Vastleggen van milieu-DNA (eDNA) uit watermonsters door flocculatie

Samenvatting

Milieu-DNA (eDNA) wordt meestal vastgelegd uit watermonsters met behulp van alcoholprecipitatie, filtratie of flocculatie. Hier wordt een alternatief protocol gepresenteerd dat lanthaanchloride gebruikt om het verzamelen van opgeloste en deeltjesgebonden nucleïnezuren mogelijk te maken uit watermonsters die eukaryote cellen, prokaryote cellen en virus bevatten.

Samenvatting

De analyse van milieu-DNA (eDNA) is een veelgebruikte benadering geworden voor het oplossen van problemen in het beheer van soorten. Het doel is de detectie van cryptische soorten, waaronder invasieve soorten en (of) soorten die risico lopen, meestal bereikt door water en sediment te testen op de aanwezigheid van karakteristieke DNA-handtekeningen. Er zijn betrouwbare en efficiënte procedures nodig voor het vastleggen van eDNA, vooral die welke gemakkelijk in het veld kunnen worden uitgevoerd door personeel met een beperkte opleiding en burgerwetenschappers. Het vastleggen van eDNA met behulp van membraanfiltratie wordt momenteel veel gebruikt. Deze aanpak heeft inherente problemen, waaronder de keuze van het filtermateriaal en de porositeit, filtervervuiling en de tijd die ter plaatse nodig is om het proces uit te voeren. Flocculatie biedt een alternatief dat gemakkelijk kan worden geïmplementeerd en toegepast op bemonsteringsregimes die ernaar streven om in beperkte tijd brede gebieden te bestrijken.

Inleiding

Vóór het midden van de jaren 2000 werd de term "omgevings-DNA" over het algemeen gebruikt om te verwijzen naar DNA verkregen uit water- en bodemmicroben, hoewel sommige toepassingen voor de detectie van menselijk en dierlijk DNA met het oog op het volgen van fecale bronnen of het opsporen van niet-inheemse soorten waren begonnen ^1,2,3. Momenteel wordt DNA uit de omgeving over het algemeen gebruikt om DNA te beschrijven van cellen die zijn afgestoten door eukaryote organismen, en de analyse van dit DNA is een veelgebruikt managementinstrument geworden. Het doel is de detectie van cryptische soorten, waaronder soorten die invasief zijn of bedreigde soorten, meestal bereikt door water of sediment te testen op de aanwezigheid van de karakteristieke DNA-handtekeningen van de doelsoorten. Studies kunnen zich richten op een enkele interessante soort met behulp van een specifieke PCR-assay (actieve bemonstering), of veel soorten kunnen tegelijkertijd worden gedetecteerd met behulp van metabarcoding en massaal parallelle sequencing.

In de afgelopen twee decennia zijn er veel verbeteringen aangebracht in het verzamelen van monsters, het verwerken van monsters en het analyseren van gegevens in verband met eDNA-onderzoek. Vroege studies gebruikten alcoholprecipitatie om DNA uit watermonsters te vangen³. Hoewel beproefd, maakt de noodzaak om grote watervolumes te analyseren om de testgevoeligheid te verhogen, deze methode onaantrekkelijk vanwege de typische vereiste van twee volumes ethanol voor elk volume watermonster.

Latere studies hebben over het algemeen gebruik gemaakt van membraanfiltratie, waarbij werd gerationaliseerd dat eDNA aanwezig is in een continuüm van toestanden van cellulair gebonden tot vrij opgelost, maar dat opgelost DNA onderhevig is aan snelle degradatie en daarom dat cellulair gebonden DNA de meest significante fractie vertegenwoordigt. Optimalisatie van filtermateriaal en poriegrootte wordt veel besproken en besproken, evenals de optimale methode(n) voor extractie van vastgelegd eDNA uit het filter ^4,5,6.

Een derde benadering van eDNA-vastlegging is flocculatie, een proces dat al eeuwenlang wordt gebruikt om vloeistoffen te klaren, waaronder water, bier en wijn. Verschillende onderzoeken hebben flocculatie gebruikt om virussen uit natuurlijke of drinkwaterbronnen te vangen 7,8,9,10,11. In deze onderzoeken zijn doorgaans voorgevlokte magere melk of ijzerchloride gebruikt als afvangmiddel. IJzerchloride-methoden resulteren doorgaans in moleculaire problemen met de stroomafwaartse analyse als gevolg van remming van de PCR-reactie^12,13. Methoden waarbij voorgeflocculeerde magere melk wordt gebruikt, vereisen de voorafgaande bereiding van het vlokmiddel, pH-regeling, en zijn tot nu toe alleen toegepast op het vangen van virus ^7,8,9.

Onlangs is flocculatievangst van bacteriën en virussen op basis van het gebruik van lanthaan (III) chloride bestudeerd 12,13,14,15. De auteurs toonden aan dat levensvatbare pathogenen met deze methode konden worden verzameld, aangezien de binding van lanthaanchloride effectief was bij een lage concentratie (0,2 mM). Bovendien is lanthaanflocculatie omkeerbaar via chelatie onder milde omstandigheden in tegenstelling tot die van ijzerchloride.

Flocculatie met behulp van lanthaanchloride om biologische deeltjes op te vangen is dus aantrekkelijk, aangezien slechts een kleine hoeveelheid toegevoegd geconcentreerd vlokmiddel nodig is, er geen strikte pH-regeling nodig is en de monstervolumes schaalbaar zijn van milliliters tot gallons. Zoals toegepast op het vastleggen van eDNA, worden cellulair, subcellulair (mitochondriën en chloroplasten) en opgelost DNA gemakkelijk teruggevonden. Bacteriën en virussen worden gelijktijdig verzameld, waardoor pathogenen kunnen worden getest en (of) aanvullende ecologische studies kunnen worden uitgevoerd op basis van een enkel watermonster. Er wordt een flocculatieprotocol met lanthaanchloride gepresenteerd dat het mogelijk maakt om opgeloste en deeltjesgebonden nucleïnezuren uit watermonsters te verzamelen.

Protocol

1. Ontsmetting van apparatuur en bereiding van flocculatiereagens

1. Was alle flessen, slangen en andere eerder gebruikte apparatuur grondig met afwasmiddel en heet water.
2. Spuit alle flessen, slangen en andere eerder gebruikte apparatuur in met 6% citroenzuuroplossing om minerale afzettingen te verwijderen, laat 20 minuten staan en spoel af met kraanwater.
3. Voeg een oplossing van 10-voudig verdund huishoudbleekmiddel (0,5-0,6% eindconcentratie natriumhypochloriet) toe aan alle flessen (ongeveer 10% van het containervolume), schud, laat het minstens 1 uur staan, giet af en spoel af met kraanwater tot er geen spoor van bleekmiddel meer is. Spoel vervolgens een keer af met gedeïoniseerd water.
4. Droog alle flessen.
5. Plaats alle opvangflessen en doppen in een biologische veiligheidskast en bestraal ze met ultraviolette kiemdodende lampen gedurende 2 uur, waarbij u elke fles en de dop elk half uur een kwartslag draait.
6. Plaats de doppen op de flessen en schroef ze losjes vast. Weeg elke fles en noteer het lege gewicht op de fles.
7. Bereid een oplossing van 100 mM lanthaan (III)chloride-heptahydraat door 3,71 g op te lossen in gedeïoniseerd water van 100 ml. Om de blootstelling van de chemische stof aan lucht te minimaliseren, aangezien lanthaanchloride hygroscopisch is, sluit u de fles tussen gebruik af met tape.
   LET OP: Lanthaanchloride is voorzien van het signaalwoord waarschuwingsgevarenaanduiding(en). H315 veroorzaakt huidirritatie. H319 veroorzaakt ernstige oogirritatie. H335 kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen. Zie het SDS van het materiaal voor meer informatie.
8. Bereid een 1 M oplossing van natriumbicarbonaat door 84,01 g natriumbicarbonaat op te lossen in 1 L gedeïoniseerd water. Filter, steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur.

2. Monsterafname en flocculatie

1. Verzamel monsters van elke locatie plus één veld blanco (een monster met drinkwater dat ter plaatse wordt gevuld om te controleren op verontreiniging) door flessen van de juiste grootte te vullen. Pas het aantal genomen monsters aan op basis van het experimentele ontwerp en het beoogde doel. Vul de flessen niet te vol voorbij de schouder van de fles om de uitzetting mogelijk te maken als de monsters moeten worden ingevroren.
2. Registreer relevante metagegevens, waaronder datum, tijd en GPS-locatie. Label voorbeeldcontainers.
3. Voeg 1 M natriumbicarbonaatoplossing toe aan elk monster en veld blanco. Voeg 10 ml per monster van 500 ml toe.
4. Sluit de flesjes af en meng.
5. Voeg 100 mM lanthaanchloride toe aan elk monster en veld blanco. Voeg 1 ml per monster van 500 ml toe.
6. Sluit af en meng grondig. Gebruik isolatietape om de dop vast te zetten.
7. Bewaar op ijs totdat ze naar het veldlaboratorium worden teruggebracht, waarna de monsters een nacht gekoeld en rechtop kunnen worden bewaard zodat de vlokken op de bodem van de container kunnen bezinken, of kunnen worden ingevroren bij -20 °C voor verzending naar een tweede laboratorium voor verdere verwerking. Monsters moeten rechtop worden ingevroren om de vloeistof te laten uitzetten en om te voorkomen dat de container scheurt.

3. Verwerking van vlokken

1. Ontdooi bevroren monsters bij kamertemperatuur in een koeler of verplaats monsters die niet zijn ingevroren naar een geschikte werkbank met een peristatische pomp en slangenopstelling voor het opzuigen van monstersupernatanten. Zorg ervoor dat de slangen die door de peristaltische pomp lopen, uitmonden in een grote emmer op de vloer. De inname moet zijn uitgerust met een schoon, plastic rietje om de inname te regelen.
2. Gebruik de peristaltische pomp om het bovenstaande te verwijderen door het rietje te gebruiken om de afzuiging eerst net onder het vloeistofoppervlak te richten en de inname van het rietje naar beneden te bewegen met het vloeistofniveau. Verwijder het laatste van het bovenstaande door de inlaat voorzichtig te verplaatsen om op de pontil te rusten (verhoogd kuiltje in de bodem van de fles). Dit zorgt voor een maximale vloeistofverwijdering terwijl vlokken zich rond de periferie verzamelen (zie figuur 1).

Figuur 1: Verzameling van vlokken die zich bij de zwaartekracht per eenheid bevinden. Vlokken die celmateriaal en eDNA bevatten, bevinden zich op de bodem van de monsterfles en zijn klaar om te worden teruggewonnen nadat het bovenstaande is verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Bevestig een schoon rietje en herhaal de verwijdering van het bovenstaande voor elk monster.
4. Gebruik een schone pipet van 20 ml en een pipetcontroller om de vlokkensuspensie volledig over te brengen naar een centrifugebuis van 50 ml. Gebruik spoelingen met gedeïoniseerd water met een laag volume (ongeveer 5 ml) om ervoor te zorgen dat eventuele resterende vlokken uit de monsterfles worden teruggewonnen.
5. Stel alle buizen van 50 ml in op gelijke volumes met gedeïoniseerd water en vang de vlokken op door centrifugeren op 2.500 x g gedurende 20 minuten.
6. Giet het bovenstaande af en laat de buisjes omgekeerd op een schone papieren handdoek staan om uit te lekken.
7. Resuspendeer vlokken in 1 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 door vortexmenging en voeg vervolgens 4 ml 1x TE-oplossing, pH 8,0 toe en meng opnieuw. Breng de geresuspendeerde vlokken over in een conische centrifugebuis van 15 ml, voeg 50 μl 10% lineair polyacrylamide en vortex toe. Voeg 5 ml 100% isopropanol toe, meng en laat 20 minuten op ijs staan.
8. Centrifugeer op 6.000 x g gedurende 20 minuten om DNA en cellulaire deeltjes te verzamelen. Giet supernatanten af en laat het omgekeerd op schoon keukenpapier staan om uit te lekken. Laat iets drogen, maar droog niet te lang.
9. Begin het vlok-DNA-extractieproces met behulp van een commerciële kit die gebruik maakt van kralenkloppen en spinkolombinding met een capaciteit van 25 μg.
   1. Resuspendeer eerst de vlokken in 800 μL van de lysisbuffer die bij de kit is geleverd en breng de suspensie volledig over op een druppelbuis. De kraal sloeg de vloksuspensie in korte tijd met koeling ertussen. Homogenaten kunnen op dit punt bevroren worden bewaard of doorgaan met het kitprotocol.
   2. Elueer het DNA uit de spinkolom eerst met 100 μL en recycle vervolgens het eluaat door de spinbuis.
   3. Eliseer ten slotte het resterende DNA uit de kolom met een extra aliquot van 100 μL elutiebuffer om een totaal volume van 200 μL te maken. Dit maximaliseert het herstel.
10. Verzamel, bereid en analyseer eDNA om de prestaties van dit protocol en de prestaties ervan ten opzichte van de veelgebruikte filtratiemethode aan te tonen.
    1. Bereid reacties voor die 1x qPCR-mastermix, 25 μg/ml rundertrombine^14,16, 0,4 μM voorwaartse en achterwaartse primers en 2 μL sjabloon (1% van het herstelde monster-DNA) bevatten. Construeer standaardcurven met behulp van seriële verdunningen van gezuiverde en gekwantificeerde PCR-amplicons gegenereerd met behulp van voucher-DNA. Als alternatief kunnen doelen commercieel worden gesynthetiseerd.
    2. Gebruik een vergelijkende kwantificeringsmethode als er geen standaard beschikbaar is. Voer bijvoorbeeld thermocycling uit met behulp van reactieomstandigheden van 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 10 s, 57 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 30 s, hoewel deze omstandigheden moeten worden aangepast voor andere tests. Analyseer de gegevens met behulp van de software van de fabrikant.

Resultaten

Acht watermonsters van 500 ml (elk 450 ml) uit een aquarium met twee oostelijke geschilderde schildpadden (Chrysemys picta picta) werden gebruikt om eDNA te bereiden met behulp van het beschreven protocol. Nog eens acht watermonsters van 500 ml werden gefilterd over 47 mm glasvezelfilters met een porositeit van 1,5 μm die geen bindmiddel bevatten en eDNA werd geëxtraheerd met behulp van dezelfde extractiemethode als gebruikt voor het flocculatieprotocol. DNA dat met beide method...

Discussie

Hoewel deze techniek eenvoudig is, zijn sommige stappen cruciaal voor succes. Het verzamelen en overbrengen van de vlokken moet volledig gebeuren om geen DNA te verliezen. Restmateriaal moet worden verzameld met behulp van strategische spoelingen. Het beschreven protocol maakt gebruik van een commerciële DNA-extractiekit voor de uiteindelijke verwerking van geflocculeerd materiaal. Andere extractiemethoden kunnen vergelijkbaar presteren of beter presteren, maar wijzigingen van dit deel v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.5M EDTA, pH 8.0	Beschikbaar bij verschillende commerciële bronnen
1 x TE Buffer, pH 8.0	Beschikbaar bij verschillende commerciële bronnen
15 ml Conische Centrifugeerbuizen	Voor eenmalig gebruik
16 oz. PET Heldere vierkante flessen	Herbruikbaar met reiniging en decontaminatie
38/400 Polypropyleendoppen met drukgevoelige voering	Laat de doppen losjes aan tot gebruik. Doe de dop stevig dicht om de drukgevoelige voering te verzegelen.
50 mL Conische Centrifugeerbuizen	Voor eenmalig gebruik
6% Citroenzuuroplossing	Gebruik om mineraalafzettingen uit herbruikbare monsterflessen te verwijderen.
Fecal/Soil Microbe Kit	Gebruik inhibitorverwijderingshars of kolom
Lanthaan (III) chloride heptahydraat	100 mM Stockoplossing
Peristaltiek DC-pomp	Elke peristaltische pomp is voldoende, of kan worden afgezogen
Polyacryl-drager	10% lineair polyacrylamide
Natriumbicarbonaat	1 M, gefilterd gesteriliseerd en op kamertemperatuur bewaard