Confocale Microscoop-gebaseerde Laser Ablatie en Regeneratie Test in Zebrafish Interneuromast Cellen

Summary

Laserablatie is een breed toepasbare technologie voor het bestuderen van regeneratie in biologische systemen. Het gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van een standaard laserscanning confocale microscoop voor laserablatie en de daaropvolgende time-lapse beeldvorming van het regenereren van interneuromastcellen in de zebravis laterale lijn.

Abstract

Haarcellen zijn mechanosensorische cellen die het gehoor bemiddelen. Deze cellen regenereren niet na schade bij mensen, maar ze worden van nature aangevuld in niet-zoogdiergewervelde dieren zoals zebravissen. De zebrafish laterale lijn systeem is een nuttig model voor het karakteriseren van zintuiglijke haarcel regeneratie. De laterale lijn bestaat uit haarcelhoudende organen genaamd neuromasten, die met elkaar verbonden zijn door een reeks interneuromastcellen (INMC's). INMC's fungeren als voorlopercellen die aanleiding geven tot nieuwe neuromasten tijdens de ontwikkeling. INMC's kunnen hiaten in het laterale lijnsysteem herstellen dat door celdood wordt gecre 700. Een methode wordt hier beschreven voor selectieve INMC ablatie met behulp van een conventionele laser-scanning confocale microscoop en transgene vissen die groene fluorescerende eiwitten uitdrukken in INMC's. Time-lapse microscopie wordt vervolgens gebruikt om INMC regeneratie te controleren en de snelheid van gap sluiting te bepalen. Dit vertegenwoordigt een toegankelijk protocol voor celablatie dat geen gespecialiseerde apparatuur vereist, zoals een krachtige gepulseerde ultraviolette laser. Het ablatieprotocol kan bredere belangen dienen, omdat het nuttig kan zijn voor de ablatie van extra celtypen, waarbij gebruik wordt gemaakt van een gereedschapsset die al voor veel gebruikers beschikbaar is. Deze techniek zal verder de karakterisering van INMC regeneratie onder verschillende omstandigheden en van verschillende genetische achtergronden mogelijk te maken, die het begrip van sensorische voorloper celregeneratie zal bevorderen.

Introduction

De kern van de meest progressieve gehoorverlies ligt de vernietiging van zintuiglijke haarcellen, die extrinsieke auditieve stimuli omzetten in zenuwimpulsen detecteerbaar door de hersenen. Cochleaire haarceldood veroorzaakt blijvend gehoorverlies, omdat volwassen zoogdieren niet in staat zijn om deze cellen te regenereren na schade. Omgekeerd kunnen niet-zoogdiergewervelde dieren zoals zebravissen haarcellen regenereren die verloren zijn gegaan door akoestisch trauma of ototoxische belediging. De zebravis mechanosensorische laterale lijn is een eenvoudig en gemakkelijk gemanipuleerd orgaansysteem dat kan worden gebruikt om haarcelregeneratie^1,2,3te bestuderen.

De laterale lijn bestaat uit kleine zintuiglijke patches genaamd neuromasten, die tijdens de ontwikkeling worden verbonden door een reeks langwerpige cellen die bekend staan als interneuromastcellen (INMC's). Gezien hun proliferative capaciteit als schijnbare stamcellen die aanleiding geven tot nieuwe haarcel-bevattende organen, het gedrag van INMC's is van groot belang voor de gemeenschap^4,5. Veel van het onderzoek met betrekking tot INMC's heeft gekenmerkt onderdrukking van hun proliferatie door nabijgelegen Schwann cellen die wikkel rond de laterale lijn zenuw, waarschijnlijk door middel van een remmer van Wnt / β-catenine signalering. ^6,7,8. Terwijl de regulering van INMC proliferatie en differentiatie in nieuwe neuromasten is goed beschreven, de mechanismen voor INMC hergroei na ablatie zijn niet opgehelderd. Dit protocol dient als een middel om individuele INMC's af te breken en hun daaropvolgende regeneratieve gedrag te analyseren.

Een verscheidenheid van methoden voor het vernietigen van haarcellen, ondersteunende cellen, en hele neuromasten zijn gepubliceerd, samen met methoden voor het toezicht op het herstel. Chemische ablatie werkt goed voor haarcellen, maar doses van giftige chemicaliën zoals CuSO₄ moet aanzienlijk worden verhoogd om andere laterale lijn cel types⁹te verwijderen. Hoewel elektroablatie onder fluorescentiemicroscopie een effectief en eenvoudig middel is om INMC's te vernietigen om regeneratie te bestuderen, is het moeilijk om eng te richten en zal daarom waarschijnlijk aanzienlijke bijkomende schade veroorzaken. Als gevolg hiervan kan dit aspecten van INMC-specifiek gedrag^10,11maskeren. Laser ablatie protocollen zijn gebruikt, maar ze vereisen het gebruik van gespecialiseerde apparatuur niet noodzakelijkerwijs aanwezig in het gemiddelde laboratorium of imaging faciliteit (dat wil zeggen, high-powered gepulseerde UV-lasers¹²). De hier beschreven methode kan worden uitgevoerd met elke laser-scanning confocale microscoop uitgerust met de gemeenschappelijke 405 nm laser, meestal gebruikt voor beeldvorming DAPI en andere blauwe fluoroforen. Een voordeel van deze methode is dat confocale beeldvorming onmiddellijk voor en na celschade kan worden uitgevoerd zonder extra lasercontrolesystemen aan te vallen of over te brengen naar een andere microscoop die is uitgerust met een gepulseerde laser.

Een soortgelijke methode is beschreven voor het ablating van neuronen in het zebravis ruggenmerg¹³. De vorige methode vereist echter een FRAP-module voor celablatie, wat geen vereiste is voor dit protocol. Bovendien is het, gezien de verschillende eigenschappen van verschillende celtypen (d.w.z. de helderheid van transgene fluorescentie, diepte in het lichaam en de celvorm), waarschijnlijk dat er aanzienlijke wijzigingen nodig zijn, afhankelijk van het gebruikte celtype. Het protocol hier beschreven is meer kans om effectief te zijn voor meer oppervlakkige cellen, zoals ondersteund door een demonstratie van zintuiglijke haarcel ablatie met behulp van dezelfde methode. Ook geschetst is een regeneratie test om INMC herstelpercentages te beoordelen na ablatie, die niet een kenmerk van de bovengenoemde studie was.

Het op laser gebaseerde celablatieprotocol dat hierin wordt beschreven, legt de regeneratieve capaciteit van INMC's vast door de optimalisatie van laseromstandigheden, pre- en post-ablatiebeeldvorming en time-lapse microscopie. Deze elementen komen samen om INMC hergroei en gap sluiting in zijn geheel uit te beelden. Hoewel dit protocol hier wordt gebruikt om INMC's te vernietigen, kan het worden toegepast op ander werk dat een betrouwbare en effectieve beoordeling van cellulaire ablatie vereist. Het is ook een toegankelijke technologie, omdat het kan worden uitgevoerd op elke confocale microscoop uitgerust met een 405 nm laser.

Protocol

Al het dierwerk is goedgekeurd door de Pace University Institutional Animal Care and Use Committee onder protocol 2018-1.

1. Bereiding van zebravislarven

1. Stel de paring 3-5 dagen voor het uitvoeren van het experiment in, zodanig dat larven 2 dagen na de bevruchting (dpf) tot 4 dpf in leeftijd zullen zijn wanneer ze worden gemonteerd voor laserablatie.
   OPMERKING: De Et(krt4:EGFP)sqEt20 (afgekort als ET20) enhancer trap lijn, waarin interneuromast cellen zijn duidelijk gelabeld met verbeterde groene fluorescerende eiwitten (eGFP), zorgt voor relatief eenvoudige cel identificatie en ablatie^11,14. Voor de bevestiging van laserablatiespecificiteit en flexibiliteit worden ET20-vissen gefokt met Tg(neuroD:tdTomato)vis, waarbij de zijlijnzenuw is gelabeld met rood fluorescerend eiwit of met Tg(myo6b:βactin-GFP) om sensorische haarcellen te labelen met GFP^15,16.
2. Na het verzamelen van embryo's de volgende dag, uitbroeden embryo's op 28,5 °C in E3 medium met 0,0001% methyleenblauw tot klaar om te verdoven en te monteren.

2. Voorbereiding van lage gelegelarose- en tricaine-oplossingen

1. Voeg aan een 250 mL glazen Erlenmeyer-kolf 48 mL 1x E3-medium, 2 mL van 15 mM tricaine stock-oplossing en 0,5 g laagsmeltende agarose toe.
2. Magnetron de oplossing op hoog voor 30 s en wervelen (het dragen van warmte-beschermende handschoenen) om de agarose op te lossen. Herhaal de 30 s verwarmingscycli totdat agarose volledig is opgelost.
3. Bewaar de agarose in een tot 42 °C verwarmde couveuse tot klaar voor gebruik.

3. Verdoesing van zebravissenlarven

1. Voeg aan een conische buis van 50 mL 24 mL van 1x E3-medium en 1 mL tricaine stockoplossing (15 mM) toe aan een uiteindelijke concentratie van 600 μM. Werveling om te mengen.
2. Laad een van de zes putten van een celkweekplaat met een platte bodem met 8 mL E3 met 600 μM tricaine.
3. Gebruik een transferpipet om zebravislarven in een 74 μm mesh-bottomed transfer insert te verplaatsen.
4. Breng de mesh-bottomed insert in de put van de zes-put plaat met de E3 + tricaine oplossing. Laat de larven minimaal 3 min of maximaal in de put blijven of tot ze volledig verdoofd zijn. Test anesthesie door op de wisselplaat te tikken. Larven mogen niet schrikken en zwemmen in reactie op de kraan.

4. Fluorescerende screening van verdoofde zebravislarven

1. Pipette één verdoofde larve per goed op 12 goed hydrofoob-gecoate glijbanen voor het onderzoeken. Zorg ervoor dat er een minimale kromming van de meniscus gevormd in elke put van de dia om optische vervorming te verminderen bij het screenen. Dit kan worden gedaan door het verwijderen van een klein volume van E3 uit elke put na het plaatsen van de larven.
2. Onder een 10x doelstelling op een rechtopstaande microscoop (uitgerust met een kwikbooglamp, metaalhalidelamp of LED-lichtbron en een geschikte filterkubus), scherm voor larven die eGFP uitdrukken in de neuromasten en interneuromastcellen van het laterale lijnsysteem.
   1. Selecteer larven met sterkere expressie wat resulteert in helderdere eGFP, die vermoedelijk homozygoot zijn voor het transgene.
      OPMERKING: In de ET20-lijn wordt eGFP uitgedrukt in een ring van mantelcellen rond elke neuromast en de smalle strook interneuromastcellen die deze organen met elkaar verbinden. Sterkere eGFP expressie (helderder fluorescentie) draagt bij aan een effectievere ablatie.
   2. Om de specificiteit van ablatie te onderzoeken, gebruikt u dubbeltransgene larven met zowel de ET20- als de Tg(neuroD:tdTomato) transgenes. Als screening op Tg(neuroD:tdTomato) dragers, gebruik maken van de RFP filter kubus ingesteld om een heldere rode patch net achterste aan het oor die de achterste laterale lijn ganglion te identificeren.
   3. Om haarcellen in de laterale lijn neuromasten ablate, gebruik maken van de Tg (myo6b:βactin-GFP) transgene lijn en het scherm voor GFP lokalisatie in het midden van elke neuromast.
3. Selecteer larven met stereotiepe afstand van de neuromasten. Verschillen in de afstand tussen neuromasten kunnen wijzen op abnormale neuromastafzetting tijdens de ontwikkeling, wat wijst op gebrekkig migratiegedrag of celproliferatie in de laterale lijn primordium¹⁷. Dergelijke gebreken kunnen ook van invloed zijn op het migratie- of regeneratief gedrag van de INMC's na ablatie.
   OPMERKING: Veelvoorkomende gebreken in de afstand zijn een ongewoon grote afstand tussen de voorste neuromast gedeponeerd door de eerste migrerende primordium (prim1L1) en de tweede neuromast gedeponeerd door hetzelfde primordium (prim1L2), vaak geassocieerd met verdringing van de meer achterste neuromasten.

5. Montagelarven voor laserablatie en beeldvorming

1. Pipette 3 - 4 verdoofde larven in een kleine druppel E3/tricaine oplossing in het midden van een deksel slip-bottomed schotel (35 mm schotel met een 14 mm nummer 1.5 coverslip). Verwijder overtollige oplossing zodat de larven in een kleine druppel blijven, net groot genoeg om ze te bevatten.
2. Breng de schotel naar het stadium van een verrekijker stereo microscoop microscoop en manipuleren van de zoom en focus, zodat alle larven zijn in het gezichtsveld.
3. Verwijder de Erlenmeyer-kolf met het lage smeltpunt uit de verwarmde couveuse. Gebruik een transferpipet om agarose-oplossing over te brengen op de afdekplaat om een dunne laag te produceren. Trek overtollige agarose af totdat de vloeistof gewoon de put aan de onderkant van de schotel vult, waarbij u ervoor zorgt dat er geen larven worden aangezogen.
4. Schik de larven in de agarose-oplossing snel met behulp van een haarmes of haarlus, zodat ze met elkaar zijn uitgelijnd en gericht zijn met rostral aan de linkerkant.
5. Druk de larven voorzichtig tegen het glas met het haarmes, zodat ze in profiel liggen met hun rechterzijde naar beneden. Larven ouder dan 3 dpf hebben de neiging om te zweven als gevolg van hun opgeblazen zwemblazen, dus ze kunnen herhaaldelijk tegen het glas moeten worden gedrukt totdat de agarose begint te gelen.
6. Na ongeveer 60 s zal de agarose beginnen te stollen, en de larven zullen niet in staat zijn om geheroriënteerd te worden. Laat ongeveer 5 minuten op kamertemperatuur voor de agarose op de cover slip volledig stollen. Zodra de agarose is gestold, gebruik maken van een overdracht pipet om de schotel te vullen halverwege met E3 met 1x tricaine.

6. Het lokaliseren van prospectieve doelen en pre-ablatie beeldvorming

1. Schakel de stroom in voor het laserscannende confocale microscopiesysteem en initialiseer via de geïntegreerde imagingsoftware. Selecteer de doelstelling 63x Plan-Apochromat-olieonderdompeling (numeriek diafragma 1.40) of iets dergelijks. Breng onderdompelingsolie aan en zet de schotel vast in een cirkelvormig stadium, zodat de larven het hoofd bieden aan hun rostralaspect aan de linkerkant.
2. Selecteer onder bright-field of differentiële interferentie contrastverlichting een van de gemonteerde larven voor beeldvorming. Pas de focus met de focusknop zodanig dat de huid aan de zijkant van de vis die het dichtst bij de coverslip staat scherp is, herkenbaar aan het vingerafdrukachtige patroon van peridermcellen.
3. Eenmaal in focus, overschakelen naar epifluorescente verlichting in het GFP-kanaal. Zoek de achterste laterale lijn door GFP-expressie langs het horizontale myoseptum. Ringen van fluorescerende cellen geven neuromast mantelcellen, en langwerpige strengen van cellen zijn interneuromast cellen.
4. Beginnend met de primIL1 neuromast, meestal gelegen net dorsale aan de dooier, gebruik maken van de stage control joystick of andere fase beweging controle om visueel te scannen caudally langs de horizontale myoseptum.
   1. Volg de reeks interneuromastcellen tot het bereiken van het gebied tussen de primIL3 en primIL4 (L3 en L4) neuromasten (figuur 1A).
      OPMERKING: Andere regio's kunnen ook worden gericht, maar dit deel van de stam en staart heeft de neiging om het dichtst bij het afdekglas en, daarom, het meest vatbaar voor ablatie.
   2. Als u meerdere larven inbeeldt, stelt u de eerste fasepositie in en activeert u de optie meerdere faseposities door het selectievakje uit te schakelen.
   3. Herhaal stap 6.4.1–6.4.2. voor elke gewenste stadiumpositie (elke larve).
5. Nadat cellichamen in de L3-L4-regio zijn geïdentificeerd, schakelt u over naar de overnamemodus.
   1. Activeer een GFP-beeldspoor met de 488 nm of 491 nm laser.
   2. Voeg een uitgezonden licht (uitgezonden licht fotomultiplier buis of T-PMT) kanaal toe aan de geactiveerde 488 nm lasertrack door het t-PMT selectievakje te activeren onder het vervolgkeuzemenu "Imaging Setup".
   3. Stel de laserkracht in op 6%, pinhole grootte op 1 Luchtige eenheid equivalent, en digitale winst op 750 voor imaging ET20 larven. Exacte winst en laserkracht kunnen variëren voor een bepaalde larve, afhankelijk van hoe dicht bij de cover slip ze zijn gemonteerd en de helderheid van fluorescentie. Pas de winst zodanig dat cellichamen verzadigd zijn om anders dimprojecties en filipodia vast te leggen.
   4. Pas de parameters aan op een framegrootte van 1024 pixels x 1024 pixels, digitale zoom van 0,7 (145,2 μm x 145,2 μm beeldgrootte). Stel middeling in op 2 om de beeldkwaliteit te verbeteren.
6. Schakel het vakje z-stack in om het vervolgkeuzemenu z-positie weer te geven. Terwijl snel scannen, focus uit tot de interneuromast cellen zijn gewoon onscherp. Stel het eerste segment in en richt je vervolgens door het monster totdat de interneuromastcellen weer onscherp zijn. Stel het laatste stukje in. Zorg ervoor dat het een z-stack van ongeveer 25 μm omvat. Stel het beeldinterval in op 1 μm.
7. Begin met experimenteren om een pre-ablatie z-stack(figuur 1B)vast te leggen. Als faseposities zijn toegevoegd, activeert u de optie Posities zodat alleen de huidige positie wordt weergegeven. Sla het bestand op zodra het is vastgelegd.

7. Laserablatie van cellichamen

1. Klik op "Toon alle tools". Deze optie bevindt zich aan de bovenkant van de acquisitie-interface.
2. Klik op het vervolgkeuzemenu voor "Imaging Set Up". Klik in "Imaging Set up" op "Voeg een nieuw nummer" toe (vertegenwoordigd als "+").
3. Klik in "Imaging Set Up" op het vervolgkeuzemenu voor "Dye". Selecteer DAPI als kleurstof.
4. Klik op het vervolgkeuzemenu voor "Kanalen" en schakel alle andere nummers uit door hun respectievelijke selectievakjes los te maken. Zorg ervoor dat alleen de DAPI-track is geselecteerd.
5. Klik in de DAPI-track op 405 voor de "Laserinstelling". Verhoog het laservermogen tot 75%. Schakel het DAPI-kanaal los om de laser uit te schakelen tijdens het scannen op kandidaat-cellichamen voor ablatie.
6. Met het lichaam van een interneuromastcel gecentreerd in het gezichtsveld, zoomt u het scanframe in tot 20x-22x. Het kan nodig zijn dat de framepositie moet worden aangepast om het cellichaam in het midden te houden terwijl de zoom wordt toegepast. Stop met live scannen zodra het cellichaam het gezichtsveld vult.
   OPMERKING: Het cellichaam moet het hele gezichtsveld bezetten. Op dit zoomniveau zal de GFP snel bleken. Minimaliseer de tijd van laserbelichting door snel te werken. Gebruik zoom in plaats van het selecteren van een regio van belang om laser vermogen distributie over een klein gebied te verhogen.
7. Controleer de 405 nm laser sluiterkast om het spoor te activeren. Pas het laservermogen aan op 75%. Stel een timer in voor 45 s. Activeer continu scannen en start de timer. Stop onmiddellijk met scannen bij 45 s.

8. Beeldvorming na ablatie en time-lapse microscopie om regeneratie te bestuderen

1. Klik op het vervolgkeuzemenu voor "Kanalen". Klik in kanalen op het "DAPI" spoor om de ablatielaser te activeren. Klik op het vervolgkeuzemenu voor "Acquisitiemodus".
2. Klik in de acquisitiemodus op" Zoom".
3. Verlaag de zoom naar 0,7 met de schuifregelaar of door "0,7" in te typen.
   1. Om een succesvolle celablatie te garanderen, verhoogt u de winst tot 900 en scant u snel het gezichtsveld.
      OPMERKING: Er mag geen GFP zichtbaar zijn in de beoogde cel of cellen. Als fluorescentie nog steeds wordt waargenomen, keert u terug naar de stappen 7.1–7.3.
   2. Met dezelfde of vergelijkbare instellingen als die beschreven voor pre-ablatie beeldvorming, vastleggen en opslaan van een post-ablatie beeld(Figuur 1C). Als het beeld restanten van fluorescerende cellen of extra cellichamen onthult die moeten worden verwijderd, herhaalt u de laserablatiestappen om een zichtbare kloof in de reeks interneuromastcellen te creëren.
   3. Inspecteer de afbeelding van het T-PMT-kanaal om cellulaire schade verder te bevestigen. Beschadigde cellen hebben een korrelig uiterlijk, en vaak zullen de kernen zwellen of onregelmatig van vorm worden(figuur 2).
4. Na het vastleggen van een pre-ablatieafbeelding, het ablating van de cellen indien nodig en het vastleggen van een post-ablatieafbeelding voor elke afzonderlijke fasepositie, stelt u de time-lapse microscopie in door zowel de stadiumpositie als de tijdopties voor beeldopname te activeren. Stel de tijdparameters in op 24 uur of een ander gewenst eindpunt en intervallen van 15 minuten. Start experiment om afbeeldingen te verkrijgen en sla het resulterende bestand op wanneer het is voltooid (op de volgende dag).
5. Als larven verder moeten worden bestudeerd of verhoogd, verwijder ze dan voorzichtig uit de agarose met behulp van fijne tangen, breng dan over naar E3-medium zonder tricaine voor herstel. Als ze niet verder mogen worden gebruikt, euthanaseren volgens het goedgekeurde dierprotocol (snelle en aanhoudende onderdompeling in een ijsbad is een gemeenschappelijke methode) en gooi ze zoals vereist door de instelling.

9. Beeldanalyse

1. Open een z-stack-bestand na de ablatie in de voorkeurssoftware voor beeldverwerking(Tabel van materialen). Splits de kanalen zodanig dat elk kanaal zich in een apart weergavevenster bevindt.
2. Gebruik in het GFP-kanaalvenster het lijngereedschap om een rechte lijn te trekken tussen de uiteinden van de resterende INMC's. Dit kan worden geholpen door op en neer te scrollen door de z-stack of door het uitvoeren van een maximale intensiteit projectie voorafgaand aan het tekenen van de lijn.
3. Gebruik het gereedschap' Meten' om de afstand tussen INMC-uiteinden in de x- en y-vlakken te verkrijgen.
4. Blader door de z-segmenten in de oorspronkelijke z-stack om de afstand tussen INMC's in het z-vlak te bepalen.
5. Bereken de totale afstand tussen INMC-uiteinden met behulp van de stelling van Pythagoras (een² + b² = c²). De hypotenuse is de totale afstand (of tussenruimte).
6. Voer de resulterende afstandsmeting in een spreadsheettoepassing in voor gegevensanalyse.
7. Bekijk de time-lapse microscopiebestanden die in stap 8.2–8.3 zijn verzameld met behulp van de geïntegreerde imagingsoftware op het confocale systeem of vrij beschikbare software voor beeldanalyse. Identificeer het tijdspunt waarop de kloof tussen interneuromastcellen werd opgevuld door celprojecties. Dit kan worden geholpen door het onderzoek van meerdere z-slices om de sluiting van de kloof in alle dimensies te bevestigen.
8. Als u de meest nauwkeurige meting van tijd tot tussensluiting wilt bereiken, gebruikt u de stempel afbeeldingstijd na de ablatie (zichtbaar in Finder of Verkenner) als nultijdpunt; het meten van de tijd vanaf het begin van de time-lapse beeldstack kan resulteren in het onderschatten van de tijd tot sluiting, afhankelijk van hoeveel tijd is verstreken, terwijl het afbreken van extra fase posities, enz.
9. Ontlenen de sluitingssnelheid door simpelweg de oorspronkelijke tussenruimte (μm) te delen door de uren of minuten die nodig zijn voor volledige onderbreking van de kloof.

Results

Om INMC's te ablate en regeneratie op te nemen, werden gescreende GFP-expressing zebravislarven van de TRANSGENE LIJN ET20 gemonteerd bij 2- of 3-dagen na de bevruchting voor ablatie zoals beschreven in stap 5.4. Meerdere vissen kunnen tegelijkertijd worden gemonteerd, zodat meerdere time lapses kunnen worden gevangen in een enkel experiment. Het gebied van de laterale lijn gelegen tussen primIL3 en primIL4 neuromasten werd geïdentificeerd, en pre-ablatie beelden werden vastgelegd zoals beschreven in stappen 6.5–6.7 (Figuur 1A,B).

Drie cellichamen waren gericht op laserablatie om een gat in de INMC-snaar van ongeveer 40 μm te creëren. Post-ablatie scannen met hoge winst en de daaropvolgende beeldvorming bevestigd dat er geen cellichamen bleef in de ablated regio, waardoor een kloof tussen langwerpige projecties van de aangrenzende INMC's (figuur 1C). Celdood werd verder aangetoond door het onderzoeken van de T-PMT kanaal na ablatie. Beschadigde en stervende cellen werden gekenmerkt door gezwollen en onregelmatig gevormde kernen, evenals een korrelig uiterlijk(figuur 2, geschetst). In sommige gevallen, time-lapse imaging bleek ook de werving van grote amoeboid cellen die waarschijnlijk macrofagen (Figuur 2, sterretje). Donkere gebieden rond de geableerde INMC's wezen op fotobleaching in bovenliggende peridermcellen. Deze cellen bleken in deze experimenten niet te zijn beschadigd of vernietigd door laserbestraling; eerder werd hun fluorescentie tijdelijk verminderd. Time-lapse microscopie blijkt dat deze cellen normaal herstellen na ablatie en niet van vorm veranderen of anderszins lijken beschadigd (ongepubliceerde resultaten, Volpe et al.).

Om de specificiteit van INMC-vernietiging te ondersteunen, werden ablaties uitgevoerd in dubbeltransgene ET20- en Tg-larven (neuroD:tdTomato) waarin de laterale lijnzenuw (die slechts micron onder de interneuromastcellen loopt) is gelabeld met rood fluorescerend eiwit. Ablaties van verschillende cellen die aanzienlijke hiaten in de INMC-snaar creëerden, hadden weinig of geen effect op de zijlijnzenuw op basis van rode fluorescentie(figuur 3). Flexibiliteit van de techniek voor het ablating van oppervlakkig gelokaliseerde cellen werd aangetoond door selectieve vernietiging van individuele sensorische haarcellen binnen neuromasten van de laterale lijn. Met behulp van in wezen hetzelfde protocol hierboven beschreven (secties 7 en 8), enkele haarcellen in transgene Tg (myo6b:βactin-GFP) larven werden vernietigd zonder zichtbare schade aan aangrenzende cellen (Figuur 4). De ablated haarcellen niet herstellen fluorescentie na time-lapse microscopie, en hun kernen waren merkbaar korrelig en misvormd na laser blootstelling (Figuur 4B). Net als bij INMC-ablaties werden vaak schijnbare macrofagen aangeworven op de laserblootstellingsplaats (niet-gepubliceerde resultaten, Volpe et al.).

Na laserablatie en post-ablatie beeldopname werd de grootte van de kloof gemeten met behulp van vrij beschikbare software voor beeldanalyse. Het meetinstrument toonde hiatengroottes aan, variërend van slechts enkele micron tot 100 micron, afhankelijk van de breedte van individuele INMC's en hoeveel cellen werden gekozen voor ablatie(figuur 5). Timelapse microscopie werd gebruikt om INMC-gedrag op te nemen tijdens regeneratie. In 50 proeven waren 15 hiaten (30%) werden gesloten door regeneratie binnen een periode van 24 uur. In de meeste gevallen deden INMC's die zich konden herstellen dit binnen de eerste paar uur na beeldvorming. Herstel werd gedefinieerd als het tijdspunt waarop projecties van naburige cellen in contact kwamen, die 16 uur na ablatie plaatsvonden voor een opening van ongeveer 40 μm (Film 1). Z-stacks werden zorgvuldig onderzocht om ervoor te zorgen dat cel-cel contact opgetreden binnen een enkel z-vlak, het vermijden van mogelijke artefacten als gevolg van z-projecties. Logistieke regressie analyse bleek dat de kans op gap sluiting gecorreleerd met gap grootte (p = 0,0453), met kleinere hiaten die meer kans om te genezen. Een gap van 55,5 μm leverde een sluitingskans van 50% op (figuur 5).

In 70% van de gevallen waren INMC's niet in staat om de kloof die door ablatie ontstond volledig te dichten. Echter, zelfs in deze gevallen waren we in staat om de vorming van lange projecties van naburige INMC's, die lijken in sommige opzichten uitbreiding van neuronale groeikegels (Movie 2) te controleren. Zo kunnen deze experimenten ook inzicht geven in het gedrag van INMC's na schade.

Figuur 1: Selectieve ablatie van interneuromastcellen door laserbestraling. (A) Interneuromastcellen tussen neuromasten primIL3 en primIL4 zijn geselecteerd voor ablatie. Deze cellen vertonen een karakteristieke spindelvorm met langwerpige projecties die aangrenzende cellichamen overlappen. (B)Pre-ablatie beeldvorming geïdentificeerd cellichamen die kunnen worden ablated om een kloof te produceren. (C) Beeldvorming na ablatie bevestigt succesvolle ablatie, zoals blijkt uit de afwezigheid van cellichamen in het hiaatgebied. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Post-ablatie beeldvorming toont celdood aan in reactie op blootstelling aan laser in GFP-gelabelde interneuromastcellen. Verzonden licht fotomultiplier imaging (T-PMT) geeft de aanwezigheid van een necrotische cel met een korrelig uiterlijk (omcirkeld) evenals de werving van onregelmatig gevormde cellen die waarschijnlijk macrofagen (*). Samenvoeging van GFP- en T-PMT-kanalen bevestigt dat celdood en macrofaagactiviteit plaatsvonden op de plaats van ablatie. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Specificiteit van interneuromastablatie. a) Voorablatie GFP-gelabelde interneuromastcellen (groen) en tdTomato-gelabelde zijlijnzenuw (rood) in een dubbeltransgene Tg(ET20); NeuroD:tdTomato) larve. Cellichamen in de nabijheid van de zijlijnzenuw waren het doelwit van ablatie. (B) Post-ablatie beeldvorming toont ablatie van gerichte cellichamen met een intacte laterale lijn zenuw. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Ablatie van sensorische haarcellen met behulp van confocale microscopie. (A) Pre-ablatie beeldvorming geïdentificeerd een GFP gelabeld sensorische haarcel (*) gericht op ablatie in dubbeltransgene Tg (ET20; myo6b:βactin-GFP) zebravis. Verzonden licht fotomultiplier buis (T-PMT) beeldvorming onthult normale haarcel morfologie, met een ronde dwarsdoorsnede. (B) Post-ablatie beeldvorming bevestigt succesvolle ablatie van de beoogde haarcel. Een T-PMT beeld geeft onregelmatigheid in haarcel vorm en verhoogde granulariteit na blootstelling aan laser, wat suggereert celdood in plaats van fotobleaching. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Logistieke regressiemodellen de waarschijnlijkheid van gapsluiting als functie van de tussenbreedte (in μm). Een score van 0 staat voor volledige gapsluiting, terwijl een score van 1 een onvolledige gapsluiting vertegenwoordigt. De resultaten geven aan dat het effect van de breedte van de tussenruimte op het vermogen van interneuromastcellen om respectievelijke hiaten te dichten statistisch significant is (p = 0,0453, n = 24 totaal; n = 12 gesloten hiaten, n = 12 onvolledig gesloten hiaten). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Film 1: Time-lapse microscopie die gapsluiting (~40 μm) aantoont na 16 uur. Beelden werden elke 15 minuten vastgelegd en er werd een z-projectie met maximale intensiteit gemaakt voor alle timepoints. Klik hier om deze video te downloaden.

Film 2: Time-lapse microscopie van een INMC-kloof die niet dicht. De langwerpige en vertakkende projecties van de resterende INMC's worden weergegeven. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussion

Het protocol beschrijft een veelzijdige methode voor lasercelablatie die kan worden uitgevoerd op elke confocale microscoop uitgerust met een bijna-ultraviolette laser (405 nm golflengte). Dit protocol behandelt beperkingen van eerder gebruikte methoden zoals elektroablatie (die meer wijdverspreide schade^{veroorzaakt 11)}en gepulseerde UV-laser ablatie (waarvoor extra gespecialiseerde apparatuur^{vereist 12}). Pre- en post-ablatie confocale beeldvorming bieden snelle feedback over het succes van het experiment. Latere time-lapse microscopie biedt een eenvoudige test voor regeneratie in een celtype dat cruciaal is voor de ontwikkeling van het sensorische systeem.

Het is van vitaal belang om voorscreen voor transgene zebravissen die GFP sterk uitdrukken in neuromasten en INMC's. Larven met heldere fluorescentie en ongeveer zelfs afstand van de primI-afgeleide neuromasten zijn ideale kandidaten voor laserablatie. Zelfs in deze vissen, zijn er af en toe dimmer INMC's die op het eerste ontsnappen detectie kan. Deze cellen kunnen achterblijven na laserablatie, waardoor de vorming van een echte kloof tussen INMC's wordt voorkomen. De digitale versterking moet worden aangepast om deze dimmercellen te onthullen tijdens pre-ablatiebeeldvorming, zodat ze ook kunnen worden gericht met de 405 nm-laser (stap 8.2).

Op dezelfde manier zal lasertargeting soms niet volledig een cel vernietigen; in plaats daarvan zal het bleken van de fluorescentie, wat resulteert in een falen om een echte kloof te creëren. Deze cellen zullen over het algemeen toenemen in fluorescentie tijdens timelapse microscopie. Gain aanpassing in de post-ablatie imaging stap samen met T-PMT imaging(Figuur 2) helpen ervoor te zorgen dat alle beoogde cellen effectief zijn verwijderd. Het vereist vaak twee of drie individuele celablaties om een hiaat in de inmc-tekenreeks te produceren. Celdood kan worden gedetecteerd door blebbing of een korrelig uiterlijk in de beoogde cellen; hoewel dit een korte wachttijd kan vereisen na lasertargeting (en in sommige gevallen worden kort daarna schijnbare apoptotische of necrotische figuren waargenomen).

Een beperking van deze procedure is dat het meerdere experimentele proeven kan vereisen voordat laseromstandigheden worden geoptimaliseerd en INMC-regeneratie succesvol is. De laserkracht en de totale verblijfstijd van de laser kunnen elk een lichte aanpassing vereisen voor verschillende monsters. Het is gebleken dat overmatige lasertoepassing het vermogen van de laterale lijn kan aantasten om zichzelf te herstellen. Dit omvat zowel 1) overbelichting van individuele cellen aan laserbestraling, vermoedelijk veroorzaakt extra schade aan omliggende weefsels, evenals 2) de ablatie van te veel cellen in de string, wat leidt tot een grotere kloof. Gebruikers moeten een evenwicht vinden tussen voldoende bestralende cellen om hun vernietiging te garanderen en de cellen niet overbelichten, wat regeneratie kan vertragen of voorkomen. Met de juiste instellingen is gebleken dat de INMC's kunnen worden verwijderd zonder zichtbare schade aan de achterste zijlijnzenuw, wat aangeeft dat bijkomende schade wordt geminimaliseerd met dit protocol in tegenstelling tot elektroablatie¹¹. In geen geval werden nieuwe neuromasten in de kloof waargenomen, vermoedelijk omdat de zijlijnzenuw intact blijft en onderliggende gliacellen de proliferatie van INMC's^6,7,^8,11remmen .

Aangetoond wordt dat deze methode van confocale laserablatie ook op andere celtypen kan worden toegepast, met name in die welke oppervlakkig in het dier zijn gelegen, met inbegrip van sensorische haarcellen(figuur 4). Een soortgelijk protocol kan worden gebruikt om huidcellen te ablate om wondherstel of neuronen te onderzoeken voor axonale regeneratiestudies, zoals eerder beschreven¹³. De verwachting is dat deze techniek een nuttige aanvulling zal worden op het experimentele repertoire van laboratoria die beschikken over een confocale microscoop, maar geen andere gespecialiseerde apparatuur voor laserablatie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well PTFE Printed Slides	Electron Microscopy Sciences	63425-05
15 mM Tricaine stock solution	Sigma	E10521	15 mM Tricaine in reverse osmosis water
1X E3 + 600 µM Tricaine			Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media
1X E3 media			Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L)
60 X E3 media	All components purchased from Sigma-Aldrich		34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water
Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence	Olympus
LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers	Carl Zeiss Microscopy, LLC		A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40
FIJI/ImageJ Image processing software	Multiple contributors		Downloadable at https://fiji.sc/
Dissecting needle modified into hair knife	Fisher Scientific	19010	An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle
Microsoft Excel software	Microsoft Corp.		Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel
Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	35 mm petri dish, 20 mm glass window
Immersol 518F Immersion Oil	Fisher Scientific	12-624-66A
Low Gelling Agarose	Sigma Life Science	A9414-256
Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio software	Rstudio PBC		Downloadable at https://rstudio.com/
SMX-168-BL Stereo microscope	Motic
Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN software	Carl Zeiss Microscopy, LLC