van de meest voorkomende problemen ondervonden in een dergelijk experiment.

Protocol

Het onderhoud en de experimenten van dieren werden uitgevoerd in gecertificeerde experimentele faciliteiten en volgden de Portugese nationale wetgeving (DL 113/2013) onder een "groep-1"-licentie van het directoraat-generaal Veterinaire, ministerie van Landbouw, Plattelandsontwikkeling en Visserij van Portugal. Aangezien dit protocol betrekking heeft op de behandeling van dieren, moet het worden goedgekeurd door de lokale en/of nationale instantie die het welzijn van dieren die in wetenschappelijke experimenten worden gebruikt, regelt, daarnaast moeten onderzoekers over de juiste opleiding en vergunningen beschikken om dergelijke procedures uit te voeren.

1. Stimulusvoorbereiding

OPMERKING: De meeste vissen hebben een zeer gevoelig reuksysteem, dus grote zorg moet worden genomen bij de voorbereiding van de reukstimuli om te worden gebruikt in het experiment. Het glaswerk dat wordt gebruikt om de stimuli te vormen, moet worden gewassen in 5% bleekmiddel (natriumhypochloriet), grondig gespoeld met leidingwater en gedroogd. Onmiddellijk voor het gebruik spoel het glaswerk grondig met zeewater (hetzelfde water gebruikt om de stimulus verdunningen te maken). Zorg ervoor dat geen van dit water in contact komt met blote huid.

1. Maak 100 mL van 10^-2 M L-glutamine, L-leucine en L-serine; bewaar 1 mL aliquots van elk bij -20 °C tot gebruik.
2. Op de dag van het experiment, bereid je voor op deze aliquots, 10^-3 M tot 10^-7 M oplossingen (in stappen van x10 verdunning) met behulp van zowel controle als een hoog CO₂ zeewater.
   LET OP: L-serine (10^-3 M) zal worden gebruikt als een positieve controle, of standaard. Water dat wordt gebruikt om de verdunningen van de stimuli te vormen en op precies dezelfde manier behandeld als de stimuli, maar zonder toevoeging van een geur, zal worden gebruikt als de negatieve controle of leeg.

2. Voorbereiding van de controle en hoog CO_2-water

1. Bereid controlewater voor door 1 L met houtskool gefilterd zeewater te verzamelen.
   1. Controleer met behulp van een pH-sonde de pH; het moet rond 8,2. Zo niet, bel dan met atmosferische lucht totdat deze pH is bereikt.
   2. Met behulp van een alkalinity titrator meet de alkaliteit van het water.
   3. Meet de watertemperatuur en het zoutgehalte.
2. Bereid hoog CO_2-water voor door 1 L zeewater te filteren en bel vervolgens CO₂ tot de gewenste pH is bereikt.
   1. Controleer met behulp van een pH-sonde de pH; het moet rond 7,7.
   2. Met behulp van een alkaliniteit titrator, meet de alkaliteit van het water.
   3. Meet de watertemperatuur en het zoutgehalte.
3. Bepaal de CO_2-druk in zowel controle als hoog CO_2-water met behulp van een software die is ontworpen om CO_2-parameters in water te berekenen (bijvoorbeeld CO2Calc-software¹³).
   1. Voeg in het invoervenster de waarden van waterpH, temperatuur, zoutgehalte en totale alkaliteit(figuur 1)toe.
   2. Selecteer de constanten, eenheden en schalen (zie de aanbevolen waarden in figuur 2).
   3. Druk op het knopproces om de CO_2-druk te bepalen.
      OPMERKING: Figuur 3 toont een voorbeeld van een resultaatblad.

3. Bereiding van de vis

LET OP: In dit protocol wordt een zeebream van 200−400 g gebruikt.

1. Verdoven de vis byimmersion in belucht natuurlijk zeewater met MS222 (ethyl-3-aminobenzoaat methaanzfonaat zout). Wanneer de respons op een staartsnetje is gestopt, injecteer in de flankspier de neuromusculaire blokker gallamine triethiodide (10 mg·kg^-1 in fysiologische zoutoplossing).
   OPMERKING: De concentratie van de gebruikte verdoving varieert per soort; voor een zeebream van 200−400 g, gebruik 200 mg· L^-1 gebufferd met 400 mg· L^-1 NaHCO₃.
2. Plaats de verdoofde vis op een gedempte steun. De exacte vorm en grootte zijn afhankelijk van de modelsoort; voor zeebream (200−400 g), gebruik maken van een gewatteerde V-vormige ondersteuning, gemaakt in eigen huis.
3. Plaats een siliciumbuis (diameter = 10 mm) in de mond, sluit de buis aan op een dompelpomp in een reservoir van verdovingsbevattend, belucht zeewater en pomp water over de kieuwen op ~100 mL·min^-1·kg^-1.
   LET OP: De grootte van de gebruikte siliciumbuis is afhankelijk van de grootte van de vis.
4. Steek de aardingspen in de flankspier en sluit deze aan op het hoofdpodium van de versterker).
5. Bedek de vis met vochtige doek (of papieren handdoek) met alleen het hoofd blootgesteld, ervoor te zorgen dat de bekleding niet de uitgang van water uit de kieuwen belemmert.
   LET OP: De ogen kunnen worden bedekt met stukjes vochtig papier / doek of zwart plastic.
6. Plaats de buis van het stimulus-leveringssysteem, d.w.z., de glasbuis die aan een levering van achtergrondzeewater wordt aangesloten, in het neusgat.
   OPMERKING: Micro-hematocrietbuizen kunnen worden gebruikt (lengte = 75 mm, ID = 1,15 mm, OD = 1,55 mm); deze kunnen worden getrokken om een fijner punt op een elektrode trekker voor gebruik met kleinere vissen. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het olfactorische epitheel nat wordt gehouden tijdens de operatie (hieronder beschreven).
7. Stel de reukzenuwen bloot door de huid en het bot van de schedel tussen de ogen te verwijderen (de reukzenuwen lopen meestal samen tussen de ogen) met behulp van een tandheelkundig (idealiter) of hobby (bijvoorbeeld Dremel) boor of juwelierspoetser (met tandboorbits) onder een ontledende microscoop (in een Kooi van Faraday).
   1. In de zeebraam, verwijder het deel van de schedel direct boven de ogen, met een cirkelzaag, van slechts voorste tot de ogen om gewoon achterste aan hen. Verwijder vervolgens, met behulp van een boorbit, het bot tussen de ogen; de reukzenuwen liggen tussen de ogen.
8. Zodra voldoende bot is gewist, verwijder het vet en bindweefsel boven de zenuwen met behulp van fijne tangen; zorg ervoor dat de zenuwen niet beschadigen of bloedvaten doorboren.
   OPMERKING: Ervaring zal helpen om de dissectie te verfijnen; hoe kleiner de dissectie, hoe stabieler de voorbereiding zal zijn. Er moet echter voldoende weefsel worden geruimd; voor de onervaren, wanneer de reuklampen zijn gewoon zichtbaar, duidelijk iets meer voorzinig om het deel van de zenuwen bloot als ze toetreden tot de bollen om de juiste positionering van de elektroden mogelijk te maken.
9. Reinig de elektroden vóór gebruik door ze aan te sluiten op een negatieve pool van een 3V dc-bron (bijvoorbeeld twee AA-batterijen in serie) en de punt in fysiologische zoutoplossing (of zeewater verdund 1:3 in zoet water) voor 20−30 s; een gestage stroom van kleine belletjes moet worden gezien vanuit de tip.
10. Zodra de reukzenuwen zijn blootgesteld, steek de opname-elektroden (gehouden op micro-manipulatoren) in een positie die een maximale reactie op de standaard geeft (bijvoorbeeld 10^-3 M L-serine), en een minimale reactie op de blanco. Gebruik met paryleen gecoate wolfraamelektroden(Tabel van materialen)die zijn aangesloten op het hoofdstadium van een wisselstroom (AC) voorversterker.
    OPMERKING: In de zeebran den, de sterkste reacties op aminozuren worden meestal gezien met de elektroden geplaatst in de zijzijde van de zenuw, dicht bij waar het sluit zich aan bij de reukbol. Dit geldt misschien voor andere soorten, omdat de glomerulaire organisatie van de bol in grote lijnen vergelijkbaar is bij soorten. Ervaring is echter altijd de beste leraar.

4. Elektrofysiologische opname

OPMERKING: Zoals bij de meeste elektrofysiologie moet multi-unit opname plaatsvinden in een Kooi van Faraday. Extracellulaire opname vereist echter meestal geen antitrillingstafel; de meeste beweging zal afkomstig zijn van de vis. Niettemin is een sterke, stabiele tafel vereist met een metalen oppervlak om de magnetische basissen van de micro-manipulatorstandaards te beveiligen.

1. Stel een stimulusleveringssysteem in om snel van schoon achtergrondwater naar stimulushoudend water te kunnen overschakelen, bijvoorbeeld door gebruik te maken van een met solenoïde bediende driewegklep. Sluit de gemeenschappelijke uitlaat aan op de buis die water naar de olfactorische rozet voert en plaats de ene lijn in een zeewaterreservoir en de andere in de testoplossing.
   OPMERKING: Wanneer de klep wordt geschakeld (door het passeren van gelijkstroom), schakelt de waterstroom van achtergrondwater naar dat met de geurstof. De stimulans moet lang genoeg worden gegeven om een duidelijke piek in de geïntegreerde respons te zien, gevolgd door een periode van accommodatie; de tijd die in het huidige protocol wordt gebruikt is 4 s, maar een langere tijd kan nodig zijn, afhankelijk van de soort.
2. Sluit de klepbestuurder aan op de trigger van een analoog-digitale converter (bijvoorbeeld Digidata); wanneer de klep wordt overgeschakeld van achtergrond naar stimulushoudende lijn, zal dit de registratie van de gegevens starten. Configureer de software om te beginnen met opnemen bij de triggergebeurtenis en ga gedurende een vooraf bepaalde periode (bijvoorbeeld 10 s) verder.
   OPMERKING: Tien seconden moeten voldoende zijn, maar dit kan worden ingekort of verlengd, afhankelijk van de experimentele vraag.
3. Controleer de stabiliteit van het preparaat door te testen (het registreren en meten van de amplitude van de geïntegreerde respons) herhaaldelijk met de standaard, 10^-3 M L-serine in dit geval, en waardoor 1 min te verstrijkt tussen opeenvolgende stimuli.
   OPMERKING: Afhankelijk van de soorten en geurstoffen moeten de reacties een amplitude hebben binnen 10% van elkaar (als vuistregel), en moeten ze een snel begin hebben, de maximale activiteit verhogen en terugkeren naar de uitgangswaarde nadat de stimulus afwezig is(figuur 4).
4. Nota van de reukzenzenreacties op aminozuren in controle zeewater (van de laagste tot de hoogste concentratie) en laat 1 min verstrijken tussen opeenvolgende stimuli.
   LET OP: Het is mogelijk dat voor sommige soorten en/of sommige geurstoffen meer tijd nodig is. Maar voor aminozuren en zeebraam is 1 min voldoende.
5. Noteer de respons op 10^-3 M serine en een controle water blanco oplossing.
6. Verander het achtergrondwater van het₂ zeewater in hoog CO 2-zeewater, door de achtergrondlijn in de fles te plaatsen met een hoog CO_2-zeewater.
   OPMERKING: Het is raadzaam om een andere hematocrietbuis (of gelijkwaardig) in het einde van de stimulus en achtergrondlijnen te plaatsen om te voorkomen dat het water wordt aangeraakt en ervoor te zorgen dat het uiteinde van de buis in het water blijft.
7. Voorafgaand aan het testen van de reactie van de reukzenuw op aminozuren in hoog CO₂ zeewater, conditioneert u het reukeptheel met hoog CO_2-water door het hoge CO_2-water gedurende een paar minuten over het reukeptheel te volgen.
   LET OP: De ervaring heeft geleerd dat voor zeebrasem 5 min voldoende is.
8. Nota van de reukzenzenreacties op aminozuren in hoog CO₂ zeewater (van de laagste tot de hoogste concentratie).
9. Nota van de respons op een hoge CO₂ water blanco oplossing.
10. Noteer de respons op 10^-3 M serine en een controle water blanco oplossing.
    OPMERKING: Het ruwe signaal (zenuwactiviteit) moet worden gefilterd (low pass rond 2.000−5.000 Hz, high pass 50−300 Hz) en doorgegeven aan een analoog-digitale converter(Table of Materials). Voor een eenvoudigere kwantificering van zenuwactiviteit kan het ruwe signaal ook worden geïntegreerd met behulp van een lekkende integrator(Tabel van Materialen)en worden doorgegeven aan de analoog-digitale converter, en van daaruit zowel ruwe als geïntegreerde signalen naar een computer met de juiste software (bijvoorbeeld Axoscope).

5. Gegevensanalyse

1. Trek de amplitude van de geïntegreerde respons op de blanco (in mV) af van de amplitude van de geïntegreerde reacties op alle stimuli.
2. Normaliseer de reacties op stimuli door de amplitude van de vorige reactie op de norm te verdelen (10^-3 M serine); dit vermindert de variabiliteit tussen en binnen vissen.
3. Bereken de detectiedrempels door lineaire regressie van de concentratieresponscurven (op een semi-logaritmische plot), volgens het formulelogboek(N + 1,5) = eenlog C + B, waarbij C de molaire concentratie is, N de genormaliseerde responsamplitude en a en b constanten^7,14.
   OPMERKING: De detectiedrempel is dan de waarde voor x waar y = 0,1761 (d.w.z. log 1.5; N = 0); de concentratie waarboven een reactie zal worden waarboven een reactie zal worden waarboven een reactie zal worden gezien (d.w.z. de vis kan het ruiken). Sommige geurstoffen roepen sigmoïdale concentratieresponscurven op wanneer ze semilogarimisch worden uitgezet (bijvoorbeeld calcium^15,16; in dit geval kunnen de genormaliseerde gegevens worden gemonteerd op een heuvelperceel met drie parameters die de maximale responsamplitude en de EG₅₀ (d.w.z. [geurstof] geeft die een half-maximale respons geeft; ook een zekere mate van gevoeligheid).
4. Vergelijk de detectiedrempels en/of de maximale responsamplitude en de EG₅₀ van stimuli getest in controlewater en die getest in hoog CO_2-water.

Results

Een typische reactie op de positieve controle (10^-3 M L-serine; Figuur 4A)en negatieve controle (blanco; Figuur 4B) opgenomen uit de reukzenuw van een zeebream is opgenomen in figuur 4. In aanwezigheid van de stimulus (zwarte horizontale balk; in de olfactorische holte, in contact met het olfactorische epitheel), noteer de snelle toename van de activiteit (weerspiegeld in de opwaartse afbuiging van het geïntegreerde signaal) tot een piek binnen ongeveer een seconde van het begin van de stimulus, gevolgd door een periode van accommodatie (terwijl de stimulus nog steeds aanwezig is), en een terugkeer naar basisactiviteit zodra de stimulus is beëindigd. De absolute amplitude van de respons is sterk afhankelijk van de elektrodepositie; als een lage amplituderespons wordt geregistreerd, probeer dan de elektrodeposities te wijzigen. Een tragere stijging van de piekactiviteit kan te wijten zijn aan de buis die het stimulushoudende water naar het reukeptheel draagt dat te ver van het epitheel wordt geplaatst; probeer de neusbuis dichter bij (maar niet aanraken) het epitheel te verplaatsen. Merk op dat, in tegenstelling, de blanco roept weinig of geen reactie. Een significante positieve reactie (d.w.z. toename van de activiteit) op de blanco kan duiden op verontreiniging van het water dat wordt gebruikt om de verdunningen van de stimuli te maken; het maken van verse verdunningen met schoon water (en glaswerk) moet dit oplossen. Zo niet, dan kan een grondigere reiniging van het watersysteem (inclusief actieve koolfilters) noodzakelijk zijn. Een negatieve respons (d.w.z. afname van de activiteit) kan wijzen op een lichte verandering in de doorstroming wanneer de klep wordt geschakeld als gevolg van bijvoorbeeld een verstopping in de klep.

Een typische concentratieresponscurve (halflogisch uitgezet), in dit geval naar L-leucine (10^-7 M tot 10^-3 M), is te zien in figuur 5A. Merk op dat toenemende concentraties van de geurstof roepen steeds grotere toename van de activiteit, en dus in de amplitude van de geïntegreerde reacties. Een plot van de genormaliseerde gegevens en de bijbehorende lineaire regressie wordt weergegeven in figuur 5B. De geschatte detectiedrempel kan worden berekend op basis van de waarde van x wanneer y = 0,1761 (d.w.z. log1.5; waar N = 0). In dit geval is deze waarde -7,48; dat wil zeggen dat de berekende drempel voor L-leucine in deze vis 10^-7,48 M bedraagt. De exponent α kan op dezelfde manier worden geschat op basis van lineaire regressie van de genormaliseerde gegevens op een log-log plot; logN = αlog[geurstof] + constante. De factor γ geeft vervolgens de toename van de geurconcentratie die nodig is om de responsamplitude met één logeenheid te verhogen; dat wil zeggen, het is een schatting van de steilheid van de concentratie-respons curve¹⁷. In dit voorbeeld α = 0,277 en γ = 3,61; daarom moet de stimulusconcentratie met 10^3,61-voudige (4.074-voudig) worden verhoogd om de responsamplitude te verhogen (d.w.z. één log-eenheid; log10 = 1).

Een typische sigmoïdale concentratieresponscurve (figuur 6A) wanneer halflogaritisch, in dit geval aan L-glutamine, wordt uitgezet , wordt weergegeven in figuur 6B. Een vergelijkbare concentratieafhankelijke toename van de responsamplitude wordt gezien; bij de hogere concentraties wordt deze stijging echter minder, zodat de responsamplitude een maximum(N_max)bereikt. Hierdoor kunnen de gegevens worden gemonteerd op een drie parameter Hill-vergelijking:

Op deze manier kunnen de EC₅₀ (de geurconcentratie waarbij een maximale respons van 50% wordt opgeroepen) en de Hill co-efficiënt (een maat voor de steilheid van de helling van het lineaire deel van de sigmoïdale curve) worden berekend.

Figuur 1: Software screenshot met het invoervenster van het programma CO2Calc. Gemarkeerd (rode vakken) zijn de velden die nodig zijn voor de berekening van de parameter Carbonaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Softwarescreenshot met het invoervenster voor de juiste constanten, eenheden en schalen. De getoonde waarden worden aanbevolen voor de omstandigheden waaronder de beschreven experimenten zijn uitgevoerd; ze kunnen veranderen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Software screenshot met de resultaten venster. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Typische multi-unit reacties opgenomen extracellulair van de reukzenuw van zeebrasem in vivo in reactie op 10^-3 M L-serine (A) en blank (B). Bovenste sporen tonen de geïntegreerde reacties en lagere sporen tonen het ruwe (zenuw)signaal. Stimuli werden toegepast op het olfactorische epitheel (horizontale staven). Let op de snelle toename van de activiteit tijdens de 1 s van de blootstelling, een piek in activiteit, gevolgd door een periode van accommodatie (terwijl de geurstof nog steeds werd geleverd aan het epitheel) en een terugkeer naar basislijnniveaus zodra de geurige levering is gestopt. Weinig of geen toename van de activiteit wordt gezien na stimulatie met water behandeld op dezelfde manier als geurige verdunningen, met uitzondering van het toevoegen van een geur (leeg). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Typische concentratieresponscurve voor L-leucine die extracellulair werd geregistreerd uit de reukzenuw in vivo. (A) Naarmate de concentratie L-leucine op het olfactorische epitheel (horizontale staven) toeneemt van 10^-7 M tot 10^-3 M, wordt een gelijktijdige toename van de activiteit in de zenuw waargenomen. Bovenste sporen tonen de geïntegreerde reacties en lagere sporen tonen het ruwe (zenuw)signaal. (B) Lineaire regressie (R² = 0,97) van genormaliseerde gegevens die semilogaritisch worden uitgezet om de detectiedrempel te berekenen als de waarde voor log[L-leucine] bij logboek(N + 1,5) = 0,1761 (d.w.z. waar N = 0). In dit voorbeeld is deze waarde -7,48; de geschatte detectiedrempel voor L-leucine in deze vis is dus 10^-7,48 M. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Typische concentratieresponscurve voor L-glutamine die extracellulair werd geregistreerd uit de reukzenuw in vivo. (A) Naarmate de concentratie L-glutamine die op het olfactorische epitheel (horizontale staven) wordt toegepast, toeneemt van 10^-7 M tot 10^-3 M, wordt een gelijktijdige toename van de activiteit in de zenuw waargenomen. Bovenste sporen tonen de geïntegreerde reacties en lagere sporen tonen het ruwe (zenuw)signaal. (B) Semi-logaritmische plot van genormaliseerde gegevens gemonteerd op een hill-vergelijking met drie parameters (R² = 0,99). Voor dit voorbeeld is de berekende EC₅₀ = 3,11 μM en de Hill co-efficiënt = 0,565). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

De huidige studie beschrijft het gebruik van multi-unit (extracellulaire) opname van de reukzenuw van de zeebraam (S. aurata), een mariene spaarzaam van groot belang in de aquacultuur. Deze experimentele aanpak kan echter in grote lijnen worden toegepast op andere vissen; de operatie en exacte plaatsing van elektroden zal duidelijk afhangen van de anatomie van het reuksysteem, en de keuze en concentratie van verdoving kan afhangen van de onderzochte soorten. Bijvoorbeeld, de reukzenuw van de goudvis (Carassius auratus) is kort; in dit geval zou het opnemen van de EEG van de reuklamp gemakkelijker zijn. De keuze van geurstof kan ook afhangen, tot op zekere hoogte, van de soort. De huidige studie gebruikte aminozuren. Voor zover de auteurs weten, hebben alle tot nu toe onderzochte vissoorten reukgevoeligheid voor aminozuren^1,18. Deze gevoeligheid is betrokken is diverse processen zoals voedsel locatie, chemische communicatie en erkenning van natale wateren^{19,20,21,22,23}. De gevoeligheden van verschillende soorten zijn echter in grote lijnen vrij gelijkaardig en zijn niet afhankelijk van levensstijl of habitat. Ze zijn ook goed gedefinieerde moleculen en zijn goedkoop en gemakkelijk beschikbaar. Deze redenen maken ze ideaal voor teststimuli voor studies over olfactie bij vissen, met name die die onderzoek doen naar de effecten van antropogene stoornissen (bijvoorbeeld verzuring of vervuiling), waarbij resultaten gemakkelijk kunnen worden vergeleken tussen soorten²⁴.

Afhankelijk van de betrokken soort kunnen de preparaten voor multi-unit opname enkele uren stabiel blijven; de amplitude van de respons op de interne norm^(10-3 M L-serine in de huidige studie) mag niet meer dan 10% verschillen tussen opeenvolgende tests. Elke significante afwijking van deze vuistregel kan te wijten zijn aan: i) beweging van de vissen, en dus verplaatsing van de elektroden en/of neusbuis; ii) verontreiniging van het water, bijvoorbeeld door in contact te komen met de handen van de onderzoeker (vooral als lagere concentraties van een bepaalde geurstof grotere reacties geven dan hogere concentraties); iii) verslechtering van de gezondheid van het preparaat). In het geval i) moet de vis worden gecontroleerd op bewogen bewogen vis; als dat zo is, herpositioneren, en voeg meer verdoving aan het water en / of geef een andere dosis gallamine triethiodide. Laat 5 min en hertest de standaard. Als de respons nog kleiner is, herpositioneren de elektroden en/of neusbuis totdat een voldoende grote respons is geregistreerd. In het geval (ii), gewoon remake een verse verdunning serie van de geur, met behulp van schoon glaswerk en water. Controleer in het geval (iii) of de waterstroom over de kieuwen van de vis voldoende is, of het water over de kieuwen stroomt (d.w.z. via de opercula, in plaats van de mond), en het water is goed bespeed. Verschillende vissoorten hebben een zeer verschillende temperatuurvoorkeur; ervoor te zorgen dat de temperatuur van het laboratorium (en dat van het water dat in contact komt met de vis) zo dicht mogelijk bij de temperatuur ligt dat de vissen op de temperatuur worden gehouden. Zorg er ook voor dat de vissen niet gestrest zijn en vermijd het verplaatsen ervan (zelfs van de ene tank naar de andere) gedurende ten minste een week voorafgaand aan de opname. Elektrisch lawaai is natuurlijk de vloek van het leven van een elektrofysioloog; echter, het huidige artikel is niet het juiste medium om te bespreken hoe te overwinnen / te verminderen. Niettemin is 'The Axon Guide' (gratis beschikbaar als pdf te downloaden via de website van de fabrikant) een bron van praktisch advies over geluidsminima. Zodra een grote, stabiele respons wordt opgeroepen door de standaard stimulus, en een concentratie-serie geeft een concentratie-afhankelijke toename van amplitude, met een minimale reactie op de blanco, opname reacties op test stimuli kunnen beginnen. Sommige auteurs geven dezelfde stimulus drie keer, en berekenen de rekenkundige gemiddelde voor latere data-analyse. Dit zijn echter technische replica's, en deze aanpak zal de tijd die een opnamesessie duurt met drie keer verhogen. De huidige auteurs geven de voorkeur aan een bepaalde geurstof een keer te testen, maar altijd een deel van een concentratie-respons curve. Dit maakt niet alleen de berekening van de detectiedrempel of EC₅₀ (zoals beschreven) mogelijk, maar zorgt er ook voor dat concentraties die dicht bij die liggen die de vis in zijn natuurlijke omgeving zou ervaren, worden getest (dit is niet altijd bekend). Bovendien zijn eventuele uitschieters, bijvoorbeeld als gevolg van besmetting, gemakkelijker te herkennen; deze kunnen vervolgens worden herhaald met behulp van een vers gemaakt monster indien nodig.

Multi-unit opname van de reukzenuw kan invasief zijn, maar het is gevoeliger dan de EOG wanneer opgenomen in zeewater^7,omdat het onafhankelijk is van het externe zoutgehalte. Het kan daarom worden gebruikt om de geurgevoeligheid voor geurstoffen, zoals calcium en natrium, te beoordelen, veranderingen in de concentraties waarvan ook de geleidbaarheid en bijgevolg geregistreerde spanningen¹⁵zouden beïnvloeden . Als een schatting van het aantal ORN's dat reageert op een bepaalde geur (d.w.z. actiepotentieel dat langs ORN-axonen reist van het olfactorische epitheel naar de bol), vertegenwoordigt het een rauw, onbewerkt signaal (de eerste verwerking van reukinvoer begint in de bollen). Daarom is het een betere parameter om de directe effecten van verontreinigende stoffen, zoals zware metalen, en veranderingen in het milieu, zoals pH, op het olfactorische systeem te beoordelen dan het EOG of EEG^24,25. Opname van de olfactorische bol in zeewater met een hoge PCO₂ (en dus lage pH) kan worden beïnvloed door centrale effecten van pH op neurale verwerking; de 'GABA_A receptor theory' of ocean acidification²⁶, waarbij vermindering van de pH van het water een herverdeling van Cl^- en HCO₃^- ion in het CSF en een daaruit voortvloeiende verschuiving van GABAergic activatie veroorzaakt van remmende (hyperpolariserende) naar excitatory (depolariseren). Bovendien is het in dergelijke studies belangrijk om de effecten van verzuring of verontreinigende stoffen te beoordelen met behulp van geurconcentraties die vergelijkbaar zijn met die welke de vis in zijn natuurlijke omgeving waarschijnlijk tegenkomt. Voor aminozuren is dit in de nano tot micromolar bereik^27,28,29; dicht bij de drempel voor detectie van deze verbindingen bij vissen^1,18. Schatting van de detectiedrempel voor een bepaalde geurstof kan een idee geven van het belang en/of de biologische rol van de reukgevoeligheid. Zo heeft de zeelamprey (Petromyzon marinus) een hoge reukgevoeligheid voor specifieke galzuren die vrijkomen bij larven tot een drempel van 10^-13 M³⁰; deze gevoeligheid stelt volwassenen in staat om geschikte paaigronden te lokaliseren en te identificeren, en dus als migrerend feromoon over lange afstand te fungeren. Op dezelfde manier hebben rijpe vrouwelijke zeelamprei een hoge reukgevoeligheid voor spermine (drempel 10^-14 M), een polyamine die vrijkomt in de milt door mannen, die hen vervolgens aantrekt naar de nesten van spermiating mannetjes³¹. Andere vissen hebben ook reukgevoeligheid voor polyamines^32,33,34,35, maar niet met voldoende lage detectiedrempels om een soortgelijke feromonale rol te ondersteunen; in plaats daarvan wordt voorgesteld om rottende vissen te vermijden. Met zulke hoge reukgevoeligheden is het echter mogelijk zich voor te stellen dat een lichte vermindering van de gevoeligheid (d.w.z. een verhoging van de drempel), zelfs wanneer de responsamplitude niet drastisch wordt verminderd, ernstige problemen voor vissen²⁴zou kunnen veroorzaken .

Wanneer halflogaritisch in kaart wordt geplokkeld, kunnen concentratieresponscurven op geurstoffen exponentieel, lineair of sigmoïdaal¹⁸zijn. In het geval van aminozuren zijn dergelijke semi-logaritmische concentratieresponscurven ofwel lineair (d.w.z. logaritmisch), sigmoïdaal of vermogensfuncties⁷. Dat er geen verzadiging van de respons wordt gezien (d.w.z. geen plateau in de concentratieresponscurve, zelfs bij supramilieuconcentraties) is waarschijnlijk te wijten aan verschillende receptoren die zich binden aan individuele aminozuren, afhankelijk van hun concentratie, in plaats van elk aminozuur dat aan een specifieke receptor bindt; als de concentratie van een bepaald aminozuur toeneemt, meer receptoren in staat zijn om het te binden en dus reageren. Vissen kunnen echter onderscheid maken tussen mengsels van aminozuren^36,37,38,39; dit is waarschijnlijk te wijten aan combinatorische activiteitspatronen die in de reukbollen^{12,40 worden}opgeroepen ; de axonen van alle ORN's die hetzelfde receptoreiwit uitdrukken eindigen bij dezelfde glomeruli in de reukbollen^41,42, en één aminozuur kan meer dan één glomerulus activeren.

Zeer specifieke geurstoffen, zoals feromonen, kunnen echter sigmoïdale of quasi-sigmoïdale concentratie-responscurven^43,44oproepen . De conclusie, hoewel niet empirisch getest, is dat deze reukreacties te wijten zijn aan zeer specifieke receptoren die het feromoonmolecuul en weinig anders binden. Daarom, boven een bepaalde concentratie, zijn alle receptoren bezet, en verdere verhogingen zullen geen verdere reacties in andere ORN's oproepen. Daarom kunnen deze gegevens worden gemonteerd op een drie-parameter Hill plot, en de maximale respons, EC₅₀ en Hill co-efficiënt kan worden berekend^15,45,46. Dit kan waardevolle informatie opleveren, zoals schijnbare affiniteit en schijnbare receptoraantal, die lineaire of exponentiële concentratieresponscurven niet kunnen geven.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AC voorversterker	Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK)	NL104	Neurolog voorversterker specifiek ontworpen voor dit type opname.
Digidata	Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA)	1440A	Analoog-digitaal converter.
EMG Integrator	Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK)	NL703	Elektrische integrator met lekkage om de ruwe activiteit van de zenuw te integreren.
Faraday kooi	In-house gemaakt		Om elektrische ruis te verminderen.
Filter	Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK)	NL125/6	Filtermodule voor elektrofysiologische opname.
Gallamine triethiodide	Sigma-Aldrich (Portugal)	G8134	Neuromusculaire blocker
L-glutamine	Sigma-Aldrich (Portugal)	G3126	Aminozuur gebruikt als geurmiddel
L-leucine	Sigma-Aldrich (Portugal)	L80000	Aminozuur gebruikt als geurmiddel
L-serine	Sigma-Aldrich (Portugal)	S4500	Aminozuur gebruikt als geurmiddel
Metalen basisplaat	Elk		Basis voor micro-manipulatoren.
Micro-hematocrietbuiizen	Elk		Om de watertoevoer naar het olfactorische epitheel te positioneren
Micro-manipulatoren	Narishige International Ltd (London, UK)	M-152	Positie elektroden
MS222 (ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat zout)	Sigma-Aldrich (Portugal)	E10505	Verdovingsmiddel
pH sonde	Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal)	HI12302	Sonde om de pH van water te meten.
Refractometer	Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal)	HI96822	Refractometer om de waterzoutgehalte te meten
Natriumchloride	Sigma-Aldrich (Portugal)	746398	Voor zoutoplossing
Solenoïdekleppen	The Lee Co. (Essex, CT, USA)	LFAA1201618H	Voor het schakelen tussen achtergrondwater en stimuleringsoplossingen (niet langer beschikbaar)
Stereo-microscoop	Zeiss, Leica, Olympus	Elk geschikt model.	Voor dissectie en plaatsing van elektroden.
Titrator	Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal)	HI84531	Titrator om de wateralkaliniteit, pH en temperatuur te meten.
Wolfraam micro-elektroden 0,1 MΩ	World Precision Instruments (Hitchin, UK)	TM31A10	Extracellulaire elektroden.
Ventilaandrijving	In-house gemaakt		12 V DC bron voor het bedienen van solenoïdekleppen.
Waterpomp (onderdompelbaar)	Elk		Om verdovingsmiddelhoudend water naar de kieuwen van de vis te leveren.