Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Axonal Transport van Organellen in Motor Neuron Culturen met behulp van Microfluidic Chambers System

10K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/60993

⸱

5 mei 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Sagol School of Neuroscience, Tel Aviv University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Axonale transport is een cruciaal mechanisme voor de gezondheid van motorneuronen. In dit protocol bieden we een gedetailleerde methode voor het bijhouden van het axonale transport van zure compartimenten en mitochondriën in motorneuron axonen met behulp van microfluïdische kamers.

Samenvatting

Motorneuronen (MNs) zijn sterk gepolariseerde cellen met zeer lange axonen. Axonale transport is een cruciaal mechanisme voor de gezondheid van MN, bij te dragen aan neuronale groei, ontwikkeling en overleving. We beschrijven een gedetailleerde methode voor het gebruik van microfluïdische kamers (MPC's) voor het bijhouden van axonal transport van fluorescerend gelabelde organellen in MN axons. Deze methode is snel, relatief goedkoop, en zorgt voor de monitoring van intracellulaire signalen in ruimte en tijd. We beschrijven een stapsgewijs protocol voor: 1) Fabricage van polydimethylsiloxane (PDMS) MFP's; 2) Plating van ventrale ruggenmergexplanten en MN gescheiden cultuur in MPC's; 3) Etikettering van mitochondriën en zure compartimenten, gevolgd door live confocale verbeelding; 4) Handmatige en semi-geautomatiseerde axonale transportanalyse. Ten slotte tonen we een verschil aan in het transport van mitochondriën en zure compartimenten van HB9::GFP ventrale ruggenmerg explant axonen als een bewijs van de geldigheid van het systeem. Al met al biedt dit protocol een efficiënt hulpmiddel voor het bestuderen van het axonale transport van verschillende axonale componenten, evenals een vereenvoudigde handleiding voor MFC-gebruik om ruimtelijke experimentele mogelijkheden te helpen ontdekken.

Inleiding

MNs zijn sterk gepolariseerde cellen met lange axonen, die tot een meter lang zijn bij volwassen mensen. Dit fenomeen vormt een cruciale uitdaging voor het onderhoud van MN-connectiviteit en -functie. Bijgevolg zijn MN's afhankelijk van een goed transport van informatie, organellen en materialen langs de axonen van hun cellichaam naar de synaps en terug. Verschillende cellulaire componenten, zoals eiwitten, RNA en organellen worden regelmatig door de axonen geshuttled. Mitochondriën zijn belangrijke organellen die routinematig worden vervoerd in MNs. Mitochondriën zijn essentieel voor de juiste activiteit en functie van MN's, verantwoordelijk voor ATP-voorziening, calciumbuffering en signaleringsprocessen1,2. Het axonale transport van mitochondriën is een goed bestudeerd proces3,4. Interessant is dat defecten in mitochondriaal transport betrokken waren bij verschillende neurodegeneratieve ziekten en specifiek bij MN-ziekten5. Zure compartimenten dienen als een ander voorbeeld voor intrinsieke organellen die langs MN axonen bewegen. Zure compartimenten zijn lysosomen, endosomen, trans-Golgi apparaat, en bepaalde secretoire blaasjes6. Gebreken in het axonale transport van zure compartimenten werden gevonden in verschillende neurodegeneratieve ziekten en7, en recente papers benadrukken hun belang in MN ziekten8.

Om axonaal transport efficiënt te bestuderen, worden microfluïdische kamers die somatische en axonale compartimenten scheiden vaak9,10gebruikt. De twee belangrijke voordelen van het microfluïdische systeem, en de compartimentering en de isolatie van axonen, maken het ideaal voor de studie van subcellulaire processen11. De ruimtelijke scheiding tussen de neuronale cellichamen en axonen kan worden gebruikt om de extracellulaire omgevingen van verschillende neuronale compartimenten te manipuleren (bijvoorbeeld axonen versus soma). Biochemische, neuronale groei/ degeneratie, en immunofluorescentie testen profiteren allemaal van dit platform. MPC's kunnen ook helpen bij het bestuderen van cel-naar-cel communicatie door coculturing neuronen met andere celtypes, zoals skeletspieren12,13,14.

Hier beschrijven we een eenvoudig maar nauwkeurig protocol voor het monitoren van mitochondriën en zuur compartimenttransport in motorneuronen. We tonen verder het gebruik van deze methode door het relatieve percentage retrograde en anterograde bewegende organellen te vergelijken, evenals de verdeling van de transportsnelheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De verzorging en behandeling van dieren in dit protocol werd uitgevoerd onder toezicht en goedkeuring van het Universiteitscomité voor dierethiek van Tel Aviv.

1. Voorbereiding van het MFC

  1. PDMS gieten in primaire mallen (Figuur 1)
    1. Koop of maak primaire mallen (wafers) volgens een gedetailleerd protocol9.
    2. Gebruik lucht onder druk om elk type vuil van het waferplatform te verwijderen voordat u overgaat tot de coatingstap. Het oppervlak van de wafers moet er glad en helder uitzien.
    3. Vul een container met 50 mL vloeibare stikstof. Bereid een 10 mL spuit en 23 G naald.
      LET OP: Alle procedures vanaf deze stap voorwaarts moeten worden uitgevoerd in een chemische kap.
    4. In de chemische kap, gebruik maken van de spuit en naald te bundelen 2 mL vloeibare stikstof. Hoewel het lijkt alsof lucht werd getrokken, is de spuit gevuld met stikstof(figuur 1A). Plaats de waferbevattende plaat in een afsluitbare container.
    5. Schroef een chlorotrimethylsilane-fles open, doorboor de rubberen dop met de met stikstof gevulde spuit en injecteer de volledige inhoud van de spuit in de fles. Zonder de naald eruit te trekken, draait u de fles ondersteboven en trekt u 2 mL chlorotrimethylsilane terug.
      OPMERKING: Vanwege de spuitdruk wordt een kleine hoeveelheid chloortrimethylsilane uit de naald gespoten. Om gevaar te voorkomen, richt u de naald naar de binnenwand van de kap(figuur 1B).
    6. Verdeel chloortrimethylsilane gelijkmatig in de container (vanaf stap 1.1.4), maar niet rechtstreeks op de wafer- of waferbevattende plaat. Sluit de container en incubeer gedurende 5 min per wafer.
      OPMERKING: Als dit de eerste keer is dat de wafer is bedekt met chlorotrimethylsilane, moet voor elke wafer een incubatie van 1 uur worden toegestaan.
    7. Haal de wafers en de container niet 30 min uit de chemische kap.
      LET OP: Chlorotrimethylsilane is zeer vluchtig.
    8. Weeg de PDMS-basis (zie Materiaaltafel)in een buis van 50 mL en voeg PDMS-uithardingsmiddel toe met een verhouding van respectievelijk 16:1 (bijvoorbeeld 47,05 g basis en 2,95 g uithardingsmiddel). Meng gedurende 10 min met behulp van een lage snelheid rotator.
    9. Giet PDMS in elke wafer-bevattende plaat naar de gewenste hoogte(figuur 1C).
      OPMERKING: Het gebruik van dunne microfluïdische kamers (tot 3-4 mm) verbetert de hechting aan de kweekschaal en voorkomt lekkage.
    10. Plaats alle platen samen in een vacuümdroogcanor gedurende 2 uur (figuur 1E). Dit proces verwijdert de lucht gevangen in de PDMS, waardoor luchtbellen worden geëlimineerd en een duidelijke, uniforme mal wordt gevormd.
    11. Plaats de platen in een oven voor 3 uur (of 's nachts) op 70 °C (Figuur 1E).
      LET OP: De platen moeten vlak zijn wanneer ze in de oven worden geplaatst.
  2. PDMS gieten in epoxy mallen
    OPMERKING: Omdat wafer voorbereiding is duur, vereist speciale apparatuur, en kan schade toebrengen aan de fragiele wafers, is het mogelijk om epoxy replica's van wafers te genereren. De replica's zijn goedkoper, duurzamer, en kan worden gebruikt voor massaproductie van microfluïdische kamers.
    1. Cast en cure PDMS (zoals beschreven in 1.1.8-1.1.11) in de originele wafer.
    2. Verwijder en snijd overtollige delen van PDMS weg, waardoor alleen de microfluïdische elementen en het functionele gebied dat nodig is om ze te verwerken tot microfluïdische kamers, worden verwijderd.
    3. Wikkel de PDMS onmiddellijk met dikke, plakband om te voorkomen dat het stof ophoopt.
    4. Kies een tissue cultuur kwaliteit plastic schotel die de hele PDMS binnen past en laat ruimte voor epoxy eromheen. De afstand van de PDMS tot de kunststof schaal moet minder dan 5 mm bedragen.
    5. Bereid een kleine hoeveelheid PDMS gemengd in een verhouding van 10:1 (base:curing agent). De verse vloeibare PDMS zal worden gebruikt om de vaste PDMS op de bodem van de kunststof plaat te lijmen.
    6. Breng een minimale hoeveelheid van de vloeibare PDMS aan op de middelste bodem van de plastic plaat en verwijder vervolgens de plakband uit de PDMS en plak deze aan de plastic afwasbodem. Zorg ervoor dat de microfluïdische elementen naar boven gericht zijn.
    7. Laat de PDMS 30 min genezen in een oven van 70 °C.
    8. Bereid de epoxyhars voor door de basis en het uithardingsmiddel te mengen in een verhouding van respectievelijk 100:45 in een reageerbuis. Verschillende epoxyharsen kunnen verschillende mengverhoudingen hebben. Het vereiste volume voor een gewone plaat van 100 mm is ongeveer 40 mL.
    9. Laat de epoxy goed mengen gedurende 10 minuten in een rotator totdat het mengsel zichtbaar homogeen wordt (dat wil zeggen, er zijn geen zichtbare vezelachtige artefacten in de vloeistof).
    10. Centrifugeer het epoxymengsel op 400 x g gedurende 5 min om de gevangen luchtbellen binnen te verwijderen.
    11. Tijdens de centrifugatie, verspreid een dunne laag siliconen vet rond de muren en alle andere blootgestelde plastic delen van de cultuur schotel. Dit voorkomt dat de epoxy polymeriseert met het afdeikmiddel en maakt het mogelijk om de uitgeharde epoxy gemakkelijk aan het einde van het protocol te verwijderen.
    12. Giet de epoxy langzaam in de schotel totdat deze de PDMS volledig bedekt en gaat er met ten minste 5 mm overheen. Voorkom de vorming van eventuele bellen in de epoxy door nul afstand tussen de buis en de plaat te houden. Plaats de plaat op een veilige plaats, zodat deze niet wordt verplaatst voor de komende 48 uur.
    13. Na 48 uur moet de epoxy volledig worden uitgehard. Plaats de plaat in een voorverwarmde oven op 80 °C gedurende 3 uur voor het uiteindelijk uitharden.
    14. Verwijder de uitgeharde epoxy van de plaat en de originele PDMS-mal door de plastic wand van de plaat voorzichtig te trekken tot deze breekt. Het moet dan gemakkelijk scheiden van de epoxy en afpellen.
    15. Eenmaal geëxtraheerd, veeg het resterende vet uit de nieuwe epoxy replica en zet het ondersteboven (dat wil zeggen, met de gerepliceerde microfluïdische elementen naar boven) in een nieuwe cultuur schotel. De epoxy replica is nu klaar voor PDMS casting.
    16. Gebruik onder druk staande lucht of N2 om eventuele resten van PDMS of vuil van de epoxy mal blazen en spoel het 2x met isopropanol. Vul het een derde keer en incubeer gedurende 10 min op een orbitale shakerplaat. Spoel de mal opnieuw 3x met isopropanol en gooi de resterende vloeistof. Föhn met lucht of N2 of plaats in een oven van 70 °C tot het droog is.
      LET OP: Volg veiligheidsprocedures bij het werken met en weggooien isopropanol.
    17. Houd de schimmelplaten gesloten tot het gieten. Volg de stappen 1.1.8.-1.1.11.
  3. Ponsen en beeldhouwen van de PDMS in een MFC (Figuur 2)
    1. Snijd en verwijder de PDMS mal van de plaat door het volgen van de (+) markeringen op de wafers met behulp van een scalpel. Gebruik geen geweld, omdat de mallen fragiel zijn(figuur 2A).
    2. Volg de instructies die op de schets zijn getekend om de kamers te slaan en te snijden, afhankelijk van de experimentele opstelling(figuur 2B-F).
      1. Voor ruggenmerg explant cultuur (Figuur 2C, E), punch twee 7 mm putten in de distale kant van een de grote MFC. Zoek de putten op een manier die ze overlappen met de kanaalranden. Aan de proximale kant, punch een 7 mm goed in het midden van het kanaal, met minimale overlap, zodat er voldoende ruimte overblijft voor de explants. Punch twee extra 1 mm gaten in de twee randen van het proximale kanaal. Draai de MFC met de microfluïdische elementen naar boven gericht, en met behulp van een 20 G naald, carve drie kleine uitplant grotten op de geponste 7 mm goed.
      2. Voor gescheiden MN cultuur (Figuur 2D, F), punch vier 6 mm putten in de randen van de twee kanalen van een kleine MFC.
  4. Steriliseren van het MFC voor weefselkweekgebruik
    1. Verspreid 50 cm lange plakbandbanden op de bank. Druk en trek de kamer terug om de plakband (zowel boven- als onderzijde) onder ogen te zien en ruw vuil te verwijderen. Plaats de schone kamers in een nieuwe plaat van 15 cm.
      LET OP: Druk niet rechtstreeks op de microfluïdische elementen wanneer deze naar boven gericht zijn.
    2. Incubeer de kamers in analytische kwaliteit 70% ethanol gedurende 10 min op een orbitale shaker.
    3. Gooi de ethanol weg en droog de kamers in een weefselkweekkap of in een oven op 70 °C.
  5. Het plaatsen van de MFC op een glazen bodemschaal
    1. Plaats de kamer in het midden van een weefselcultuur graad 35 mm/50 mm glazen bodem schotel en kleine kracht op de randen toe te passen aan de PDMS en schotel bodem binden. Om te voorkomen dat de glazen bodem wordt gebroken, moet u altijd kracht uitoefenen op een vast oppervlak.
    2. Incubeer 10 min in 70 °C. Druk op de kamers om de hechting aan de plaat te versterken.
    3. Incubeer onder UV-licht gedurende 10 min.
  6. Coating en kweek
    1. Voeg 1,5 ng/mL poly-L-ornithine (PLO) toe aan beide compartimenten. Zorg ervoor dat de PLO door de kanalen loopt door de coatingmedia een paar keer direct in de kanaalingang te pipetteren.
    2. Bestudeer de microfluïdische kamer onder een lichtmicroscoop met 10x vergroting om te controleren op de aanwezigheid van luchtbellen. Als luchtbellen de microgroeven blokkeren, plaatst u de MFC gedurende 2 min in een vacuümdroog. Verwijder later de overtollige lucht die in de kanalen terecht kwam door de coatingmedia erdoorheen te paien. 's nachts uitte.
    3. Vervang PLO door laminine (3 μg/mL in DDW) voor nachtelijke incubatie op dezelfde manier.
    4. Voorafgaand aan plating, was de laminine met neuronale cultuur medium.

2. Neuronale cultuur beplating

  1. Gescheiden motorneuron cultuur
    1. Ontleed met behulp van een rechte schaar en fijne tangen een ruggenmerg uit een E12.5 ICR-HB9::GFP-muisembryo. Werk in een 1X HBSS-oplossing met 1% penicilline-streptomycine (P/S) (Figuur 3A-C).
    2. Verwijder met behulp van microdissectieschaar de hersenvliezen en de rughoorns(figuur 3D).
    3. Verzamel de ruggenmergstukken en breng over op de buis(#1) met 1 mL HBSS + 1% P/S.
    4. Snijd de ruggenmerg in kleine stukjes met behulp van gebogen schaar en wacht tot de stukken te vestigen.
    5. Voeg 10 μL trypsine 2,5% toe en plaats in een waterbad van 37 °C gedurende 10 min. Na 5 min, meng door te tikken op de buis. De stukken moeten een helix-achtige klomp vormen.
    6. Breng de klomp over in een nieuwe buis (#2) met 800 μL voorverwarmde L-15, 100 μL BSA 4% en 100 μL van 10 mg/mL DNase. Maal 2x, dan wachten tot 2 min te laten ongesocieerde stukken vestigen. Breng de supernatant over op een nieuwe buis(#3).
    7. Voeg 100 μL BSA 4%, 20 μL van 10 mg/mL DNase en 900 μL compleet neurobasaal medium (CNB, zie Materiaaltafel en Tabel 1). Grind 8x en wacht 2 min. Verzamel supernatant aan buis #3.
    8. Herhaal stap 2.1.7 en maal 10x. Verzamel supernatant aan buis #3. Een kleine hoeveelheid weefsel moet worden achtergelaten aan de onderkant van de buis.
      LET OP: Als er nog steeds een grote klomp aan de onderkant van de buis #2,herhaal stap 2.1.8.
    9. Voeg 1 mL BSA 4% kussen toe aan de onderkant van de buis #3.
    10. Centrifugeer op 400 x g voor 5 min. Gooi de supernatant weg.
    11. Resuspend de cel pellet door zachtjes te tikken op de buis, voeg dan 1 mL van CNB medium. Pipetteer 6x en voeg 20 μL van 10 mg/mL DNase toe.
    12. Vul aan met een extra 5 mL CNB medium en breng 3 mL over op een nieuwe buis(#4).
    13. Voeg 1 mL van 10,4% dichtheidsgradiënt medium (zie tabel 2)toe aan de onderkant van elke buis(#3 en #4). Er moet een scherpe fasescheiding tussen de twee interfaces verschijnen.
    14. Centrifugeer op 775 x g gedurende 20 min bij kamertemperatuur (RT). De vertraging van de centrifuge moet op een laag niveau worden ingesteld om afbraak van de fasescheiding te voorkomen.
    15. Cellen moeten zweven en verschijnen als een bewolkte interfase tussen de media. Verzamel de cellen van beide buizen in een nieuwe buis(#5) die al voorwarm 1 mL CNB medium bevatten.
    16. Voeg een extra 4-6 mL cnb medium.
    17. Voeg 1 mL BSA 4% kussen toe aan de onderkant van de buis.
    18. Centrifugeer op 400 x g voor 5 min bij RT. Gooi de supernatant weg en laat de pellet voorzichtig met 1 mL CNB-medium opschorten.
    19. Tel de cellen. Een opbrengst van 0,75-1 x 106 MN per ruggenmerg wordt verwacht.
      OPMERKING: Ventrale ruggenmerg bevat naast motorneuronen ook andere neuronale subtypes (bijv. interneurons). MN zuiverheid hangt meestal af van de verwijdering van dorsale gebieden tijdens dissectie en de mogelijkheid om MN verrijkte rostral gebieden te bereiken. Om ervoor te zorgen dat de afgebeelde neuronen MN's zijn, wordt het gebruik van een muizenstam met een endogene MN-marker, zoals HB9::GFP-muizen, aanbevolen. Om een zuivere MN-cultuur te bereiken (maar met een verminderde celopbrengst), is het gebruik van FACS zuivering15 mogelijk.
    20. Plating scheidde MN cultuur in het MFC
      1. Concentraat 150.000 MN's per kamer door centrifugeren op 400 x g voor 5 min.
      2. Trek de supernatant aan en stouw de cellen voorzichtig op in rijk neurobasaal medium (RNB) bij 4 μL per MFC. RNB is CNB aangevuld met extra 2% B27 en 25 ng/mL BDNF.
      3. Verwijder het medium uit beide compartimenten, waardoor een laag volume gelijk is aan ~ 10 μL in de putten van het distale compartiment. Het verschijnt als een dunne ring van medium in de put omtrek.
      4. Laad langzaam 4 μL cellen in het kanaal. Neem 4 μL van de put aan de andere kant van het kanaal en laad ze langzaam rechtstreeks terug in het kanaal om de stroom om te keren en de celdichtheid in het kanaal te maximaliseren.
      5. Controleer of de cellen met een 10x-lichtmicroscoop in het kanaal zijn gekomen en plaats de kamer gedurende 30 min in de couveuse zonder meer media toe te voegen.
      6. Voeg langzaam ~10-15 μL RNB toe aan de proximale en distale putten en plaats de kamers nog 15 min in de couveuse.
      7. Na deze incubatie, langzaam toe te voegen ~ 75-80 μL RNB in elke put.
    21. Gescheiden MN cultuuronderhoud
      1. Een dag na beplating (DIV1), vervang medium met RNB aangevuld met 1 μM cytosine arabinoside (Ara-C) om de groei van de glial te remmen.
      2. Twee dagen na ara-C toepassing (DIV3) vervangen medium met verse CNB medium in de proximale compartiment (zonder Ara-C).
      3. Om het oversteken van axonen door de microgroeven te verbeteren, past u RNB aangevuld met 25 ng/mL van gliacel-afgeleide neurotrofe factor (GDNF) en 25 ng/mL van hersen-afgeleide neurotrofe factor (BDNF) alleen toe op het distale compartiment. Houd een volumegradiënt van ten minste 10 μL per put tussen de axonale distale putten (hoger volume) en de proximale putten.
      4. Vernieuw het medium elke 2 dagen. Het kan tot 4-6 dagen duren voordat de axonen niet goed zijn.
  2. Ruggenmerg explant cultuur
    1. Ontleed met behulp van een rechte schaar en fijne tangen een ruggenmerg uit een E12.5 ICR-HB9::GFP-muisembryo. Werk in een 1X HBSS-oplossing met 1% penicilline-streptomycine (P/S) (Figuur 3A-C).
    2. Verwijder met behulp van microdissectieschaar de hersenvliezen en de rughoorns(figuur 3D).
    3. Snijd het ruggenmerg in 1 mm dikke dwarse delen(figuur 3E). Gooi alle medium uit het proximale compartiment van het MFC.
    4. Pak een enkele ruggenmergexplant met een pipet in een totaal volume van 4 μL. Injecteer de uitplant zo dicht mogelijk bij de grot en trek eventuele overtollige vloeistof uit de proximale put via de laterale uitlaten (1 mm stoten). De explants moeten in het proximale kanaal worden gezogen.
    5. Voeg langzaam 150 μL ruggenmergexplantmedium (SCEX, zie Materiaaltafel en Tabel 3)toe aan de bronput.
    6. Ruggenmerg explant cultuur onderhoud
      1. Voeg SCEX medium in het proximale compartiment, en rijke SCEX medium (SCEX met 50 ng/mL van BDNF en GDNF) in het distale compartiment. Houd een volumegradiënt van ten minste 15 μL per put tussen de distale putten (hoger volume) en de proximale put.
      2. Vernieuw het medium elke 2 dagen. Het kan de axonen tot 3-5 dagen duren om distally over te steken.

3. Axonal vervoer (figuur 4A)

  1. Etikettering van mitochondriën en zure compartimenten
    1. Bereid vers SCEX medium (of CNB voor gescheiden MN) met 100 nM Mitotracker Deep Red FM en 100 nM LysoTracker Red. Incubeer 30-60 min bij 37 °C. Andere kleuren kunnen worden gebruikt zolang hun fluorophoren elkaar niet overlappen.
    2. Was 3x met warm CNB/SCEX medium. De platen zijn klaar voor beeldvorming.
  2. Live beeldvorming
    1. Verwerf 100 time-lapse beeldreeksen van axonal transport met intervallen van 3 s, met een totaal van 5 min per film.
      OPMERKING: Het imaging systeem gebruikt in deze studie opgenomen een omgekeerde microscoop uitgerust met draaiende schijf confocale, gecontroleerd via propriety cell imaging software, 60x olielens, NA = 1,4, en een EMCCD camera. Films werden verworven in een gecontroleerde omgeving bij 37 °C en 5% CO2.
      OPMERKING: Langere of kortere time-lapse-films kunnen worden weergegeven, afhankelijk van het experiment. Zelfs 's nachts films kunnen worden opgenomen indien nodig. Het is echter van cruciaal belang om te proberen de belichtingstijd en laserkracht, evenals het aantal totale beelden, te verminderen om fototoxiciteit en bleken tijdens filmacquisitie te verminderen.

4. Beeldanalyse (cijfers 4-5)

  1. Analyse van de verdeling en dichtheid van deeltjestransport met behulp van kymograafanalyse
    1. Open het bestand in FIJI. Afzonderlijke kanalen die op Afbeelding drukken | Stapels | Instrumenten | Deinterleave.
    2. Afbeeldingseigenschappen instellen door op Afbeelding te drukken | Eigenschappen.
    3. Kies het gereedschap Gesegmenteerde lijn door met de rechtermuisknop op het lijnpictogramte klikken . Stel Breedte in op 8-10 door op het lijnpictogramte dubbelklikken . In overeenstemming zijn met dezelfde lijnbreedte gedurende de gehele analyse.
    4. Markeer een gesegmenteerde lijn die het axonpad volgt van distaal naar proximal. Dubbelklik om de lijnmarkering te stoppen.
    5. Klik op t om een nieuw regelgebied (ROI) toe te voegen aan de ROI Manager. Voeg dit toe aan een spreadsheetanalysetabel.
    6. Klik op m om het gebied en de lengte van de axon te meten. Voeg dit toe aan de analysetabel.
    7. Een kymograaf genereren door op Plug-ins te klikken | KymoToolBox | Teken Kymo. Als alternatief kunnen andere kymograph generatie plugins beschikbaar worden gebruikt.
    8. Tel handmatig bewegende (retrograde of anterograde) en niet-bewegende deeltjes en voeg ze toe aan de tabel in de juiste kolom.
      OPMERKING: Deeltjes worden geclassificeerd als bewegende anterograde (d.w.z. naar links bewegen in de kymograaf) of retrograde (d.w.z. naar rechts bewegen) als hun verplaatsing hoger is dan 10 μm in de specifieke richting. Het is mogelijk om de verplaatsing te meten door simpelweg een horizontale lijn met het lijnpictogram te markeren en op mte drukken. Onbeweeglijke deeltjes of deeltjes die niet aan de verplaatsingscriteria voldoen, worden gedefinieerd als niet-bewegend (figuur 4B).
  2. Single particle tracking: Handmatig bijhouden
    1. Download de handmatige tracking plugin voor FIJI software (ontwikkeld door Fabrice P. Cordelière) van http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
    2. Open het bestand in FIJI/ImageJ. Gebruik de optie Roteren om de MFC-groeven horizontaal uit te lijnen.
    3. Als u de signaal-ruisverhouding indien nodig wilt verbeteren, klikt u op Proces | Achtergrond aftrekken.
    4. Open de plug-in Handmatig bijhouden. Stel de parameters (bijvoorbeeld pixelgrootte, tijdsinterval, enz.) in op basis van de specifieke microscoop die wordt gebruikt voor beeldvorming. Voor de hier getoonde resultaten was de microscoop en lens de verhouding 0,239 μm/pixel en het frameinterval 3 s.
    5. Verkrijg de tracks X- en Y-coördinaten en sla de resultaten op door de tekst naar spreadsheet te kopiëren.
    6. Meerderekanaals films analyseren door op Afbeelding te klikken | Kleur | Kanalen samenvoegen om de kanalen samen te voegen en vervolgens alleen colocaliseerde puncta bij te houden.
  3. Single particle tracking: Semi-geautomatiseerde tracking (Figuur 5)
    1. Open de analysesoftware. Deze studie gebruikt Bitplane Imaris software versie 8.4.1.
    2. Schakel over naar Overtreffen in het bovenste menu.
    3. Klik op Beeldverwerking | Wisseltijd en Z | Ok.
    4. Klik op Bewerken | Afbeeldingseigenschappen (Ctrl+I) | Geometrie | Voxel Grootte Rij. Beeldeigenschappen instellen op basis van de gebruikte microscopie-instelling.
      OPMERKING: Voor de hier weergegeven gegevens was de microscoop- en lensverhouding 0,239 μm/pixel.
    5. Klik op Alle Equidistant en wijzig het tijdsinterval. Gebruik bijvoorbeeld 3 s als interval. Klik op de knop Opnieuw instellen rechtsonder of klik op Ctrl+B.
    6. Voeg linksboven een laag vlekken toe door op een pictogram van kleine gele vlekken teklikken. Linksonder wordt een nieuw menu voor het bewerken van de spots geopend.
    7. Druk op de rechterblauwe pijl totdat de detectie van de plek wordt gestart.
      OPMERKING: Het is belangrijk om een aantal puntjes uit te filteren met behulp van het filter linksonder in het venster. Controleer de film een paar keer om te zien dat er voldoende punten zijn geselecteerd.
    8. Controleer of configureer de parameters op de experimentele behoeften. Max Distance = 12 μm (De maximale afstand tussen twee verschillende plekken om ze nog steeds in dezelfde single track op te nemen); Max Gap Grootte = 1 (Het aantal frames dat een track mag missen en nog steeds beschouwd als een track).
    9. Klik op Instellingen en vervolgens op Stijl bijhouden = Uit, Punten = Bol.
    10. Kies met de filterbalkverschillende filters voor aanpassing. In de hier verstrekte gegevens heeft Track Duration = 9 bijvoorbeeld alle tracks met minder dan 3 frames verwijderd. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, klikt u op de pijl-rechts . Verdere bewerking is na deze stap niet mogelijk.
    11. Klik op het kleine potlood met stippen om alle nummers handmatig te bewerken.
    12. Bekijk de film (Figuur 5B). Als er een fout optreedt, zijn er verschillende mogelijke opties:
      1. Als u een track wilt loskoppelen, klikt u op de optie Object en kiest u de twee plekken die moeten worden losgekoppeld terwijl Ctrlingedrukt moet worden en kiest u Verbinding verbreken.
      2. Als u een track wilt aansluiten, klikt u op de optie Object, kiest u de twee plekken die moeten worden verbonden met Ctrl en kiest u Verbinding maken.
      3. Als u een track of spot wilt verwijderen, met de juiste optie(Track/Object),schakelt u naar het scherm met het pictogram Normaal potlooden kiest u Verwijderen.
      4. Als u vlekken handmatig wilt toevoegen, schakelt u over naar het scherm met normaal potloodpictogram. Aan de onderkant van het scherm is er een Manual Tracking Mark. Controleer of het selectievakje Automatisch verbinden Vis. Houd op de film zelf de Shift-knopen Linksklikken ingedrukt om een vlek toe te voegen. Shift
    13. Als u een spot wilt toevoegen aan een bestaand spoor, kiest u een gewenst track (geel) en frame, schakelt u over naar het gewone potloodpictogramscherm en voegt u handmatig een vlek toe. Wanneer de hele film klaar is, schakelt u over naar het pictogram dat eruitziet als een rode grafiek (statistieken). Het is mogelijk om de geanalyseerde parameters later te bewerken. Als u wilt bewerken, drukt u linksonder op het scherm op het Zweedse sleutelpictogram. Bijvoorbeeld: Positie X, Positie Y.
    14. Druk op het pictogram dat lijkt op verschillende diskettes, exporteer alle statistieken.
      OPMERKING: De spreadsheetuitvoer kan direct of verder worden geanalyseerd met behulp van de gepubliceerde code9 die voor deze analyse wordt gebruikt, die op aanvraag wordt gedeeld. De volgende parameters worden uit de analyse gehaald: Snelheid, Spoorverplaatsing, Run length, Velocity (inclusief Directionaliteit), Stop Count, Gemiddelde Stop Duur, Alpha, Richtingswisselingen en Momentane Snelheid. Een gedetailleerde uitleg van elke parameter wordt beschreven in Gluska et al.9.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Volgens het beschreven protocol werden de embryonale HB9::GFP-ruggenmergexplanten gekweekt in MFC (figuur 4A). Explants werden gekweekt voor 7 dagen, toen axonen volledig gekruist in de distale compartiment. Mitotracker Deep Red en Lysotracker Rode kleurstoffen werden toegevoegd aan de distale en proximale compartimenten om de mitochondriën en zure compartimenten(figuur 4C)te labelen. Axonen in d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol beschrijven we een systeem om axonaltransport van mitochondriën en zure compartimenten in motorneuronen te volgen. Dit vereenvoudigde in vitro platform maakt nauwkeurige controle, monitoring en manipulatie van subcellulaire neuronale compartimenten mogelijk, waardoor experimentele analyse van lokale functies van motorneuron mogelijk is. Dit protocol kan nuttig zijn voor het bestuderen van MN-ziekten zoals ALS, om zich te concentreren op het begrijpen van het onderliggende mechanisme van axonale transportd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Israel Science Foundation (ISF, 561/11) en de European Research Council (ERC, 309377).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
35mm Fluodish – glass bottom dishWorld Precision Instruments WPIFD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dishWorld Precision Instruments WPIFD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD cameraAndor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside)Sigma-AldrichC1768stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X)Thermo Fisher17504044
BDNFAlomone LabsB-250Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mmWorld Precision Instruments WPI504530For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mmWorld Precision Instruments WPI504533For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mmWorld Precision Instruments WPI504534For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software - version 8.4.1Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA)Sigma-Aldrich#A3311-100G5% w/v in ddw
ChlorotrimetylsilaneSigma-Aldrich#386529-100ML
CNTFAlomone LabsC-240Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium - OptiprepSigma-AldrichD1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreasSigma-AldrichDN-25stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone greaseSigma-AldrichZ273554-1EAFor epoxy mold preperation
DPBS 10XThermo Fisher#14200-067dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mmF.S.T1125520
Epoxy HardenerTrias Chem S.R.LIPE 743For epoxy mold preperation
Epoxy ResinTrias Chem S.R.LRP 026UVFor epoxy mold preperation
FIJI softwareImageJ
GDNFAlomone LabsG-240Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100XThermo Fisher#35050-038
HB9:GFP mice strainJackson Laboratories005029
HBSS 10XThermo Fisher#14185-045Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ softwareAndor
Iris scissors, curved, 10 cmAS Medizintechnik11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cmAS Medizintechnik11-440-09
LamininSigma-Aldrich#L-2020
Leibovitz's L-15 MediumThermo Fisher11415064
LysoTracker RedThermo FisherL7528
Mitotracker Deep-Red FMThermo FisherM22426
Neurobasal mediumThermo Fisher21103049
Nikon Eclipse Ti micorscopeNikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) SolutionBiological Industries03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO)Sigma-Aldrich#P8638Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kitDOW Corning Corporation#3097358-1004
Trypsin from bovine pancreasSigma-AldrichT1426stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm bladeF.S.T15000-00
Yokogawa CSU X-1Yokogawa

Referenties

  1. Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
  2. Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
  3. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  4. Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373(2019).
  5. Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
  6. Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
  7. Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
  8. Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
  9. Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
  10. Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311(2018).
  11. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  12. Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
  13. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  14. Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
  15. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
  16. Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210(2019).
  17. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  18. Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Kweek van motorneuronenPDMS gietenlabelen van organellenlive confocale imagingkymograafanalyseMitoTracker Deep RedLysoTracker RedHB9 GFP ruggenmerg
Axonal Transport van Organellen in Motor Neuron Culturen met behulp van Microfluidic Chambers System
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.