We presenteren een vrij beschikbare workflow gebouwd voor snelle verkenning en nauwkeurige analyse van cellulaire lichamen in specifieke celcompartimenten in fluorescentiemicroscopie beelden. Deze gebruiksvriendelijke workflow is ontworpen op de open-source software Icy en maakt ook gebruik van ImageJ functionaliteiten. De pijplijn is betaalbaar zonder kennis van beeldanalyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Substructuur Analyzer: Een gebruiksvriendelijke workflow voor snelle verkenning en nauwkeurige analyse van cellulaire lichamen in fluorescentiemicroscopie beelden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het laatste decennium werd gekenmerkt door doorbraken in fluorescentie microscopie technieken geïllustreerd door verbetering van de ruimtelijke resolutie, maar ook in live-cel beeldvorming en high-throughput microscopie technieken. Dit leidde tot een constante toename van de hoeveelheid en complexiteit van de microscopiegegevens voor één experiment. Omdat handmatige analyse van microscopiegegevens zeer tijdrovend, subjectief is en kwantitatieve analyses verbiedt, wordt automatisering van bioimageanalyse bijna onvermijdelijk. We bouwden een informatica workflow genaamd Substructure Analyzer om de signaalanalyse volledig te automatiseren in biobeelden van fluorescerende microscopie. Deze workflow is ontwikkeld op het gebruiksvriendelijke open-source platform Icy en wordt aangevuld met functionaliteiten van ImageJ. Het omvat de voorbewerking van beelden om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, de individuele segmentatie van cellen (detectie van celgrenzen) en de detectie/kwantificering van cellichamen verrijkt in specifieke celcompartimenten. Het belangrijkste voordeel van deze workflow is om complexe bio-imaging functionaliteiten voor te stellen aan gebruikers zonder kennisanalyse expertise via een gebruiksvriendelijke interface. Bovendien is het zeer modulair en aangepast aan verschillende kwesties van de karakterisering van nucleaire / cytoplasmische translocatie aan de vergelijkende analyse van verschillende cellichamen in verschillende cellulaire substructuren. De functionaliteit van deze workflow wordt geïllustreerd door de studie van de Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) voorwaarden. Gegevens van fluorescentiemicroscopie tonen aan dat hun integriteit in menselijke cellen een paar uur na de inductie van OS wordt beïnvloed. Dit effect wordt gekenmerkt door een afname van coilin nucleatie in karakteristieke Cajal Bodies, geassocieerd met een nucleoplasmische herverdeling van coilin in een verhoogd aantal kleinere foci. De centrale rol van coilin in de uitwisseling tussen CB-componenten en het omringende nucleoplasma suggereert dat os-geïnduceerde herverdeling van coilin de samenstelling en de functionaliteit van Cajal Bodies kan beïnvloeden.
Inleiding
Lichte microscopie en, meer in het bijzonder, fluorescentiemicroscopie zijn robuuste en veelzijdige technieken die vaak worden gebruikt in de biologische wetenschappen. Ze geven toegang tot de precieze lokalisatie van verschillende biomoleculen zoals eiwitten of RNA door hun specifieke fluorescerende etikettering. Het afgelopen decennium is gekenmerkt door snelle vooruitgang in microscopie en imaging technologieën zoals blijkt uit de 2014 Nobelprijs voor de Scheikunde toekenning Eric Betzig, Stefan W. Hell en William E. Moerner voor de ontwikkeling van super-resolved fluorescentie microscopie (SRFM)1. SFRM omzeilt de diffractielimiet van tradit....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
LET OP: Gebruiksvriendelijke tutorials zijn beschikbaar op de website van Icy http://icy.bioimageanalysis.org.
1. Download Icy en het Substructure Analyzer protocol
- Download Icy van de Icy website(http://icy.bioimageanalysis.org/download) en download het Substructure Analyzer protocol: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
OPMERKING: Als u een 64-bits besturingssysteem gebruikt, moet u de 64-bits versie van Java gebruiken. Deze versie maakt het mogelijk om het geheugen toegewezen a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Alle beschreven analyses zijn uitgevoerd op een standaard laptop (64-bits, quad-core processor op 2,80 GHz met 16 GB random-access memory (RAM)) werken met de 64-bits versie van Java. Random-access geheugen is een belangrijke parameter om rekening mee te houden, afhankelijk van de hoeveelheid en de resolutie van beelden te analyseren. Met behulp van de 32-bits versie van Java beperkt het geheugen tot ongeveer 1300 MB, die ongeschikt zou kunnen zijn voor big data-analyse, terwijl de 64-bits versie maakt het verhogen van h.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een toenemend aantal vrije software tools zijn beschikbaar voor de analyse van fluorescentie celbeelden. Gebruikers moeten correct kiezen voor de adequate software op basis van de complexiteit van hun problematische, om hun kennis in beeldverwerking, en de tijd die ze willen doorbrengen in hun analyse. Icy, CellProfiler of ImageJ/Fiji zijn krachtige tools die zowel bruikbaarheid als functionaliteitcombineren 3. Icy is een stand-alone tool die een duidelijke grafische gebruikersinterface (GUI) pres.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
G.H. werd ondersteund door een graduate fellowship van de Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. werd ondersteund door een graduate fellowship van het Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), terwijl Q.T. werd ondersteund door een overheidssubsidie onder toezicht van het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR) als onderdeel van het tweede "Investissements d'Avenir" programma FIGHT-HF (referentie: ANR-15-RHU4570004). Dit werk werd gefinancierd door CNRS en Université de Lorraine (UMR 7365).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 16% Formaldehyde-oplossing (w/v) methanol vrij | Thermo Fisher Scientific | 28908 | om de cellen te fixeren |
| Alexa Fluor 488 van geit anti-konijn | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | fluorescerende secundaire antilichaam |
| Alexa Fluor 555 van geit anti-muis | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | fluorescerende secundaire antilichaam |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | fluorescerende secundaire antilichaam |
| Rundserumalbumine standaard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | celcultuurmedium |
| Duolink In Situ Montagemedium met DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | montagemedium |
| Human: HeLa S3-cellen | IGBMC, Straatsburg, Frankrijk | cellijn gebruikt om de experimenten uit te voeren | |
| Waterstofperoxide-oplossing 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | gebruikt als stressmiddel |
| Lipofectamine 2000 Reagens | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | transfectiereagens |
| Muis monoklonaal anti-coilin | abcam | ab11822 | Coilin-specifiek antilichaam |
| Nikon Optiphot-2 fluorescentiemicroscoop | Nikon | epifluorescentiemicroscoop | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | transfectiemedium |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | om de cellen te wassen |
| Konijn polyklonaal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specifiek antilichaam |
| Konijn polyklonaal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specifiek antilichaam |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | om de cellen te permeabiliseren |
Referenties
- Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
- Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
