Optimalisatie van nierorganoïde en organotypic cultuur voor vascularisatie, uitgebreide ontwikkeling en verbeterde microscopie beeldvorming

Samenvatting

Dit werk beschrijft twee methoden voor het bestuderen van orgaanontwikkeling, een verbeterde xenotransplantatie-opstelling op chorioallantoïsch membraan (CAM) van vogelembryo's die vascularisatie van gekweekte embryonale organen en organoïden mogelijk maakt en een nieuwe vaste z-richting orgaankweekmethode met gewijzigde experimentele omstandigheden die hoge resolutie time-lapse confocale beeldvorming mogelijk maakt.

Samenvatting

Embryonale nier organotypic culturen, en vooral pluripotente stamcel-afgeleide nier organoïden, zijn uitstekende instrumenten voor het volgen van ontwikkelingsprocessen en modellering nierziekte. De modellen worden echter beperkt door een gebrek aan vascularisatie en functionaliteit. Om dit aan te pakken, werd een verbeterd protocol ontwikkeld voor de methode van xenografting cellen en weefsels aan het chorioallantoïsche membraan (CAM) van een vogelembryo om vascularisatie en herstel van de bloedstroom te krijgen. De grafts zijn bedekt met op maat gemaakte minireservoirs die de monsters vast te stellen aan de CAM en hen te voorzien van cultuur medium dat de grafts beschermt tegen het drogen. De verbeterde cultuurmethode maakt het mogelijk xenografts tot 9 dagen te laten groeien. Het manuscript beschrijft ook hoe optimale omstandigheden te bieden voor langdurige confocale beeldvorming van nierorganoïden en organotypic culturen met behulp van de eerder gepubliceerde Fixed Z-Direction (FiZD) methode. Deze methode comprimeert voorzichtig een embryonaal orgaan of organoïde tussen een glazen afdekking en membraan in een grote hoeveelheid medium en biedt uitstekende omstandigheden voor beeldvorming voor maximaal 12 dagen. Samen maken deze methoden vascularisatie en bloedtoevoer naar nierorganoïden en organotypic nierculturen mogelijk met verbeterde confocale beeldvorming. De hier beschreven methoden zijn zeer gunstig voor het bestuderen van fundamentele en toegepaste functies van nieren ex vivo. Beide methoden zijn van toepassing op verschillende soorten weefsels en organoïden.

Inleiding

Organotypic cultuur van embryonale nieren werd een belangrijk model om nefrogenese decennia geleden te bestuderen^1,2,3. Nierorganoïden vertegenwoordigen een geavanceerd modelsysteem voor het bestuderen van de ontwikkeling van gezonde en zieke nieren⁴. Het belangrijkste nadeel voor beide methoden is echter dat geen van beide methoden de belangrijkste functie van de nier recapituleert: bloedfiltratie. Nefrons en niervabulatuur ontwikkelen zich in nierorganoïden en organotypic culturen op dezelfde manier als vroege stadium in vivo ontwikkeling; echter, de glomeruli gevormd in vitro blijven avasculaire⁵. Vascularisatie van ex vivo embryonale nieren en nierorganoïden werd eerder in transplantatie-experimenten alleen onder in vivo omstandigheden aangetoond. Bijvoorbeeld, transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide nier-organoïden onder een muis niercapsule maakt de ontwikkeling van de nefron in de organoïde naar een functionele fase⁶.

Een tussenbenadering tussen zuiver in vitro culturen en in vivo transplantatiemethoden is xenotransplantatie naar de CAM van vogelembryo's. Vascularisatie van intacte muis nier primordia is eerder aangetoond met behulp van dit systeem^7,8. Er werd echter ook aangetoond dat de niervasculatuur in de xenotransplanted murinenier was afgeleid van het gastheerendotheel, niet het transplantaat⁹. Deze observatie verminderde het potentieel van chimaerige (aviaire zoogdieren) modellen van embryonale nieren aanzienlijk om de ontwikkeling van de niervasculatuur te bestuderen, omdat de experimentele omstandigheden niet tolerant waren voor het overleven van donor-afgeleide endotheelcellen.

Gepresenteerd in het eerste deel van dit protocol is een verbeterde methode voor de teelt van muis embryonale nieren op CAM van vogeleieren, een combinatie van micromilieuomstandigheden van organotypic cultuur en xenotransplantatie. De belangrijkste verbetering ten opzichte van eerdere methoden is dat in plaats van het plaatsen van de muis embryonale nieren en nierorganoïden direct op de CAM, de implantatie gebied is bedekt met doorlatende minireservoirs gevuld met cultuur medium dat de getransplanteerde weefsel te leveren met voedingsstoffen en te beschermen tegen het drogen. Het slagingspercentage van de experimenten neemt aanzienlijk toe en de voorwaarden voor de ontwikkeling van vasculatuur van donoren verbeteren. Toepassing van deze methode op xenotransplant culturen resulteert in de ontwikkeling van glomeraire vasculatuur bestaat uit endogene endotheelcellen uit donornieren.

Gedetailleerde analyse van cellulaire morfogenese is een andere belangrijke toepassing van niercultuur modellen. Eerder gerapporteerde methoden voor time-lapse beeldverwerving van nierculturen zijn alleen voldoende voor analyse van de algehele morfologie en patronen van embryonale nieren, maar niet voor het bijhouden van individuele cellen¹⁰. Onlangs werd een nieuwe Fixed Z-Direction (FiZD) methode gericht op hoge resolutie confocale 3D time-lapse beeldvorming van nierorganoïden en organotypic culturen beschreven¹¹. Bij deze methode worden de organoïden en embryonale organen voorzichtig samengeperst tussen een glazen afdekkingsslip en een doorlaatbaar membraan van een transwellinsert in een op maat ontworpen plaat totdat de dikte van het monster 70 μm bereikt, wat optimale optische omstandigheden voor beeldvorming biedt. In het tweede deel van de methoden wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor de fabricage van een op maat gemaakte plaat en de opstelling van FiZD-experimenten voor organoïde beeldvorming op lange termijn.

Protocol

De verzorging en procedures van dieren waren in overeenstemming met de Finse nationale wetgeving voor het gebruik van proefdieren, het Europees Verdrag tot bescherming van gewervelde dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (ETS 123) en EU-Richtlijn 86/609/EEG.

1. Vervaardiging van minireservoirs voor de teelt van embryonale nieren van muizen en nierorganoïden op kipCAM en het opzetten van xenotransplantatie-experimenten

1. Gebruik transwell cel cultuur inserts ontworpen voor 6 goed of 12 goed platen.
   LET OP: Afhankelijk van het specifieke experiment kunnen grote of kleine minireservoirs worden gebruikt. Het beste is om kleine minireservoirs te gebruiken voor xenografting tot acht embryonale nieren of wanneer meerdere minireservoirs op hetzelfde kippenembryo worden geplaatst (bijvoorbeeld experiment- en controlemonsters op dezelfde kipCAM).
2. Snijd de zijkanten van de wisselplaten met behulp van een roterende multitool met een cirkelzaagblad of een handzaag om een 2 mm hoge plastic ring te creëren met een doorlaatbaar membraan eraan bevestigd.
3. Poets de randen van deze minireservoirs met een scalpel of een scherp mes.
4. Steriliseer de minireservoirs in 70% ethanol gedurende ten minste 1 uur.
5. Was de minireservoirs in autoclaved dubbel gedestilleerd water en laat ze drogen in een laminaire kap.
6. Spoel de minireservoirs af in PBS en kweekmedium (hoogglucose DMEM/10% FBS/1% penicilline-streptomycine).
7. Plaats het reservoir in een petrischaaltje, bovenop een druppel (600 μL/400 μL) van kweekmedium met het membraan naar boven gericht.
8. Schik ontleed ex vivo embryonale nieren of nierorganoïden gelijkmatig op het membraan met behulp van een pipet of een glazen capillaire buis. Vermijd het verlaten van veel vloeistof rond de nieren.
9. Laat de monsters zich hechten aan het membraan voor 2-24 uur in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO₂.
   OPMERKING: Tot acht E11.5 embryonale muisnieren of nierorganoïden kunnen op de kleine insert worden gerangschikt. De grote wisselplaat wordt aanbevolen als grotere stukken embryonaal weefsel worden gebruikt voor xenotransplantatie of een celhydrogelmengsel op een groter gebied van de CAM.
10. Neem 8-dagen oude ex ovo gekweekte embryonale kippen bereid volgens eerder gepubliceerde methoden uit de cel kweek incubator^12,13.
11. Breng de minireservoirs naar de CAM, zodat de grafts zijn gericht op de CAM, en het membraan overlays hen. Plaats de minireservoirs in de periferie van de CAM, zodat ze het kippenembryo niet bedekken.
    LET OP: Bij het gebruik van de kleinere minireservoirs vervaardigd uit transwell inserts voor 12 putplaten, kunnen maximaal drie minireservoirs op één CAM worden geplaatst.
12. Voeg 500 μL (6 put insert) of 300 μL (12 put insert) van cultuurmedium toe aan de minireservoirs.
13. Cultiveren van de monsters op kip CAM voor een maximum van 9 dagen. Vervang dagelijks het kweekmedium in de minireservoirs.
    OPMERKING: Vascularisatie van de monsters kan worden waargenomen zodra 24-48 uur na transplantatie.

2. Fabricage van op maat ontworpen platen en het opzetten van FiZD-culturen

1. Boor gaten met een diameter van 20 mm in de bodem van een 6-putplaat.
   OPMERKING: Gebruik voor FiZD-experimenten 6 putplaten met een diepte van 16 mm (gespecificeerd in Tabel van materialen).
2. Poets de velgen van de gaten (vooral aan de bovenzijde) met behulp van een elektrische boor met een countersink boor bit, een scalpel, of een scherp mes.
3. Steriliseer de platen in 70% ethanol gedurende ten minste 1 uur.
4. Was de platen in autoclaved dubbel gedestilleerd water en laat ze drogen in steriele omstandigheden.
5. Grondig wassen 22 mm x 22 mm glas afdekkingen met 70% ethanol of reinig ze volgens het gepubliceerde protocol van Saarela et al.¹¹.
6. Lijm de coverslips aan de bovenkant van de gaten in 6 putplaten met behulp van een niet-toxische weefsellijm. Breng lijm rond het gat en plaats voorzichtig de coverslip om het te bedekken. Laat de lijm drogen.
7. Inspecteer de platen onder een stereomicroscoop en verwijder overtollige gedroogde lijm van het oppervlak van de coverslips indien nodig.
   LET OP: Controleer of er geen lijm boven de coverslip om zelfs compressie van de monsters te garanderen.
8. Meng polystyreenkralen (70 μm deeltjesgrootte) met een gelijk volume hydrogel. Een volume van 50-100 μL per put is voldoende.
   LET OP: Houd het mengsel van hydrogel en polystyreen kralen op ijs.
9. Plaats een transwell insert onder een ontleden microscoop met het membraan omhoog.
10. Schik de monsters (bijvoorbeeld ex vivo embryonale nieren of nierorganoïden) gelijkmatig op het membraan.
11. Voeg het hydrogel/polystyreenkraalmengsel voorzichtig naast de monsters toe om schade aan breekbare weefsels te voorkomen.
12. Draai de transwell insert, zodat het membraan met de monsters gemonteerd op het naar beneden.
13. Plaats de insert voorzichtig in een put van de aangepaste 6 putplaat en druk deze voorzichtig naar beneden zodat de monsters op het niveau van de kralen worden samengedrukt.
    LET OP: Volg de voortgang van de compressie met behulp van een microscoop.
14. Houd de insert lichtjes met één hand op de put gedrukt en bevestig deze aan de plaat door plastic te smelten met een soldeerbout op drie punten aan de rand van de wisselplaat.
15. Wanneer de wisselplaat aan de plaat is bevestigd, voegt u 2 mL kweekmedium (DMEM/10% FBS/1% penicilline-streptomycine) toe aan de put en blijft u de resterende putten in de plaat op dezelfde manier monteren.
16. Breng de afgewerkte plaat over naar een incubator op het podium van een omgekeerde microscoop voor time-lapse imaging.
17. Voer time-lapse beeldvorming van de monsters uit met behulp van geschikte experimentele instellingen.
    OPMERKING: Het veranderen van het kweekmedium in de putten van de plaat tijdens time-lapse experimenten is niet nodig, maar kan gemakkelijk worden gedaan door de gaten aan de zijkanten van de wisselplaat.

Resultaten

Het hier gepresenteerde CAM-cultuurprotocol maakte een zeer efficiënte vascularisatie van nierorganoïden en embryonale nieren mogelijk als gevolg van xenotransplantatie op kip CAM(figuur 1, film 1). Minireservoirs met kweekmedium leverden voedingsstoffen aan donorweefsel en beschermden het tegen het drogen gedurende de periode voorafgaand aan de juiste vascularisatie. Deze methode voorzag in tolerante voorwaarden voor donor-afgeleide endotheelcellen om te groeien. Daarom wer...

Discussie

Er worden twee gedetailleerde protocollen gepresenteerd die de klassieke nierorganotypic-kweekmethode verfijnen en vascularisatie, uitgebreide ontwikkeling en optimale 4D-beeldvorming (d.w.z. 3D-beeld en tijd) van ex vivo embryonale nieren en organoïden mogelijk maken. In deze sectie worden de kritieke stappen in de methoden belicht en worden probleemoplossingbesproken.

Het belangrijke verschil tussen andere CAM-kweekmethoden en deze verbeterde kipCAM-kweekmethode is het gebruik van op maat ge...

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Adjustable Spade Drill Bit	Bosch	2609255277	Voor het boren van gaten met een diameter van 20 mm
Automatic Egg Turner	OLBA B.V., Netherlands	AT-42	Voor het incuberen van eieren vóór ex ovo setup.
Cell Incubator	Panasonic	13090543	Temperatuur ingesteld op 37° C, 90% vochtigheid, 5% CO2
Cell Incubator	SANYO	10070347	Chicken CAM-cultuur incubator. Temperatuur ingesteld op 37° C, 90% vochtigheid, 5% CO2
Cellstar 6-well Plate	Greiner	M9062	Putjes met een diepte van 16 mm om overeen te komen met de inserts
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool	Dremel	SC690
Confocal Microscope	Zeiss	LSM780
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts	Corning	10301031	Voor 6-well platen. Poriegrootte van 40 µm
Countersink Drill Bit	Craftomat, Bauhaus	22377902	Voor polijsten (20,5 mm, 1/4", HSS)
Disposable Glass Capillary Tube	Blaubrand	7087 33
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0501
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Drilling Machine	Bosch	GSR 18 V-EC Professional
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D777	Hoge glucose
Egg Incubator Compact S84	Grumbach, Germany	8012	Voor het incuberen van eieren vóór ex ovo setup. Temperatuur ingesteld op 38° C met relatieve vochtigheid ingesteld boven 60%
Ethanol (70%)	VWR
Fertilized Eggs	Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland		Hy-Line White en Nick Chick
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Forceps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Glass Coverslips	Menzel-Gläser	Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##	22x22 mm
Histoacryl Glue	Braun	1050052
Matrigel	Corning	356230
On-stage Incubator	Okolab		Boldline, op maat gemaakt
PBS -/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	Wassen van de mini reservoirs.
Penicillin and Streptomycin	Sigma	P4333
Polystyrene Beads	Corpuscular	1000263-10	70 µm in diameter
Rotary Multi Tool System	Dremel	4000
Soldering Iron	Weller	TCP S	Verwarmde glazen capillair kan ook worden gebruikt
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	657610

```