Methodenartikel

Myofibrils isoleren van skeletspierbiopten en het bepalen van contractielfunctie met een Nano-Newton Resolution Force Transducer

6.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61002

⸱

7 mei 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Amsterdam UMC, 2Department of Kinesiology and Physical Education, Faculty of Education, McGill University, 3IONOptix BV

In dit artikel

Samenvatting

Hier gepresenteerd is een protocol om de contractiele eigenschappen van gestreepte spier myofibrils met nano-Newton resolutie te beoordelen. Het protocol maakt gebruik van een setup met een interferometrie-gebaseerde, optische kracht sonde. Deze opstelling genereert gegevens met een hoge signaal-ruisverhouding en maakt de beoordeling van de contractiele kinetiek van myofibrils mogelijk.

Samenvatting

Gestreepte spiercellen zijn onmisbaar voor de activiteit van mens en dier. Enkele spiervezels bestaan uit myofibrils, die bestaan uit serieel verbonden sarcomeres, de kleinste contractiele eenheden in de spier. Sarcomerische disfunctie draagt bij aan spierzwakte bij patiënten met mutaties in genen die coderen voor sarcomerische eiwitten. De studie van myofibril mechanica maakt het mogelijk voor de beoordeling van actin-myosine interacties zonder mogelijke verstorende effecten van beschadigde, aangrenzende myofibrils bij het meten van de contractiliteit van enkele spiervezels. Ultrastructurele schade en verkeerde uitlijning van myofibrils kunnen bijdragen tot verminderde contractiliteit. Als er structurele schade aanwezig is in de myofibrils, breken ze waarschijnlijk tijdens de isolatieprocedure of tijdens het experiment. Bovendien geven studies in myofibrils de beoordeling van actin-myosine interacties in aanwezigheid van de geometrische beperkingen van de sarcomeres. Metingen in myofibrils kunnen bijvoorbeeld duidelijk maken of myofibrillar disfunctie het primaire effect is van een mutatie in een sarcomerisch eiwit. Bovendien is perfusie met calciumoplossingen of verbindingen bijna direct te wijten aan de kleine diameter van de myofibril. Dit maakt myofibrils bij uitstek geschikt om de snelheid van activering en ontspanning tijdens de krachtproductie te meten. Het protocol beschreven in dit document maakt gebruik van een optische kracht sonde gebaseerd op het principe van een Fabry-Pérot interferometer in staat om krachten te meten in de nano-Newton bereik, gekoppeld aan een piëzo lengte motor en een snelle perfusie systeem. Deze setup maakt het mogelijk om myofibril mechanica met hoge resolutie krachtmetingen te bestuderen.

Inleiding

Gestreepte spiercellen zijn onmisbaar voor dagelijkse activiteiten. Limb beweging, ademhalingsfunctie, en de pompende beweging van het hart vertrouwen op de kracht gegenereerd door spiercellen. Skeletspier bestaat uit spiersfalo's met bundels van enkele spiervezels(figuur 1A). Deze spiervezels bestaan uit myofibrils, die worden gevormd door serieel verbonden sarcomeres (figuur 1B,D). De sarcomeres bevatten dunne en dikke filamenten. Deze bestaan voornamelijk uit ketens van actine- en myosinemoleculen (figuur 1B). Actin-myosine interacties zijn verantwoordelijk voor de kracht-genererende capaciteit van de spier. Patiënten met mutaties in genen die coderen voor sarcomerische eiwitten, zoals neveline, actine en troponine T, lijden aan spierzwakte als gevolg van contractieldisfunctie1.

De kwaliteit van spiercontractiliteit kan worden bestudeerd op verschillende niveaus van organisatie, variërend van in vivo hele spieren tot actin-myosine interacties in in vitro motility testen. In de afgelopen decennia hebben verschillende onderzoeksgroepen opstellingen ontwikkeld om de contractiliteit van individuele myofibrils2,3,4,5,6,7,,8,98,,10te bepalen ., Deze opstellingen zijn gebaseerd op de detectie van veranderingen in laserafbuiging van een cantilever (d.w.z. optische straalafbuiging) veroorzaakt door de samentrekking van de myofibril (zie Labuda et al.11). Hoewel het bepalen van de contractiele functie van myofibrils een aantal beperkingen heeft (bijvoorbeeld de dynamiek van de excitatie-contractiekoppelingsprocessen die stroomopwaarts van de myofibrils zijn, ontbreken er meerdere voordelen aan deze aanpak. Deze omvatten: 1) de mogelijkheid om actin-myosine interacties te beoordelen in aanwezigheid van de geometrische beperkingen van de sarcomeres; 2) de mogelijkheid om actin-myosine interacties te beoordelen zonder mogelijke verstorende effecten van beschadigde, aangrenzende myofibrils (bij het meten van de contractiliteit van enkele spiervezels ultrastructurale schade en verkeerde uitlijning van myofibrils zou kunnen bijdragen tot verminderde contractiliteit) (Figuur 1D); 3) de kleine diameter van myofibrils (~ 1 μm, figuur 2A) en het ontbreken van membranen zorgen voor bijna onmiddellijke calciumdiffusie in de sarcomeres. Bovendien, als structurele schade aanwezig is in de myofibrils, ze waarschijnlijk breken tijdens hun isolatie of tijdens het experiment. Vandaar dat het beoordelen van myofibril contractiliteit een elegante methode is om de basismechanismen van spiercontractie te bestuderen en te begrijpen of verstoorde actin-myosine-interacties de primaire oorzaak zijn van spierziekte veroorzaakt door mutaties in sarcomerische eiwitten.

Dit protocol presenteert een nieuw ontwikkelde setup om de contractiliteit van myofibrils met een cantilever kracht sonde met nano-Newton resolutie (dwz, Optiforce) te bepalen. Deze force probe is gebaseerd op het principe van interferometrie. Interferometrie maakt het gebruik van relatief stijve cantilevers mogelijk. Dit maakt het mogelijk om kracht te meten met weinig afbuiging van de cantilever, naderende isometrische samentrekkingen van de myofibril. De sonde maakt het mogelijk om lage passieve en actieve krachten te beoordelen die worden geproduceerd door een enkele myofibril geïsoleerd van verschillende spierbiopten, waaronder die van menselijke proefpersonen, met een hoge signaal-ruisverhouding. De optische cantilever force probe die in deze opstelling is opgenomen is gebaseerd op een Fabry-Pérot interferometer12. De interferometer detecteert kleine verplaatsingen tussen een optische vezel en een goudgecoate cantilever gemonteerd op een ferrule (figuur 3). De kloof tussen de optische vezel en de cantilever wordt de Fabry-Pérot holte genoemd. Myofibrils zijn gemonteerd tussen de sonde en piëzo motor met behulp van twee lijm-gecoate glas montage vezels. De kracht geproduceerd door de myofibril kan wiskundig worden afgeleid uit de interferometer gegevens. Interferometrie is gebaseerd op de superpositie of interferentie van twee of meer golven (in deze opstelling drie lichtgolven). Laserlicht met een golflengte tussen 1.528,77–1.563,85 nm wordt uitgestoten door de interferometer en wordt via de glasvezel verzonden. In de sonde wordt het licht gereflecteerd 1) op de interface tussen de optische vezel en het medium (figuur 3A); 2) op de interface van het medium en de cantilever (Figuur 3B); en 3) op de interface tussen de metalen en gouden coating van de cantilever (Figuur 3C). De reflectie bij interface A en B is afhankelijk van de brekingsindex(n)van het medium waarin de sonde wordt ondergedompeld. Het licht, bestaande uit de drie bovenliggende reflecties, keert terug naar een fotodiode in de interferometer. De fotodiode meet de intensiteit van het licht, wat het gevolg is van het interferentiepatroon van de drie boven elkaar geplaatste reflecties. Wanneer contractielkracht wordt gegenereerd door het activeren of uitrekken van een myofibril, trekt de myofibril aan de cantilever. Deze beweging verandert de spouwgrootte(d) en dus het aantal golflengten dat in de holte past. Het licht gereflecteerd op de cantilever zal een andere fase hebben, wat resulteert in een ander interferentiepatroon. De fotodiode registreert deze verandering van interferentie patroon intensiteit als een verandering in Volts. Vervolgens wordt myofibril krachtgeneratie berekend op basis van deze verandering, rekening houdend met de cantilever stijfheid. De krachtsonde wordt door de fabrikant gekalibreerd door het puntje van de montagenaald, bevestigd aan het vrije handeind van de cantilever, tegen een weegschaal te duwen terwijl het buigen van de cantilever gelijk blijft aan een veelvoud van de golflengte van de uitleeslaser13. Interferometrie is dus een zeer gevoelige methode om kleine veranderingen in afstand te detecteren, waardoor krachten met een nano-Newtonresolutie kunnen worden gemeten. Deze resolutie maakt de beoordeling van myofibrillar kracht productie met een hoge signaal-ruisverhouding. Terwijl traditionele interferometrie het bereik van metingen beperkt tot het lineaire deel van de interferentiecurve, overwint het gebruik van een lock-in versterker en modulatie van de lasergolflengte deze beperking14. Dit wordt nader toegelicht in de discussiesectie.

Om de actieve spanning van myofibril te meten, werd een fast-step perfusiesysteem geïntegreerd om de myofibril bloot te stellen aan calciumoplossingen(figuur 4A). Het snelle perfusiesysteem zorgt ervoor dat oplossingswijzigingen binnen 10 ms kunnen plaatsvinden. Vanwege hun kleine diameter is calciumdiffusie in de myofibrils bijna onmiddellijk. Daarom is dit systeem bijzonder geschikt voor het meten van de snelheid van actin-myosine binding tijdens activering en release tijdens ontspanning. De snelheid van activering (kACT)en ontspanning (kREL)kunnen worden bepaald aan de hand van de activatie-ontspanningscurven. Ook, door het blootstellen van de myofibrils aan calcium oplossingen van toenemende concentratie, de kracht-calcium relatie en calcium gevoeligheid kan worden bepaald.

Bovendien maakt een piëzolengtemotor het snel uitrekken en verkorten van de myofibril mogelijk. Dit biedt de mogelijkheid om de visco-elastische eigenschappen (d.w.z. passieve spanning) van de myofibril te bestuderen, evenals het uitvoeren van een snelle verkorting en restretch van de myofibril om de snelheid van spanningsherontwikkeling (kTR)te bepalen. De parameters die uit zowel actieve als passieve spanningsexperimenten worden opgehaald, kunnen worden gewijzigd door genmutaties in een sarcomerisch eiwit.

Deze op maat gemaakte setup werd gebruikt om de actieve en passieve contractiele kenmerken van myofibrils geïsoleerd van gezonde menselijke, geduldige en muis skeletspieren te meten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het protocol voor het verkrijgen van menselijke biopten werd goedgekeurd door de instellingscommissie van het VU Medisch Centrum (#2014/396) en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van de proefpersonen. Het protocol voor het verkrijgen van dierlijke spierbiopten werd goedgekeurd door de lokale comité voor dierethiek van de Vrije Universiteit (AVD114002016501)

1. Voorbereiding en myofibril-isolatie

OPMERKING: Gebruik eerder beschreven methoden om biopten te glycereren, bereid de verschillende calciumconcentratie (pCa) oplossingenvoor 7,16,17en isoleert myofibrils2,18.

  1. Ontdooi de ontspannende (pCa 9.0, Rx) en activerende (pCa 4.5, Act) oplossingen evenals de remmers (1 M E64, 1 M DTT, 1 M leupeptine, 1 M PMSF), die worden opgeslagen bij -80 °C.
  2. Neem een glycerinated stuk gestreepte spierbiopsie van ongeveer 1 mm3 en plaats het in een kleine Petri schotel met 1:1 Rx/glycerol (v/v) oplossing en plaats de Petri schotel op een koude plaat bij 4 °C.
  3. Ontleden het stuk spier met behulp van dissectie microscoop en tangen, het scheiden van enkele spiervezels zonder ze te isoleren van het stuk van de spier.
    OPMERKING: Verwijder zoveel mogelijk vet en bindweefsel om de besmetting van de myofibril suspensie te voorkomen.
  4. Breng het stuk ontleed weefsel over in een buis van 5 mL met 1,5 mL ontspannende oplossing met remmers (1 μL/mL E-64, 1 μL/mL leupeptine, 1 μL/mL DTT en 125 μL/mL PMSF). Laat het weefsel gedurende 1 uur bij ongeveer 4 °C temperen.
  5. Tijdens de incubatie starten beide pc's, schakel u de apparaten in en opent u de bijbehorende software (zie Tabel met materialen).
  6. Dompel de krachtsonde onder in ultrazuiver water in een petrischaal en kalibreer de sonde.
    1. Druk op de'Wizard Starten'op de interferometer en volg de instructies op het scherm. Na het indrukken van Kalibreren,tik op de microscoop podium.
      OPMERKING: Tikken op de microscoop stadium zal leiden tot de cantilever af te buigen en door franjes. Dit maakt kalibratie van de sonde mogelijk.
    2. Laat de sonde ondergedompeld in het ultrazuivere water in de petrischaal na kalibratie.
  7. Initialiseer de piëzomotorpositie. Volg hiervoor een van de onderstaande stappen.
    1. Wanneer de piëzomotor zal worden gebruikt voor kTR spanning, stel de lengte in op 0 μm.
      De instellingen van de signaalgenerator zijn te vinden in tabel 1, figuur 5A.
    2. Wanneer de piëzomotor wordt gebruikt voor passieve spanning, stelt u de lengte in op 50 μm.
      De instellingen van de signaalgenerator zijn te vinden in tabel 1.
      LET OP: Het verschil tussen de stappen is de initiële positie van de piëzolengtemotor. Om de myofibril uit te rekken, moet de piëzomotor trekken om de afstand tussen beide montagenaalden te vergroten en de myofibril te verlengen. Om de myofibril te verslappen, moet de piëzomotor duwen om de afstand tussen beide montagenaalden te verkleinen en de myofibril te verkorten.
  8. Maak een microscoopplaat. Pipette 150 μL polyhydroxyethylmethacrylaat (poly-HEMA) oplossing (5% poly-HEMA in 95% ethanol, w/v) op een microscoopglijbaan en spreid het over de glijbaan zodat het allemaal bedekt is.
    LET OP: Als een myofibril hang is pipetted op een ongecoate microscoop dia, de myofibrils die zinken naar de bodem zal vasthouden aan de microscoop dia en het zal niet mogelijk zijn om ze te lijmen.
  9. Vul spuiten met pCa-oplossingen (zie figuur 4A)en prime het perfusiesysteem.
    LET OP: In deze stappen worden alle buizen voorgevuld met de juiste oplossing om ervoor te zorgen dat alle luchtbellen uit de slang worden verwijderd.
    1. Vul de instroombuizen van de achtergrondstroom van de stroomkamer(figuur 3, 4A)met Rx.
    2. Spoel bij gebruik het spruitstuk door met ultrazuiver water om lucht te verwijderen. Sluit hiervoor de spuit met ultrazuiver water aan op de uitlaat en spoel erin in de omgekeerde richting. Blokkeer de ongebruikte poorten van het spruitstuk.
    3. Laat elke pCa spuit om hun respectieve buizen te vullen met pCa-oplossing. Sluit ze vervolgens aan op het spruitstuk en het Ɵ-glas.
    4. Open kleppen 1 en 6 met de data-acquisitie panel software (zie Tabel van materialen) door het controleren van de knop '1 +6' (Figuur 6A) om de Ɵ-glas te vullen met de ontspannende (pCa 9.0) en het activeren (4.5) oplossingen en sluit kleppen wanneer de Ɵ-glas is gevuld (Figuur 6B).

2. Montage van een myofibril

  1. Bekleed een microscoopplaat met poly-HEMA om te voorkomen dat myofibrils aan het glas blijven plakken.
  2. Bereid de homogenisator (zie Tabel van materialen)voor op weefselhomogenisatie. Reinig de interne rotorstaaf met schoon tissuepapier, monteer de homogenisator en draai 1x voor 15 s in alcohol en driemaal voor 15 s per stuk in ultrazuiver water. Prerinse de homogenisator in ontspannende oplossing 1 x voor 15 s op ijs.
  3. Plaats de homogenisatorstaaf in de buis met het spierweefsel zoals beschreven in stap 1.4 en draai, terwijl u de buis op ijs houdt, de rotor 15 s op snelheid 5 om het spierweefsel te scheuren en een myofibril-suspensie te verkrijgen.
  4. Pipette ~50 μL van de myofibril suspensie en ~250 μL van de ontspannende oplossing op de microscoopglijbaan bekleed met poly-HEMA in het weefselbad. Dit zal een vloeibare druppel vormen. Bedek het bad met een deksel om te beschermen tegen stof en wacht 5-10 minuten om de myofibrils naar de bodem te laten zinken.
    LET OP: De verhouding tussen de ophanging en de ontspannende oplossing is afhankelijk van de kwaliteit van de isolatie, dus dienovereenkomstig aan te passen. Bijvoorbeeld, als de myofibril opbrengst laag is en weinig geschikte myofibrils aanwezig zijn in de ophanging, voeg meer myofibril suspensie toe en verdun met minder ontspannende oplossing (bijvoorbeeld 75 μL myofibril suspensie en 225 μL ontspannende oplossing). Hart- en skeletspierweefsel is gemakkelijk te herkennen door het strepenpatroon. Met behulp van een 10x of 40x doelstelling, dit patroon is ook zichtbaar in een enkele myofibril. In het geval dat er ander weefsel in de suspensie aanwezig is, kunnen myofibrils visueel worden geselecteerd. Men kan overslaan de 5-10 min wachten. Dit verhoogt echter de moeilijkheid van het lijmen van een myofibril.
  5. Coat montagenaalden met lijm (shellac + ethanol; 120 mg shellac in 2 mL van 70% ethanol). Verwarm hiervoor de lijm op 65 °C voor 30-60 s en pipet ~6 μL op een nieuwe ongecoate glazen schuif. Dompel de punt van elke montagenaald in de lijm en herhaal tot een laag lijm zichtbaar is. Beweeg de sonde en piëzo verticaal met de micromanipulatoren om ruimte te maken om het weefselbad op het microscoopstadium te plaatsen. Verwijder de glazen schuif met de lijm.
  6. Montage van de myofibrils
    1. Plaats het weefselbad met de microscoopplaat bedekt met poly-HEMA met de myofibril suspensie op het microscooppodium. Gebruik het podium om een geschikte myofibril te vinden met de 40x doelstelling. Indien nodig, bewegen en draaien van het weefsel bad om de myofibril te verplaatsen naar een bestelbare positie.
      OPMERKING: Zoek naar myofibrils met een zichtbaar strepenpatroon van ongeveer 30 μm lang. Zoals in detail beschreven in de stappen 3.1 en 3.2.1 is het mogelijk om de lengte en sarcomere lengte te controleren voordat de myofibril wordt gelijmd. Lijm gescheurde myofibrils niet, omdat deze waarschijnlijk zullen breken tijdens contractie.
    2. Schuif de stroomkamer direct boven de vloeistofdruppel met de myofibrils in het weefselbad (gepipeteerd op de glijbaan in stap 2.4) en laat deze zakken. Stop voordat het de vloeistofdruppel raakt.
    3. Laat de piëzo-montagenaald zakken en druk deze op de onderste punt van de myofibril. Til het iets op om te controleren of de myofibril aan de naald is bevestigd.
    4. Laat de stroomkamer ver genoeg zakken voor de montagenaald van de sonde om de bodem te bereiken zonder dat de sonde de stroomkamer aanraakt.
    5. Druk op de montagenaald van de sonde op het bovenste puntje van de myofibril. Til het iets op om te controleren of de myofibril aan de naald is bevestigd.
    6. Til de myofibril zo ver mogelijk van de bodem van het bad op zonder de mogelijkheid te verliezen om scherp te stellen zonder dat het doel de onderkant van het glas aanraakt.

3. Initialiserend experiment

  1. Gebruik de software voor micromanipulatoren, camera en systeemcontroller(figuur 7A, zie Tabel van materialen)om de sarcomerelengte te meten. Verplaats de piëzo- en/of krachtsonde om de initiële sarcomerelengte van de myofibril in te stellen op 2,5 μm.
    LET OP: Een sarcomerelengte van 2,5 μm zorgt voor een optimale overlap tussen myosinekoppen en actine.
  2. Met behulp van de vatfunctie van de systeemcontroller-software meet de myofibrillengte en -breedte(figuur 7B,C).
    OPMERKING: Bij het draaien van de camera kan deze horizontaal en/of verticaal kantelen. Om de uitlijning van de camera te controleren, kan een spirit level worden gebruikt om te controleren of de camera is gedraaid en niet gekanteld.
    1. Plaats de myofibril in het midden van het videobeeld met behulp van het microscoopstadium.
    2. Teken een vierkant van de ene kant van de myofibril naar de andere. Zorg er voor de lengte voor dat u de donkere rand van de lijmdruppels(Figuur 2A)in het vierkant opneemt, omdat de beeldverwerking is gebaseerd op contrast.
    3. Begin met het opnemen van de gegevens in de systeemcontrollersoftware (zie Tabel van materialen)door op 'Start'te drukken en na 5 s pauze de systeemcontroller software gegevens opname door op de knop' Pauze' te drukken. De lengte wordt nu vastgelegd in de gegevens.
    4. Voor de breedte eerst draaien de camera 90° (zie Tabel van materialen)en gebruik dan het contrast van de rand van de myofibril zelf.
    5. Begin met het opnemen van de gegevens in de systeemcontrollersoftware (zie Tabel van materialen)door op 'Start'te drukken en na 5 s pauze de systeemcontroller software gegevens opname door op de knop'Pauze' te drukken. De breedte wordt nu vastgelegd in de gegevens.
  3. Als actieve spanning van de myofibril moet worden bepaald, moet de perfusie-setup worden gebruikt. Als dat zo is, blijf dan stap 3.4. Als alleen passieve spanning wordt bepaald, sla stappen 3.4–4.1.3.7 over en ga verder bij stap 4.2.
  4. Plaats en initialiseer de perfusiesetup.
    LET OP: Dit is alleen nodig voor het genereren van actieve kracht. Blijf stap 4.2 bij het uitvoeren van passieve spanningsexperimenten.
    1. Stel de snelle motorpositie in op 4 V (Figuur 5B).
    2. Schuif de perfusiestandaard op de tafel om de linkerbenedenhoek van de standaard uit te lijnen met de tape op de tafel.
      LET OP: Let op: Zorg ervoor dat u de krachtsonde of de piëzomotor niet raakt.
    3. Gebruik de manipulator om de Ɵ glas ruwweg door het oog te positioneren.
    4. Kijk door het oculair en beweeg het Ɵ glas voorzichtig naar de myofibril met behulp van de manipulator.
    5. Lijn het bovenste kanaal van het Ɵ-glas uit met de myofibril met behulp van de manipulator en controleer de positie door het uitvoeren van een snelle stap (signaalgenerator instellingen kan worden gevonden in tabel 1) met de systeemcontroller software (Figuur 2B–C, zie Tabel van Materialen).
      LET OP: Zorg ervoor dat het onderste kanaal wordt uitgelijnd met de myofibril tijdens de activeringsfase van de fast-step(figuur 2B–C).
  5. Schakel de achtergrondstroom van Rx (Figuur 4A) in om een laminaire achtergrondstroom in de stroomkamer te maken.
    OPMERKING: De achtergrondstroom is nodig om turbulente doorstroming als gevolg van de pCa-oplossingsstroom van het Ɵ-glas te voorkomen.
    1. Zet de instroom van de stroomkamer aan met een Luer-klephendel.
      1. Stuur de volgende parameters naar de uitstroompomp om te beginnen met het aftappen van de stroomkamer en overloop van de stroomkamer te voorkomen (Figuur 9): Klep = Badklep (2); Microstep-modus = Micro; Plunger doel = 48.000; Zuigersnelheid = 38–40 (willekeurig).
        LET OP: Zorg ervoor dat het vloeistofniveau te allen tijde stabiel is. De myofibril mag niet droog lopen en mag de cantilever ook niet. Het is beter om een beetje overloop dan te weinig stroom.
  6. Voer de gewenste temperatuur in en druk op 'Figure 8Start'. Table of Materials Wacht tot de gewenste temperatuur is bereikt door de grafiek in de software voor thermo-elektrische temperatuurregelaar te controleren en ga verder.
    OPMERKING: Bij het uitvoeren van experimenten bij kamertemperatuur hoeft de thermo-elektrische temperatuurregelaar niet te worden gebruikt.

4. Experimenteel protocol(en)

  1. Bepaal welke active force protocols moeten worden uitgevoerd.
    OPMERKING: Afhankelijk van de gegevens die nodig zijn voor het onderzoek, kunnen meerdere soorten experimenten met actieve kracht worden uitgevoerd: stap 4.1.1, meting van de maximale kracht bij verzadiging [Ca2+]; stap 4.1.2, waarbij een Force-pCa-curve wordt verkrijgt om de calciumgevoeligheid te bepalen naast stap 4.1.1; stap 4.1.3, waarbij het spanningstempo wordt bepaald door naast stap 4.1.1 of 4.1.2 een verkortingsprotocol te maken.
    1. Meet maximale actieve kracht.
      1. Begin met het opnemen van de gegevens in de systeemcontrollersoftware (zie Tabel van Materialen)door op 'Start'te drukken.
      2. Open kleppen 1 en 6 met het data-acquisitiepaneel (zie Tabel van Materialen)software door de knop '1+6'te controleren om Ɵ-glasstroom van de ontspannende oplossing en activerende oplossing door de Ɵ-glas te starten (Figuur 6A).
      3. Reset het bereik van de interferometer zodat de basiskracht 0 V is door 'Resetbereik'op de interferometer te selecteren en te drukken (zie Tabel met materialen).
      4. Wanneer het krachtspoor stabiel is, voert u de Ɵ-glassnelle stap uit (stapgrootte = 100 μm).
        De instellingen van de signaalgenerator zijn te vinden in tabel 1 (figuur 5C). Een activeringsontspanningsspoor dat vergelijkbaar is met figuur 4D wordt geregistreerd en zichtbaar in de software van de systeemcontroller.
      5. Pauzeer de registratie van de systeemcontrollersoftware door op de knop'Pauze'te drukken.
      6. Als er geen activeringen meer moeten worden uitgevoerd, sluit dan de kleppen 1 en 6 om Ɵ-glasstroom te stoppen door de knop '1+6' (Figuur 6B)uit te vinken, stop de spuitpomp (Figuur 9, zie Tabel van Materialen) door op 'Terminate'te drukken en stop de achtergrondstroom door de Luerklep te sluiten.
    2. Force-pCa-curve
      OPMERKING: Dit is vergelijkbaar met stap 4.1.1 om de maximale actieve kracht te verkrijgen, maar met meerdere activeringen met behulp van verschillende pCa-oplossingen.
      1. Begin met het opnemen van de gegevens in de systeemcontrollersoftware door op'Start'te drukken.
      2. Open kleppen 1 en 2 met de data acquisition panel software om de stroom van ontspannende oplossing en pCa 6.2 door de Ɵ-glas te starten.
      3. Reset het bereik van de interferometer zodat de basiskracht 0 V is door 'Resetbereik'op de interferometer te selecteren en te drukken.
      4. Wanneer het krachtspoor stabiel is, voert u de Ɵ-glassnelle stap uit (stapgrootte = 100 μm).
        De instellingen van de signaalgenerator zijn te vinden in tabel 1.
      5. Pauzeer de systeemcontrollersoftware door op de knop'Pauze'te drukken.
      6. Herhaal de stappen 4.1.2.1–4.1.2.4 voor kleppen 1 en 3 (pCa 5.8), kleppen 1 en 4 (pCa 5.6), kleppen 1 en 5 (pCa 5.4) en kleppen 1 en 6 (pCa 4.5).
      7. Als er geen activeringen meer moeten worden uitgevoerd, sluit dan de kleppen 1 en 6 om Ɵ-glasstroom te stoppen door de knop '1+6' (Figuur 6A)uit te vinken, stop de spuitpomp (figuur 9) door op 'Terminate'te drukken en stop de achtergrondstroom door de Luer-klep te sluiten.
    3. Meetsnelheid van spanningsherontwikkeling (kTR).
      OPMERKING: Dit is vergelijkbaar met stap 4.1.1 voor maximale actieve kracht, maar met enkele wijzigingen en toegevoegde stappen.
      1. Bereken de piëzobeweging die nodig is om de myofibril 15% te verslappen en voer deze waarde in de signaalgenerator in (figuur 5D, tabel 1).
      2. Begin met het opnemen van de gegevens in de systeemcontrollersoftware door op 'Start'te drukken.
      3. Open kleppen 1 en 6 met het data acquisition panel(Figuur 6A)software om de stroom van de ontspannende oplossing en pCa 4.5 door de Ɵ-glas te starten.
      4. Reset het bereik van de interferometer zodat de basiskracht 0 V is door 'Resetbereik'op de interferometer te selecteren en te drukken.
      5. Wanneer het krachtspoor stabiel is, voert u de Ɵ-glassnelle stap uit (stapgrootte = 100 μm).
        De instellingen van de signaalgenerator zijn te vinden in tabel 1.
      6. Wanneer het krachtplateau is bereikt, voert u de verkortingsrestretch uit met de piëzo.
        De instellingen van de signaalgenerator zijn te vinden in (Figuur 5D, Tabel 1). Een activeringsontspanningsspoor dat vergelijkbaar is met figuur 4E wordt geregistreerd en zichtbaar in de systeemcontrollersoftware.
        OPMERKING: Er kan een aangepast protocol worden gemaakt om de bovenstaande stappen te automatiseren.
      7. Pauzeer de systeemcontrollersoftware door op de knop'Pauze'te drukken.
      8. Als er geen activeringen meer moeten worden uitgevoerd, sluit dan de kleppen 1 en 6 om Ɵ-glasstroom te stoppen door de knop '1+6' (Figuur 6B)uit te vinken, stop de spuitpomp (Figuur 9) door op 'Terminate'te drukken en stop de achtergrondstroom door de Luer-klep te sluiten.
  2. Passieve krachtmetingen uitvoeren.
    1. Voer een continu stuk uit.
      1. Bereken de piëzobeweging die nodig is om de myofibril uit te rekken en voer deze waarde in de signaalgenerator in(tabel 1).
        OPMERKING: Dit zijn voorbeeldinstellingen. Bereken de hoeveelheid rek en de tijd van rek ten opzichte van de sarcomere lengte. Deze instellingen zijn nodig om ervoor te zorgen dat de snelheid van rek per sarcomere gelijk blijft over myofibrils.
      2. Begin met het opnemen van de gegevens in de systeemcontrollersoftware door op 'Start'te drukken.
      3. Reset het bereik van de interferometer zodat de basiskracht 0 V is door 'Resetbereik'op de interferometer te selecteren en te drukken.
      4. Voer continu stretch uit met de signaalgenerator in de systeemcontrollersoftware om de piëzo te bedienen. De instellingen van voorbeeldsignaalgeneratoren zijn te vinden in tabel 1.
      5. Verkort de myofibril tot slappe lengte met de piëzo nadat de rek is voltooid(Tabel 1).
    2. Voer een stapsgewijs stuk uit.
      1. Begin met het opnemen van de gegevens in de systeemcontrollersoftware door op 'Start'te drukken.
      2. Reset het bereik van de interferometer zodat de basiskracht 0 V is door 'Resetbereik'op de interferometer te selecteren en te drukken.
      3. Voer een stapsgewijs stretch uit met de signaalgenerator in de systeemcontrollersoftware om de piëzo te bedienen. De instellingen van voorbeeldsignaalgeneratoren zijn te vinden in tabel 1 (figuur 5E).
    3. Verkort de myofibril tot slappe lengte met de piëzo nadat de rek is voltooid. De instellingen van voorbeeldsignaalgeneratoren zijn te vinden in tabel 1.
  3. Pauzeer de systeemcontrollersoftware door op de knop'Pauze'te drukken.
  4. Stop de registratie van gegevens door op de knop' Stop'in de systeemcontrollersoftware te drukken.
  5. Sla de gegevens op door op 'Bestand' en 'Save Data'te drukken in de software van de systeemcontroller.

5. Schoonmaken

  1. Verwijder de gemeten myofibril en bereid je voor op de volgende myofibril.
    1. Om dit te doen, voorzichtig afscheuren van de myofibril tijdens het kijken door de oculaire met de 40x doelstelling.
    2. Verplaats de krachtsonde en piëzo. Ga omhoog de Ɵ-glas helemaal naar boven, naar rechts en naar achteren. Ga dan omhoog en schuif de stroomkamer weg. Verwijder het weefselbad.
    3. Om de montagenaald schoon te maken, breng deze in beeld met behulp van de 10x en de oculair. Dompel de borstel in ethanol en borstel voorzichtig af en verwijder de lijm van de naald.
      OPMERKING: Houd er rekening mee dat het enige tijd kan duren voordat de lijm loskomt.
    4. Spoel de flow chamber en weefsel bad met ultrazuiver water.
    5. Plaats de sonde in een kleine petrischaal gevuld met ultrazuiver water. Zorg ervoor dat de sonde volledig onder water is.
  2. Wanneer de experimenten zijn voltooid, reinigt u de installatie zoals hierboven en voert u de volgende extra stappen uit.
    1. Maak de slang leeg uit het stroombad. Stuur de parameters naar de uitstroomspuitpomp (zie tabel met materialen, figuur 9). Klep = Badklep (2); Microstep-modus = Normaal; Zuigerdoel = 0; Zuigersnelheid = 30.
      OPMERKING: Beëindig de opdracht wanneer de slang leeg is.
    2. Initialiseer de pomp meerdere malen(figuur 9B).
    3. Giet de spuiten af. Om dit te doen, sluit alle Luer kleppen, open alle kleppen, verwijder de slang van de naald van de spuit, houd de buis van specifieke pCa onder de naald, en open de Luer klep. Gebruik de drukpluggen om het proces te versnellen.
    4. Plaats de slang opnieuw aan de naald van de spuit. Vul spuiten met ~ 5 mL ultrazuiver water. Plaats een kopje onder de Ɵ-glas. Open alle kleppen en open de drukklep om het systeem te spoelen.
    5. Sluit het systeem af. Schakel het stroomblok van de pc, interferometer en piëzo-controller uit.

6. Gegevensanalyse

  1. Exporteer gegevenssporen van de systeemcontrollersoftware (zie Tabel van materialen)naar een spreadsheetsoftwareprogramma of klembord door het gegevensbestand te openen en het gewenste segment te selecteren. De getoonde sporen worden geëxporteerd (bijvoorbeeld ruwe kracht, sarcomerelengte en piëzopositie).
  2. Analyse uitvoeren met de software van keuze (bijv. MATLAB).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Gegevenssporen werden geregistreerd en geopend met de systeemcontrollersoftware (zie Tabel van Materialen). Volledige sporen of geselecteerde segmenten werden geëxporteerd naar het klembord of tekstbestand voor verdere analyse met een gewenste software. Kleppen om de stroom van de verschillende oplossingen te regelen werden geschakeld met aangepaste software of handmatig. Een aangepaste MATLAB script werd gebruikt om de tarieven van activering, spanning herontwikkeling, en ontspanning te analyseren. De m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Beschreven is een protocol om de contractiele functie van myofibrils geïsoleerd van menselijke of dierlijke skeletspierweefsels te beoordelen. De krachtresolutie van deze opstelling is al eerder beschreven door Chavan et al.12. Kortom, het wordt bepaald door de willekeurige schommelingen van de lengte van de Fabry-Pérot holte gevormd tussen de detectievezel en de cantilever, die het dominante deel van het geluid produceren bij de uitgang van de uitlezing (uitgedrukt in V) die, vermenigvuldigd met ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Michiel Helmes is aandeelhouder en mede-eigenaar van IONOptix Inc.

Dankbetuigingen

Dit project werd gefinancierd door AFM-Telethon en A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies. De auteurs willen de maker van de producten die in dit artikel, IONOptix Inc.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bio Spec Products, Inc.985370-XLOm myofibrillen te isoleren
Op maat gecodeerdMatlab
Op maat vervaardigdInclusief Labview-programma voor besturing via seriële verbinding; Voor het bedienen van kleppen
Op maat vervaardigdOm de Peltier-module te koelen
Op maat vervaardigd
Op maat vervaardigdAluminium weefselkamer
Op maat vervaardigdVoor het bedienen van de kleppen; Inclusief pc-software voor besturing via USB
IonOptixSysteemcontrollersoftware: data-opnamesoftware met geavanceerde signaalgenerator voor piezo en fast-step
IonOptixMCS100Om sarcomeerlengte op te nemen
IonOptixInclusief: Optiforce (interferometer), micromanipulators, signaalinterface, piezomotor en controller. Gebaseerd op de MyoStretcher
IonOptixKrachtsonde
KoolanceADT-EX004S
KoolanceEX2-755Om de Peltier-module te koelen
MicrosoftGegevensregistratie
OlympusIX71
OlympusTH4-200
Sigma-Aldrich529265Poly(2-hydroxyethyl methacrylaat); Coating voor microscoopglazen om aanhechten van weefsel te voorkomen
Sigma-Aldrich78471Kristallen om op te lossen in ethanol resulterend in lijm
TE Technology, Inc.TE-63-1.0-1.3Om de weefselstroomkamer te koelen
TE Technology, Inc.TC-720Inclusief pc-software voor besturing via USB
Tecan Trading AG20736652
Tecan Trading AG20739263Spuitpomp om achtergrondstroom samen met fast-step perfusiesysteem te induceren; Uitstroming uit weefselstroomkamer
Thermo scientific2441081
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)Niet langer verkrijgbaarAlternatief: SF-77CST/VCS-77CSP
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)TG150-4Om het weefsel te perfunderen
1 pc voor IonWizard en 1 pc voor andere software

Referenties

  1. Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
  2. Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, Pt 2 535-548 (1997).
  3. Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
  4. Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, Suppl 1 127-135 (2002).
  5. Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
  6. Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
  7. Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
  8. de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
  9. Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
  10. Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
  11. Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701(2011).
  12. Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110(2012).
  13. Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
  14. van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
  15. Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
  16. Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
  17. Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
  18. Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
  19. Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
  20. Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
  21. Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van myofibrillenanalyse van de contractiele functienano Newton krachttransducerskeletspierbiopsiesarcomeer mechanicakrachtmetingmyofibrilperfusiecalciumactivatiePiezo lengtemotorFabry Perot interferometer

Gerelateerde artikelen