Hier gepresenteerd is een protocol om de contractiele eigenschappen van gestreepte spier myofibrils met nano-Newton resolutie te beoordelen. Het protocol maakt gebruik van een setup met een interferometrie-gebaseerde, optische kracht sonde. Deze opstelling genereert gegevens met een hoge signaal-ruisverhouding en maakt de beoordeling van de contractiele kinetiek van myofibrils mogelijk.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Myofibrils isoleren van skeletspierbiopten en het bepalen van contractielfunctie met een Nano-Newton Resolution Force Transducer
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gestreepte spiercellen zijn onmisbaar voor de activiteit van mens en dier. Enkele spiervezels bestaan uit myofibrils, die bestaan uit serieel verbonden sarcomeres, de kleinste contractiele eenheden in de spier. Sarcomerische disfunctie draagt bij aan spierzwakte bij patiënten met mutaties in genen die coderen voor sarcomerische eiwitten. De studie van myofibril mechanica maakt het mogelijk voor de beoordeling van actin-myosine interacties zonder mogelijke verstorende effecten van beschadigde, aangrenzende myofibrils bij het meten van de contractiliteit van enkele spiervezels. Ultrastructurele schade en verkeerde uitlijning van myofibrils kunnen bijdragen tot verminderde contractiliteit. Als er structurele schade aanwezig is in de myofibrils, breken ze waarschijnlijk tijdens de isolatieprocedure of tijdens het experiment. Bovendien geven studies in myofibrils de beoordeling van actin-myosine interacties in aanwezigheid van de geometrische beperkingen van de sarcomeres. Metingen in myofibrils kunnen bijvoorbeeld duidelijk maken of myofibrillar disfunctie het primaire effect is van een mutatie in een sarcomerisch eiwit. Bovendien is perfusie met calciumoplossingen of verbindingen bijna direct te wijten aan de kleine diameter van de myofibril. Dit maakt myofibrils bij uitstek geschikt om de snelheid van activering en ontspanning tijdens de krachtproductie te meten. Het protocol beschreven in dit document maakt gebruik van een optische kracht sonde gebaseerd op het principe van een Fabry-Pérot interferometer in staat om krachten te meten in de nano-Newton bereik, gekoppeld aan een piëzo lengte motor en een snelle perfusie systeem. Deze setup maakt het mogelijk om myofibril mechanica met hoge resolutie krachtmetingen te bestuderen.
Inleiding
Gestreepte spiercellen zijn onmisbaar voor dagelijkse activiteiten. Limb beweging, ademhalingsfunctie, en de pompende beweging van het hart vertrouwen op de kracht gegenereerd door spiercellen. Skeletspier bestaat uit spiersfalo's met bundels van enkele spiervezels(figuur 1A). Deze spiervezels bestaan uit myofibrils, die worden gevormd door serieel verbonden sarcomeres (figuur 1B,D). De sarcomeres bevatten dunne en dikke filamenten. Deze bestaan voornamelijk uit ketens van actine- en myosinemoleculen (figuur 1B). Actin-myosine interacties zijn verantwoordelijk vo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het protocol voor het verkrijgen van menselijke biopten werd goedgekeurd door de instellingscommissie van het VU Medisch Centrum (#2014/396) en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van de proefpersonen. Het protocol voor het verkrijgen van dierlijke spierbiopten werd goedgekeurd door de lokale comité voor dierethiek van de Vrije Universiteit (AVD114002016501)
1. Voorbereiding en myofibril-isolatie
OPMERKING: Gebruik eerder beschreven methoden om biopten te glycereren, bereid de verschillende calciumconcentratie (pCa) oplossingenvoor 7,16
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Gegevenssporen werden geregistreerd en geopend met de systeemcontrollersoftware (zie Tabel van Materialen). Volledige sporen of geselecteerde segmenten werden geëxporteerd naar het klembord of tekstbestand voor verdere analyse met een gewenste software. Kleppen om de stroom van de verschillende oplossingen te regelen werden geschakeld met aangepaste software of handmatig. Een aangepaste MATLAB script werd gebruikt om de tarieven van activering, spanning herontwikkeling, en ontspanning te analyseren. De m.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Beschreven is een protocol om de contractiele functie van myofibrils geïsoleerd van menselijke of dierlijke skeletspierweefsels te beoordelen. De krachtresolutie van deze opstelling is al eerder beschreven door Chavan et al.12. Kortom, het wordt bepaald door de willekeurige schommelingen van de lengte van de Fabry-Pérot holte gevormd tussen de detectievezel en de cantilever, die het dominante deel van het geluid produceren bij de uitgang van de uitlezing (uitgedrukt in V) die, vermenigvuldigd met .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Michiel Helmes is aandeelhouder en mede-eigenaar van IONOptix Inc.
Dankbetuigingen
Dit project werd gefinancierd door AFM-Telethon en A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies. De auteurs willen de maker van de producten die in dit artikel, IONOptix Inc.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | Om myofibrillen te isoleren | |
| Op maat gecodeerd | Matlab | ||
| Op maat vervaardigd | Inclusief Labview-programma voor besturing via seriële verbinding; Voor het bedienen van kleppen | ||
| Op maat vervaardigd | Om de Peltier-module te koelen | ||
| Op maat vervaardigd | |||
| Op maat vervaardigd | Aluminium weefselkamer | ||
| Op maat vervaardigd | Voor het bedienen van de kleppen; Inclusief pc-software voor besturing via USB | ||
| IonOptix | Systeemcontrollersoftware: data-opnamesoftware met geavanceerde signaalgenerator voor piezo en fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | Om sarcomeerlengte op te nemen | |
| IonOptix | Inclusief: Optiforce (interferometer), micromanipulators, signaalinterface, piezomotor en controller. Gebaseerd op de MyoStretcher | ||
| IonOptix | Krachtsonde | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | Om de Peltier-module te koelen | |
| Microsoft | Gegevensregistratie | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylaat); Coating voor microscoopglazen om aanhechten van weefsel te voorkomen | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Kristallen om op te lossen in ethanol resulterend in lijm | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | Om de weefselstroomkamer te koelen | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Inclusief pc-software voor besturing via USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Spuitpomp om achtergrondstroom samen met fast-step perfusiesysteem te induceren; Uitstroming uit weefselstroomkamer | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Niet langer verkrijgbaar | Alternatief: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | Om het weefsel te perfunderen | |
| 1 pc voor IonWizard en 1 pc voor andere software |
Referenties
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and f....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
