In Situ Detectie van Ribonucleoprotein Complex Assembly in de C. elegans Germline met behulp van Proximity Ligation Assay

Samenvatting

Dit protocol toont het gebruik van de nabijheidsligatietest om te sonde voor eiwit-eiwitinteracties in situ in de C. elegans kiembaan.

Samenvatting

Begrijpen waar en wanneer eiwit-eiwit interacties (PPR's) optreden is van cruciaal belang voor het begrijpen van eiwitfunctie in de cel en hoe bredere processen zoals ontwikkeling worden beïnvloed. De Caenorhabditis elegans kiembaan is een geweldig modelsysteem voor het bestuderen van PPR's die gerelateerd zijn aan de regulering van stamcellen, meiose en ontwikkeling. Er zijn een verscheidenheid van goed ontwikkelde technieken die het mogelijk maken eiwitten van belang te worden gelabeld voor erkenning door standaard antilichamen, waardoor dit systeem voordelig voor nabijheid ligatie assay (PLA) reacties. Als gevolg hiervan is het PLA in staat om effectiever aan te tonen waar PPR's op een ruimtelijke en tijdelijke manier voorkomen in kiemlijnen dan alternatieve benaderingen. Hier beschreven is een protocol voor de toepassing en kwantificering van deze technologie om PPR's te sonde in de C. elegans kiembaan.

Inleiding

Meer dan 80% van de eiwitten wordt geschat op interacties met andere moleculen¹, die benadrukt hoe belangrijk PPR's zijn voor de uitvoering van specifieke biologische functies in de cel². Sommige eiwitten functioneren als hubs die de assemblage van grotere complexen vergemakkelijken die nodig zijn voor celoverleving¹. Deze hubs bemiddelen meerdere PPR's en helpen eiwitten te organiseren in een netwerk dat specifieke functies in een cel³faciliteert. Vorming van eiwitcomplexen wordt ook beïnvloed door biologische context, zoals de aanwezigheid of afwezigheid van specifieke interactiepartners^4,celsignaleringsgebeurtenissen en ontwikkelingsfase van een cel.

C. elegans wordt vaak gebruikt als een model organisme voor een verscheidenheid van studies, met inbegrip van ontwikkeling. De eenvoudige anatomie van dit dier bestaat uit verschillende organen, waaronder de gonad, darm en transparante nagelriem, die de analyse van wormontwikkeling vergemakkelijkt. De kiembaan die in de gonad is een geweldig hulpmiddel om te bestuderen hoe kiembaan stamcellen rijpen in gameten⁵ die zich ontwikkelen tot embryo's en uiteindelijk de volgende generatie van nakomelingen. Het distale tipgebied van de kiembaan bevat een pool van zelfvernieuwende stamcellen (Figuur 1). Als stamcellen de niche verlaten, gaan ze verder naar de meiotische pachytene en ontwikkelen ze zich uiteindelijk tot eicellen in het stadium van de jonge volwassene (Figuur 1). Dit programma van ontwikkeling in de kiembaan is strak geregeld door middel van verschillende mechanismen, met inbegrip van een post-transcriptie regelgevend netwerk vergemakkelijkt door RNA-bindende eiwitten (RBPs)⁶. PPR's zijn belangrijk voor deze regelgevende activiteit, omdat rbp's associëren met andere cofactoren om hun functies uit te oefenen.

Er zijn verschillende benaderingen die kunnen worden gebruikt om te sonde voor PPR's in de worm, maar elk heeft unieke beperkingen. In vivo immunoneerslag (IP) kan worden gebruikt om eiwit-eiwitcomplexen te isoleren uit hele wormextracten; Deze aanpak geeft echter niet aan waar de PPI in de worm voorkomt. Bovendien kunnen eiwitcomplexen die van voorbijgaande aard zijn en zich alleen vormen tijdens een specifiek ontwikkelingsstadium of in een beperkt aantal cellen, moeilijk te herstellen zijn door co-immunoprecipitatie. Ten slotte moeten IP-experimenten de zorgen van eiwitcomplex reassortiment na lyse en niet-specifieke retentie van eiwitten op de affiniteitsmatrix aanpakken.

Alternatieve benaderingen voor in situ detectie van PPR's zijn co-immunostaining, Förster resonantie energieoverdracht (FRET) en bimoleculaire fluorescentiecomplementatie (BiFC). Co-immunostaining is gebaseerd op gelijktijdige detectie van twee eiwitten die van belang zijn voor vast wormweefsel en het meten van de mate van signaalcolokalisatie. Het gebruik van super-resolutie microscopie, die meer detail biedt dan standaard microscopie⁷, helpt om eiwitcolokalisatie strenger te testen voorbij de diffractie-beperkte barrière van 200-300 nm⁸. Co-immunostaining met zowel conventionele als superresolutiemicroscopie werkt echter het beste voor eiwitten met goed gedefinieerde lokalisatiepatronen. Daarentegen wordt het veel minder informatief voor diffuus gedistribueerde interactiepartners. Het meten voor co-lokalisatie van signalen op basis van overlap geeft geen nauwkeurige informatie over de vraag of de eiwitten in complex met elkaar^9,10.

Bovendien zijn co-immunoneerslag en co-immunostaining van eiwit-eiwitcomplexen niet kwantitatief, waardoor het moeilijk is om te bepalen of dergelijke interacties significant zijn. FRET en BiFC zijn beide fluorescerende technieken. FRET vertrouwt op het taggen van eiwitten die van belang zijn met fluorescerende eiwitten (FPs) die spectrale overlap hebben waarbij energie van de ene FP (donor) wordt overgedragen naar een andere FP (acceptor)¹¹. Deze niet-stralingsoverdracht van energie resulteert in fluorescentie van de acceptor FP die kan worden gedetecteerd op de respectieve golflengte van de emissie. BiFC is gebaseerd op de reconstructie van een fluorescerend eiwit in vivo. Het houdt in dat GFP wordt opgesplitst in twee complementaire fragmenten, zoals helices 1-10 en helix 11¹², die vervolgens worden samengevoegd tot twee eiwitten van belang. Als deze twee eiwitten op elkaar inwerken, worden de complementaire fragmenten van GFP dicht genoeg in de nabijheid om te vouwen en te monteren, waardoor de GFP-fluorophore opnieuw wordt samengesteld. Gereconstitueerde GFP wordt dan direct geobserveerd als fluorescentie en geeft aan waar een PPI is opgetreden.

Als zodanig zijn zowel FRET als BiFC afhankelijk van grote fluorescerende tags die de functie van het gelabelde eiwit kunnen verstoren. Daarnaast hebben FRET en BiFC een overvloedige en vergelijkbare expressie van de gelabelde eiwitten nodig om nauwkeurige gegevens te verkrijgen. FRET is mogelijk niet geschikt voor experimenten waarbij de ene partner groter is dan de andere, wat kan leiden tot een hoge achtergrond¹³. Overexpressie in BiFC-experimenten moet ook worden vermeden, omdat dit niet-specifieke assemblage kan veroorzaken¹⁴ die resulteert in een verhoogde achtergrond. Beide technieken vereisen optimalisatie van expressie en beeldvorming svan de gelabelde eiwitten, die de tijd die nodig is om experimenten te voltooien kan verlengen.

De nabijheidsligatietest (PLA) is een alternatieve benadering die de beperkingen van de hierboven genoemde technieken kan aanpakken. PLA maakt gebruik van primaire antilichamen die de eiwitten van belang (of hun tags) herkennen. Deze primaire antilichamen worden dan gebonden door secundaire antilichamen die oligonucleotidesondes bevatten die met elkaar kunnen hybridiseren wanneer binnen een afstand van 40 nm (of kortere)¹⁵. Het resulterende gehybridiseerde DNA wordt versterkt door middel van een PCR-reactie, die wordt gedetecteerd door sondes die het DNA aanvullen. Dit resulteert in foci die worden gevisualiseerd door een microscoop. Deze technologie kan PPR's in situ detecteren in complexe weefsels (d.w.z. de wormgonad), die is georganiseerd als een assemblagelijn met cellen in verschillende stadia van ontwikkeling en differentiatie. Met PLA kunnen PPR's direct worden gevisualiseerd in een vaste wormgonad, wat voordelig is om te onderzoeken of PPR's optreden tijdens een specifieke ontwikkelingsfase. PLA biedt een betere resolutie van PPR's in tegenstelling tot co-lokalisatie-gebaseerde testen, die ideaal is voor het maken van nauwkeurige metingen. Indien gebruikt, super-resolutie microscopie heeft het potentieel om fijnere details over de locatie van PLA foci in een cel. Een ander voordeel is dat de foci als gevolg van PLA reacties kan worden geteld door een ImageJ-gebaseerde analyse workflow, waardoor deze techniek kwantitatief.

De LC8 familie van dynein lichtketens werd voor het eerst beschreven als een subunit van de dynein motor complex¹⁶ en veronderstelde om te dienen als een lading adapter. Sinds de eerste ontdekking is LC8 gevonden in meerdere eiwitcomplexen naast het dynein motorcomplex^17,18,19,20. Scannen op eiwitsequenties die het LC8-interactiemotief¹⁹ bevatten, suggereert dat LC8 veel interacties kan hebben met een breed scala aan verschillende eiwitten^{17,18,19,20,21,22}. Als gevolg hiervan worden LC8-gezinseiwitten nu beschouwd als hubs die de assemblage van grotere eiwitcomplexen helpen bevorderen^19,22, zoals samenstellingen van intrinsiek ongeordende eiwitten²¹.

Een C. elegans LC8-familie eiwit, dynein licht keten-1 (DLC-1), wordt op grote schaal uitgedrukt in vele weefsels en niet verrijkt in specifieke subcellulaire structuren^23,24. Bijgevolg is de identificatie van biologisch relevante in vivo partners van DLC-1 in C. elegans om een aantal redenen een uitdaging: 1) co-immunoneerslag geeft niet de weefselbron aan waar de interactie plaatsvindt; 2) een beperkte expressie van bepaalde partners of tijdelijke interacties kan het vermogen belemmeren om een interactie door co-immunoneerslag op te sporen; en 3) diffuse distributie van DLC-1 leidt tot niet-specifieke overlap met potentiële partnereiwitten door co-immunostaining. Op basis van deze uitdagingen is PLA een ideale aanpak voor het testen van in vivo interacties met DLC-1.

Eerder werd gemeld dat DLC-1 rechtstreeks interageert met en dient als een cofactor voor de RNA-bindende eiwitten (RBPs) FBF-2²³ en GLD-1²⁵. Ons werk ondersteunt het model van DLC-1 dat als hub-eiwit fungeert en suggereert dat DLC-1 een interactienetwerk faciliteert dat zich uitstrekt tot voorbij dynein^19,22. Met behulp van een GST pulldown test, een nieuwe DLC-1-interactie RBP genaamd OMA-1 is geïdentificeerd²⁶. OMA-1 is belangrijk voor de groei van de eicellen en de menotische rijping²⁷ en functioneert in combinatie met een aantal translationele repressors en activators²⁸. Hoewel FBF-2 en GLD-1 worden uitgedrukt in respectievelijk de stamcellen en meiotische pachytenegebieden, wordt OMA-1 diffuus uitgedrukt in de kiembaan van de meiotische pachytene via de eicellen²⁷ (figuur 1). Dit suggereert dat DLC-1 complexen vormt met RBPs in verschillende regio's van de gonad. Ook is gebleken dat de directe interactie tussen DLC-1 en OMA-1 waargenomen in vitro niet wordt hersteld door een in vivo IP. De PLA is met succes gebruikt als een alternatieve aanpak om deze interactie verder te bestuderen in de C. elegans kiembaan, en de resultaten suggereren dat PLA kan worden gebruikt om vele andere PPR's in de worm sonde.

Protocol

OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van C. elegans stammen waarin potentiële interactie partners zijn beide gelabeld. Het wordt sterk aanbevolen om een negatieve controlestam te gebruiken, waarbij van één gelabeld eiwit niet wordt verwacht dat het zal communiceren met een andere gelabelde kandidaat-interactiepartner. Hier werd GFP alleen gebruikt als een negatieve controle om de achtergrond te beoordelen, omdat DLC-1 naar verwachting niet zal communiceren met GFP in de worm. GFP-tagged OMA-1 werd gebruikt als de experimentele stam, omdat voorlopige gegevens wijzen op een interactie met DLC-1. Nematodenstammen die controle- en testeiwitten co-expressn met DLC-1 met 3xFLAG-gelabelde DLC-1 worden in deze tekst aangeduid als 3xFLAG::DLC-1; GFP en 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (stammen beschikbaar op aanvraag; meer informatie in respectievelijk De Tafel van Materialen). Hier worden de 3xFLAG- en GFP-tags gebruikt; andere tags mogen echter worden vervangen zolang hun antilichamen compatibel zijn met de PLA-kitreagentia.

1. Dierenverzorging

1. Houd wormen op nematodengroeimedium (NGM) platen die zijn gezaaid met de OP50-stam van E. coli en handhaven op 24 °C voor een optimale expressie van GFP.
2. Passage volwassen wormen elke 2-3 dagen om wormen te verspreiden en houd ze goed gevoed.

2. Voorbereiding van synchrone cultuur

1. Synchroniseer wormen door het bleken van een plaat van goed gevoede, gravid hermafrodieten. Een bleekprotocol wordt beschreven in Porta-de-la-Riva et al.²⁹. Laat de embryo's 's nachts uitkomen in een centrifugebuis bij 24 °C terwijl ze eind over eind draaien in een m9 minimale mediabuffer (M9). Dit zal leiden tot een cultuur van gearresteerde L1 larven.
2. Incubeer de buis van gearresteerde L1-podiumlarven gedurende 10 min op ijs en vul vervolgens de buis af met ijskoud 1x M9.
3. Gebruik een centrifuge om de larven op 600 x g te korrels voor 5 min bij 4 °C. Voorzichtig aanzuigen de supernatant, zodat slechts 1-2 mL van supernatant blijft.
4. Hang de pellet van larven opnieuw op en gebruik een micropipet om 2 μL van zwevende larvencultuur over te brengen naar een glazen glijbaan. Tel hoeveel larven aanwezig zijn om de dichtheid van de larvencultuur te bepalen, wat zal helpen bij het begeleiden van het zaaien van de wormen in stap 2.5.
   LET OP: Een dichtheid van 10-15 L1 larven/1 μL werkt goed voor zaaien.
5. Gebruik een micropipet om het volume van larvencultuur over te brengen dat nodig is om ongeveer 100-120 L1-faselarven op een 60 mm OP50-plaat te zaaien. Bijvoorbeeld zaad 10 μL van een larvencultuur met een dichtheid van 10 L1 larven/1 μL cultuur.
   OPMERKING: Niet meer dan een volume van 40 μL om de larven te zaaien, of overtollige vloeistof zal het OP50-gazon verstoren. Als het kweekvolume meer dan 40 μL overschrijdt, herhaalt u stap 2.3-2.4 om het volume verder te verminderen en de dichtheid van de larvencultuur te verhogen.
6. Kweek wormen bij 24 °C. Noteer het tijdstip waarop L1's op plaat worden gezaaid en controleer periodiek het ontwikkelingsstadium om de ideale tijd voor dissectie te identificeren.
   OPMERKING: Bij 52 uur na het zaaien van L1's, wormen gekweekt op 24 °C zijn meestal in de jonge volwassen stadium, dat is het ideale stadium voor dissectie voor gonad-gerichte PLA. Echter, de werkelijke tijd waarop de gesynchroniseerde wormen bereiken jonge volwassen stadium kan variëren tussen stammen en incubatietemperatuur.

3. Dissection/gonad extrusie

OPMERKING: Dissectie om de gonad te extruderen is noodzakelijk voor gonad-gerichte PLA om succesvol te werken. Deze aanpak kan ook embryo's vrijgeven, die ook werken met behulp van dit protocol voor PLA (zie Discussie voor meer informatie). Na dissectie worden zowel de negatieve controle als de experimentele monsters tegelijkertijd voor PLA bevestigd en behandeld. Er wordt ook voorgesteld dat een extra set van monsters worden voorbereid met het oog op fluorescerende co-immunostaining²³ om expressiepatronen van de eiwitpartners van belang aan te tonen.

1. Kies 30-40 jonge volwassen wormen in een horlogeglazen schaal met 500 μL van 1x M9 + levamisole (2,5 mM eindconcentratie). Na het verzamelen van de wormen, zorgvuldig verwijderen en weggooien van de meeste van de media om bacteriën die wordt overgedragen samen met de wormen te verwijderen.
2. Voeg er verse 500 μL van 1x M9 + levamisole aan toe en gebruik de pipet om de media voorzichtig op te stellen en uit te delen om de wormen te spoelen. Verwijder en gooi de meeste media voorzichtig weg om bacteriën te verwijderen die samen met de wormen worden overgedragen.
   1. Herhaal deze stap 2x-3x totdat alle bacteriën zijn verwijderd. Nadat wasbeurten zijn voltooid, laat wormen in ongeveer 100 μL media gehydrateerd.
      LET OP: Laat de wormen niet langer dan 7 min in de media zitten, omdat dit de extrusie van geslachtsklieren tijdens dissectie zal aantasten. Voer wasbeurten uit onder behulp van het ontleden van microscoop om de verwijdering van media te controleren, zodat wormen niet verloren gaan.
3. Breng wormen met behulp van een glazen of polyethyleenpipet over naar een microscoopdia van 25 mm x 75 mm, bekleed met 0,001% poly-L-lysine (dia's die in deze procedure worden gebruikt, hebben een met epoxy bedekte omtrek, waardoor drie werkruimten overblijven, elk 14 mm x 14 mm). Verwijder overtollige media, zodat ongeveer 10-15 μL van de media blijft.
4. Plaats onder behulp van een ontledende microscoop en met behulp van twee 261/2 meter naalden, plaats een naald over de andere, zodat de uiteinden vormen een schaar. Met behulp van naalden georiënteerd op deze manier, gesneden wormen achter de keelholte om de kiemlijnen vrij te geven. Ontleed alle wormen binnen 5 minuten.
   OPMERKING: Meer details over het uitvoeren van dissecties zijn te vinden in een eerdere publicatie van Gervaise en Arur³⁰.
5. Nadat alle wormen zijn ontleed, plaats u voorzichtig een coverslip van 22 mm x 40 mm over de glijbaan, zodat deze loodrecht op de glijbaan staat. De uiteinden van het uitglijder moeten aan de dia hangen.
6. Bevries de dia's op een voorgekoeld aluminiumblok dat ten minste 20 min op droogijs wordt gehouden. Plaats voorzichtig een gekoeld potlood op de bovenkant van de afdekkingom te voorkomen dat de afdekking losraakt als gevolg van ijsuitzetting.

4. Fixatie/blokkering

1. Wanneer u klaar bent voor fixatie, veegt u de afdekkingslippen af met een potlood of een ander stomp gereedschap en dompelt u de dia onmiddellijk in een pot met verse, ijskoude methanol (gekoeld tot -20 °C) gedurende 1 min.
2. Veeg voorzichtig de randen van de dia die het monster omringen, zodat het volgende reagens wordt vastgehouden door oppervlaktespanning rond het monster. Breng 150 μL fixatief (2% formaldehyde in 100 mM KH₂PO_4, pH = 7,2) aan gedurende 5 min bij RT.
   OPMERKING: We hebben ook een methanol/aceton fixatieprocedure^31,32 getest en vastgesteld dat deze compatibel is met de PLA-reactie.
3. Raak de schuif aan op een papieren handdoek met een loodrechte hoek van 90° om de fixatieve van de glijbaan te laten lopen en in de papieren handdoek te absorberen. Blok schuift 2x voor 15 min bij RT in een Coplin pot met 50 mL van 1x PBS/1% Triton X-100/1% runderserum albumine (PBT/BSA).
   OPMERKING: Coplin potten of andere soorten kleurpotten worden aanbevolen voor deze blokkering stap en de wasstappen hieronder in secties 6-9. Deze bieden voldoende volumes voor een efficiënte uitwisseling van blokkeringof wasbuffer met het monster.
4. Blokglijbanen met een PBT/BSA-oplossing die 10% normaal geitenserum bevat. Veeg voorzichtig randen die de dia omringen en breng 100 μL van de oplossing aan op de dia. Incubeer gedurende 1 uur bij RT in een vochtige kamer.
   OPMERKING: Deze stap wordt ten zeerste aanbevolen voor vlekken met het primaire antilichaam αFLAG. De vochtige kamer is gebouwd door het vastzetten van glazen pipetten met tape in de lade voor de dia's te leggen op als ze uitbroeden. Gedempte taakdoekjes (Tabel van materialen) worden geplaatst in de lade om de interne vochtigheid van de lade te verhogen om verdamping te voorkomen. Het deksel en de lade zijn bedekt met folie om de monsters te beschermen tegen licht tijdens de lichtgevoelige stappen.
5. Plaats schuif op een papieren handdoek om PBT/BSA/10%NGS-oplossing van de glijbaan te laten lopen en veeg de randen van de dia voorzichtig af. Gebruik het blokkeringsreagens (Tabel van materialen) om dia's te blokkeren. Breng één druppel aan op de ruimte van 14 mm x 14 mm. Incubeer glijbanen gedurende 1 uur bij 37 °C in een vochtige kamer.

5. Primaire antilichaamincubatie

OPMERKING: Om de beste PLA-resultaten en minimale achtergrond te verkrijgen, kan de verdunningsfactor van de primaire antilichamen optimalisatie vereisen (zie Discussie voor meer details). Bovendien moeten de primaire antilichamen worden verhoogd in verschillende hosts die overeenkomen met de specificiteit van de secundaire antilichamen die voor PLA worden gebruikt.

1. Plaats schuif op een papieren handdoek te laten blokkeren reagens lopen van de dia en voorzichtig veeg de randen. Gebruik het antilichaamverdunningsmiddel (Tabel van materialen) om de primaire antilichamen te verdunnen. Breng 40 μL primaire antilichaamoplossing aan per ruimte van 14 mm x 14 mm.
2. Incubeer glijbanen in een vochtige kamer 's nachts bij 4 °C.

6. PLA-sonde (secundair antilichaam) incubatie

OPMERKING: Gebruik voor stap 6-9 wasbuffers A en B bij RT. Als de buffers bij 4 °C worden opgeslagen, laat ze dan opwarmen voor RT voordat ze worden gebruikt.

1. Was glijbanen 2x voor 5 min met 50 mL van 1x wasbuffer A (Table of Materials) bij RT in een Coplin pot. Zet de Coplin pot op een orbitale shaker ingesteld op 60 rpm.
2. Plaats schuif op een papieren handdoek te laten wassen buffer lopen uit de dia en voorzichtig veeg de randen. Bereid een 40 μL-oplossing voor die PLUS- en MINUS-sondes bevat (verdund met antilichaamverdunningsmiddel). Breng de oplossing aan op elke ruimte van 14 mm x 14 mm.
3. Incubeer glijbanen in een vochtige kamer gedurende 1 uur bij 37 °C.

7. Ligatie

1. Was dia's 2x voor 5 min met 50 mL van 1x wasbuffer A bij RT in een Coplin pot. Zet de Coplin pot op een orbitale shaker ingesteld op 60 rpm.
2. Verdun de ligatiebuffer (Tabel van materialen) 1:5 met ultrazuiver water. Gebruik deze buffer om de ligase (Tabel van materialen) 1:40 te verdunnen om een werkvoorraad ligatieoplossing voor te bereiden.
   1. Plaats de schuif op een papieren handdoek om de wasbuffer van de glijbaan af te laten lopen en de randen voorzichtig af te vegen. Breng 40 μL van de ligatieoplossing aan op elke ruimte van 14 mm x 14 mm.
3. Incubeer glijbanen in een vochtige kamer gedurende 30 min bij 37 °C.

8. Versterking

OPMERKING: Het gebruik van detectiereagentia met rode fluorophores (Tabel van materialen) resulteert in de minste hoeveelheid achtergrond in C. elegans weefsel.

1. Was dia's 2x voor 5 min met 50 mL van 1x wasbuffer A bij RT in een Coplin pot. Zet de Coplin pot op een orbitale shaker ingesteld op 60 rpm.
2. Verdun de versterkingrode buffer (Tabel van materialen)1:5 met ultrazuiver water. Gebruik deze buffer om de polymerase (Table of Materials)1:80 te verdunnen om een werkvoorraad versterkingsoplossing voor te bereiden en te beschermen tegen licht.
   1. Plaats de schuif op een papieren handdoek om de wasbuffer van de glijbaan af te laten lopen en de randen voorzichtig af te vegen. Breng 40 μL van de versterkingsoplossing aan op elke ruimte van 14 mm x 14 mm.
3. Incubeer glijbanen in een vochtige kamer gedurende 1 uur en 40 min bij 37 °C. Zorg ervoor dat de vochtige kamer is bedekt met folie om de monsters te beschermen tegen licht.

9. Laatste wasbeurten

1. Was glijbanen 2x voor 10 min met 50 mL van 1x wasbuffer B (Table of Materials)bij RT in een Coplin pot. Zet de Coplin pot op een orbitale shaker ingesteld op 60 rpm.
2. Was glijbanen 1x voor 1 min met 50 mL van 0,01x wasbuffer B bij RT in een Coplin pot. Zet de Coplin pot op een orbitale shaker ingesteld op 60 rpm. Deze buffer wordt bereid door wasbuffer B te verdunnen met ultrazuiver water.

10. Bevestiging

1. Laat de overtollige wasbuffer van de schuif op een papieren handdoek lopen en veeg eventuele resterende buffer af op de met epoxy bedekte omtrek van de dia.
2. Voeg 10 μL montagemedium (Tabel van materialen) toe aan het monster en leg er voorzichtig een coverslip op, waardoor het montagemedium zich kan verspreiden.
3. Verf rond de rand van coverslip met nagellak om de coverslip te verzegelen en te glijden. Wees voorzichtig met het aanbrengen van nagellak om te voorkomen dat het verplaatsen van de coverslip, die de kiemnagels zal beschadigen. Laat de nagellak ten minste 20 minuten uitharden bij RT, terwijl dia's tegen licht worden beschermd, voordat u het onder een microscoop bekijkt.
4. Bewaar dia's in een donkere container of diahouder, omdat PLA-gelabelde monsters lichtgevoelig zijn. De fabrikant stelt voor dat glijbanen kunnen worden opgeslagen bij -20 °C voor langdurige opslag of bij 4 °C voor opslag op korte termijn. Dia's die met dit protocol zijn voorbereid, duren ten minste 2 maanden wanneer ze bij 20 °C worden opgeslagen.

11. Beeldverwerving

1. Gebruik met het oog op kwantificering een confocale microscoop om beelden vast te leggen van geëxtrudeerde kiemlijnen die in helder zicht, onbeschadigd en onbelemmerd zijn. Leg een z-stack van de kiembaan vast die de hele kiembaan in het z-vlak omspant en genereer een maximaal projectiebeeld dat je gebruiken voor kwantitatie.
   OPMERKING: Confocale microscopie is ideaal voor het verkrijgen en kwantificeren van PLA-beelden met minder achtergrond in vergelijking met die verkregen met behulp van een epifluorescerende microscoop.
   1. Als de kiembaan niet in één gezichtsveld past, legt u de overlappende gezichtsvelden vast als dat nodig is om de hele kiembaan weer te geven. Maximale projecties van deze beelden kunnen in FIJI aan elkaar worden genaaid.
2. Zorg ervoor dat beeldvormingscondities hetzelfde blijven tussen controle en experimentele monsters om een eerlijke en juiste drempel voor de identificatie van foci tijdens beeldanalyse in te stellen.
   OPMERKING: Noteer ten minste 8-10 kiemlijnen van elk monster per replicatie om statistische analyse van PLA-kwantificering te vergemakkelijken. Ten minste drie biologische replicaties worden aanbevolen voor PLA om betrouwbare en consistente kwantitatieve resultaten te verkrijgen.

12. Beeldanalyse en kwantificering met behulp van FIJI/ImageJ

OPMERKING: De volgende workflow is gebaseerd op afbeeldingen die zijn verkregen met behulp van de 40x-doelstelling op een confocale microscoop, waarin afbeeldingen worden opgeslagen in het CZI-formaat. Deze .czi-afbeeldingen en de bijbehorende metadata, inclusief afmetingen, kunnen worden geopend in FIJI/ImageJ voor verdere analyse. Er moet worden nagegaan of FIJI het formaat van confocale bestanden van de confocale bestanden accepteert die beschikbaar zijn voor de specifieke gebruiker. Zo niet, dan kunnen afbeeldingen in de .tiff-indeling alternatief worden gebruikt voor analyse, maar moet de gebruiker de schaal van de afbeelding handmatig instellen in FIJI/ImageJ (Analyseren | Schaal instellen). Het wordt aanbevolen dat alle negatieve controlebeelden eerst samen worden geanalyseerd om het achtergrondniveau vast te stellen.

1. Start de analyseworkflow door eerst alle negatieve controlebeelden te analyseren en vervolgens verder te gaan naar de experimentele voorbeelden. Open een maximale projectieafbeelding in FIJI/ImageJ om te analyseren (figuur 2A). Als u een .czi-bestand gebruikt, wordt een vak Voor het importeren van bio-indelingen gevraagd.
   1. Neem de volgende opties op om uw afbeelding te openen: stapel weergeven met gegevensbrowser; kleurmodus = kleur . Er moet nu een venster met de afbeelding worden geopend met een diabalk om te schakelen tussen verschillende kanalen die zijn vastgelegd door confocale kanalen (bijvoorbeeld DAPI of PLA).
   2. Als afbeeldingen moeten worden gestikt, maakt u duplicaten van elk kanaal van elke afbeelding door de afbeelding met de muis met de rechtermuisknop te selecteren en Duplicaat te selecteren om het venster Dupliceren te openen. Geef alleen het kanaalnummer (c) op dat overeenkomt met het PLA- of DAPI-kanaal (bijvoorbeeld 2)en schakel het selectievakje voor Dubbele Hyperstackuit.
   3. Als beide afbeeldingen open gestikt moeten worden, selecteert u Plug-ins | Stiksels | Afgeschaft | 2D stiksels. Er wordt een venster Stitching of 2D Images geopend. Selecteer welke afbeeldingen worden gebruikt voor het naaien en gebruik de standaardparameters die vooraf zijn ingesteld in het venster en selecteer Vervolgens Ok. De resulterende afbeelding is een geassembleerde grijswaardenafbeelding.
      OPMERKING: Als de subbeelden niet perfect uitlijnen, worden parameters aangepast (d.w.z. het aantal pieken verhogen dat moet worden gecontroleerd van 5 naar 500 of het wijzigen van de fusiemethode van Lineair overvloeien naar Max. Intensiteit) kan helpen om het gewenste beeld te verkrijgen. Terwijl andere stiktools beschikbaar zijn, behoudt deze aanpak de dimensionaliteit van het beeld, wat belangrijk is voor kwantificering.
2. Open de MANAGER ROI (Regio van Belang) door op T op het toetsenbord te drukken. Er wordt een nieuw venster geopend met de naam ROI Manager.
3. Selecteer het veelhoekgereedschap in het gereedschapssetvan FIJI. Drop punten rond de kiembaan om het te schetsen en het genereren van een ROI (Figuur 2B). Sluit de laatste stip aan op de eerste om een volledige ROI te genereren.
   OPMERKING: Voor donkere beelden is het handig om het contrast aan te passen om de zichtbaarheid van de kiembaan te verbeteren (wat omkeerbaar is), zodat deze nauwkeuriger kan worden geschetst.
   1. Ga onmiddellijk na het voltooien van de ROI naar de ROI-manager en selecteer Toevoegen [t] om de ROI op te slaan. Het is absoluut noodzakelijk dat eventuele wijzigingen in de ROI, waaronder het toevoegen/verwijderen van punten of verplaatsing van de ROI en punten worden bijgewerkt (selecteer Bijwerken van ROI-manager) voordat u doorgaat naar de volgende stap, of ze zullen verloren gaan. Verdere details over manipulatie van ROI's en hun punten zijn te vinden in de FIJI / ImageJ User Guide.
4. Zodra de ROI-oriëntatie is ingesteld, kan deze worden opgeslagen voor latere verwijzing door de ROI-naam in de ROI-manager te selecteren, gevolgd door Meer | Behoudens | (naambestand en geef bestemming op voor waar op te slaan). Opgeslagen ROI's kunnen worden geopend in de ROI-manager door Meer | Open | (selecteer het bestand).
5. Meet het gebied binnen de ROI door de ROI-naam te selecteren in de ROI-manager en selecteer vervolgens de knop Meten op de ROI-manager. Er wordt een resultatenvenster geopend met informatie over de ROI, inclusief het gebied dat het beslaat in de afbeelding (μM²) (begin van figuur 2B). Noteer deze informatie in een spreadsheet voor volgende berekeningen.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de schaal van de afbeelding goed is ingesteld, zodat de juiste afmetingen van de ROI worden verzameld. De soorten metingen die in het vak Resultaten worden gerapporteerd, kunnen worden gewijzigd door te gaan analyseren | Stel metingen in....
6. Open een dubbele afbeelding van alleen het PLA-kanaal door de PLA-afbeelding met de rechtermuisknop te selecteren en Duplicaat (figuur 2C )te selecteren. Er wordt een venster Dupliceren geopend. Geef alleen het kanaalnummer (c) op dat overeenkomt met het PLA-kanaal (bijvoorbeeld 2) en schakel het selectievakje voor Dubbele Hyperstack uit. Duplicatie van deze afbeelding wordt aanbevolen, zodat de oorspronkelijke afbeelding niet wordt gewijzigd.
   OPMERKING: Deze opties worden alleen weergegeven bij het bekijken van de afbeeldingen met meerdere kanalen op FIJI/ImageJ. Een alternatieve benadering is het splitsen van de kanalen Image | Kleur | Splitkanalen,maar dit zal uw oorspronkelijke afbeeldingbestand wijzigen.
7. Als alleen de afbeelding van het PLA-kanaal is geselecteerd, gaat u naar Afbeelding | Aanpassing | Drempel . Er wordt een drempelvenster voor de afbeelding geopend. Selecteer Standaard als drempelmethode, Rood als kleur en schakel het selectievakje Donkere achtergrond in. Met behulp van de bovenste track op het venster, schuif de balk naar rechts totdat alle PLA foci zijn duidelijk gemarkeerd in de afbeelding.
   1. Noteer de waarde in het vak rechts van het bovenste spoor en noteer welke waarde is gebruikt om de drempelwaarde in te stellen. Selecteer Toepassen in het venster Drempelwaarde om de drempelwaarde af te ronden en de afbeelding wordt omgezet in een witte achtergrond met alleen de drempelfoci zichtbaar als zwarte stippen(figuur 2D). Test de drempel waarde op verschillende negatieve controlebeelden om ervoor te zorgen dat het geschikt is voor het vastleggen van alle PLA-foci van afbeelding naar afbeelding voordat u quantitatie.
      OPMERKING: Als u drempelfoci als zwarte stippen op de witte achtergrond wilt weergeven, gaat u naar Proces | Binair | Opties... en schakel het vakzwarte achtergrond uit. Een drempelwaarde tussen 30-40 is een goed uitgangspunt voor het identificeren van PLA in de kiembaan; de ideale waarde kan echter variëren afhankelijk van de achtergrond.
8. Als u de PLA-foci wilt kwantificeren, past u de VANUIT stappen 12.3-12.3.1 gegenereerde ROI-foci toe op de drempelafbeelding door de ROI-naam te selecteren in het venster ROI-manager. De omtrek van de ROI moet op de afbeelding op dezelfde locatie worden weergegeven als uit de bronafbeelding(figuur 2E).
   1. Ga naar Analyseren | Analyseren Deeltjes. Het venster Deeltjes analyseren wordt geopend en selecteert de volgende parameters: grootte (micron^2) = 0-Oneindigheid, circulariteit = 0,00-1,00, show = Niets. Schakel het selectievakje Samenvatten in.
   2. Selecteer Oken er verschijnt een overzichtstabel met informatie over de ROI (d.w.z. het totale aantal PLA-foci, het totale aantal PLA-foci dat door de PLA-foci binnen in de ROI is bezet, de gemiddelde grootte van de PLA-foci en het percentage van het gebied dat door PLA foci wordt bezet ten opzichte van de grootte van de ROI) (begin van figuur 2E). Neem deze metingen op in een spreadsheet.
9. Herhaal stap 12.1-12.8 voor verschillende negatieve controleafbeeldingen met dezelfde drempelwaarde.
   1. Zodra alle negatieve controlebeelden zijn geanalyseerd, herhaalt u stap 12.1-12.8 voor alle experimentele monsters met dezelfde drempel die werd bepaald door de negatieve controle om PLA foci te identificeren en te kwantificeren.

Resultaten

Co-immunostaining van beide 3xFLAG::DLC-1; GFP en 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-kiemlijnen met FLAG- en GFP-antilichamen onthulden hun expressiepatronen in de kiembaan (figuur 3Aii-iii,3Bii-iii). Terwijl GFP werd uitgedrukt in de kiembaan (figuur 3Aiii), OMA-1::GFP expressie was beperkt tot de late pachytene en eicellen (Figuur 3Biii)^27...

Discussie

Bij het bestuderen van PPR's in de C. elegans kiembaan, de hogere resolutie aangeboden door PLA in vergelijking met co-immunostaining maakt visualisatie en kwantificering van locaties waar interacties optreden in de kiembaan. Eerder werd gemeld dat DLC-1 rechtstreeks intera-1 met behulp van een in vitro GST pulldown test²⁶; deze interactie werd echter niet hersteld door een in vivo pulldown. De fluorescerende co-immunostaining van 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP kiemlijnen vertoont een...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
16% paraformaldehyde oplossing	Elektronenmicroscopiediensten	15710	wordt gebruikt om 4% werkoplossing te maken
1M KH2PO4	Sigma	P0662	Maak een 1M werkvoorraad
1x M9	verschillende	verschillende	bereid als 10x voorraad, gebruikt bij 1x; zie wormbook.org voor protocol
1x PBS	verschillende	verschillende	zie wormbook.org voor protocol
26.5 Gauge Naald	Exel International	26402	Naalden gebruikt voor dissectie
BSA	Lampire	7500802
Centrifugebuizen	Thermo Scientific	05-529C	50ml Oak ridge centrifugebuis gebruikt voor synchronisatie
Confocale Microscoop	Zeiss	880
Coplin-pot	PolyLab	62101
Dekglas om Monster te Bevriezen	Globe Scientific	1411-10	22x40mm, No. 1
Dekglas om Dia te Verzegelden	Globe Scientific	1404-15	22x22mm, No. 1.5
DAPI Montage Medium voor Immunofluorescentie	Vector	H-1200
Ligase	Sigma-Aldrich	DUO82029	Duolink 1x Ligase, Komt als onderdeel van de Duolink In Situ Detectiereagentia Red kit DUO92008
Amplificatie rode buffer	Sigma-Aldrich	DUO82011	Duolink 5x Amplificatie Rode buffer, Komt als onderdeel van de Duolink In Situ Detectiereagentia Red kit DUO92008
Ligatie Buffer	Sigma-Aldrich	DUO82009	Duolink 5x Ligatie buffer, Komt als onderdeel van de Duolink In Situ Detectiereagentia Red kit DUO92008
Antilichaam Diluent	Sigma-Aldrich	DUO82008	Duolink antilichaam diluent,Komt met DUO92004 en DUO92002, Opmerking: Een 1x PBS/1% BSA oplossing kan ook worden gebruikt als alternatief om het antilichaam te verdunnen.
Blocking Solution	Sigma-Aldrich	DUO82007	Duolink blokkeringsoplossing, Komt met DUO92004 en DUO92002
Montage Medium voor PLA	Sigma-Aldrich	DUO82040	Duolink In Situ montage medium met DAPI
MINUS Probe	Sigma-Aldrich	DUO92004	Duolink In Situ Probe Anti-Muis MINUS
PLUS Probe	Sigma-Aldrich	DUO92002	Duolink In Situ Probe Anti-Konijn PLUS
Wash Buffer A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink In Situ wash Buffer A
Wash Buffer B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink In Situ wash Buffer B
Polymerase	Sigma-Aldrich	DUO82030	Duolink Polymerase, Komt als onderdeel van de Duolink In Situ Detectiereagentia Red kit DUO92008
Epifluorescente Microscoop	Leica		DFC300G camera, DM5500B microscoop
Geit anti-muis Alexa 594	JacksonImmuno	115-585-146	Gebruik bij 1:500
Geit anti-konijn Alexa 488	JacksonImmuno	111-545-144	Gebruik bij 1:200
Beeldverwerkingssoftware	Adobe		Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Glas Pipet	Corning	7095B-5X
Levamisol	ACROS Organics	187870100	Bereid een 250mM werkvoorraad
Methanol	Fisher Scientific	A454
Muis anti-FLAG	Sigma	F1804	Gebruik bij 1:1000 voor immunofluorescentie en PLA, pre-blokkeren met normaal geitenserum aanbevolen
Nailpolish	L.A. colors	CNP195
Nematoden Groei Medium (NGM)	verschillende		Zie wormbook.org voor protocol
Normaal Geitenserum	JacksonImmuno	005-000-121
Polyethyleen Pasteur Pipet	Globe Scientific	135030
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P1524	Bereid als 0.1% voorraadoplossing in water, bewaard bij -20C, en verdund 1:100 in water om dia's te coaten
Petrischalen	Tritech	PD7060	60 mm diameter
Konijn anti-GFP	Thermo Fisher	G10362	Gebruik bij 1:200 voor immunofluorescentie, 1:4000 voor PLA
Dia's	Thermo Fisher	30-2066A-Brown	Driehoekige 14x14mm autoclaveerbare dia's met staven worden op maat besteld via Fisher Scientific. Poly-L-Lysine wordt in het lab toegevoegd aan dia's
Natriumhypochlorietoplossing	Fisher Scientific	SS290-1
task wipes	Kimtech	34120	4.4x8.4 inch task wipes
Schalen (242x241x20mm)	Thermo Fisher	240845	Gebruikt om vochtige kamer te maken
Triton X-100	ACROS Organics	327372500
Ultrazuiver water	Milli-Q		Ultrazuiver water verkregen van Milli-Q Integral Water Purification System
Waagschaal	Carolina Biological	742300
-20 °C vriezer
-80 °C vriezer
Aluminiumfolie
OP50 stam E. coli
Orbitale Shaker
Lint
Nematodenstammen gebruikt in deze studie (beide beschikbaar op aanvraag)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]		UMT 376	dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::d