Method Article

Karakterisering van Amyloïde Structuren in Aging C. Elegans met behulp van Fluorescentie Lifetime Imaging

DOI:

10.3791/61004

⸱

March 27th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund Berlin, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Molecular Neuroscience Group, Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 4Cell Biology, University of Bremen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescentie levenslange beeldvorming monitoren, kwantificeert en onderscheidt de aggregatie tendensen van eiwitten in het leven, veroudering, en benadrukt C. elegans ziekte modellen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amyloïde fibrils worden geassocieerd met een aantal neurodegeneratieve ziekten zoals de ZvH, Parkinson of de ziekte van Alzheimer. Deze amyloïde fibrils kunnen endogene metastabiele eiwitten en componenten van het proteostasenetwerk (PN) afzonderen en daardoor eiwitmisvouwen in de cel verergeren. Er zijn een beperkt aantal instrumenten beschikbaar om het aggregatieproces van amyloïde eiwitten binnen een dier te beoordelen. We presenteren een protocol voor fluorescentie levensduur microscopie (FLIM) dat monitoring en kwantificering van de amyloïde fibrilisatie in specifieke cellen, zoals neuronen, op een niet-invasieve manier en met de progressie van veroudering en bij verstoring van de PN. FLIM is onafhankelijk van de expressieniveaus van de fluoropforen en maakt een analyse van het aggregatieproces mogelijk zonder verdere vlekken of bleken. Fluorophoren worden gedoofd wanneer ze zich in de nabijheid van amyloïde structuren bevinden, wat resulteert in een afname van de fluorescentielevensduur. Het blussen correleert direct met de aggregatie van het amyloïde eiwit. FLIM is een veelzijdige techniek die kan worden toegepast om het fibrilisatieproces van verschillende amyloïde eiwitten, omgevingsstimuli of genetische achtergronden in vivo op een niet-invasieve manier te vergelijken.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwitaggregatie komt zowel bij veroudering als bij ziekte voor. De paden die leiden tot de vorming en afzetting van grote amyloïden of amorfe insluitsels zijn moeilijk te volgen en hun kinetiek zijn eveneens uitdagend om te ontrafelen. Eiwitten kunnen verkeerd worden gevouwen als gevolg van intrinsieke mutaties binnen hun coderingssequenties, zoals in het geval van genetische ziekten. Eiwitten ook verkeerd vouwen omdat de proteostase netwerk (PN) dat houdt ze oplosbaar en goed gevouwen is aangetast, zoals gebeurt tijdens het ouder worden. De PN omvat moleculaire chaperonne en afbraakmachines en is verantwoordelijk voor de biogenese, vouwen, handel en afbraak van eiwit....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synchronisatie van C. elegans

  1. Synchroniseer C. elegans via alkalische hypochlorietoplossingsbehandeling of via eenvoudige eieren die 4 uur bij 20 °C8 leggen.
  2. Groeien en onderhouden van aaltjes op nematoden groeimedium (NGM) platen die zijn ingezaaid met OP50 E. coli volgens standaardprocedures9. Verouder de nematoden tot de gewenste ontwikkelingsfase of dag.
    OPMERKING: In dit protocol worden jongvolwassenen afgebeeld op dag 4 en worden oude aaltjes afgebeeld op dag 8 van het leven.

2. RNAi-gemedieerde knockdown van chaperonnemachines via....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol laat zien hoe nauwkeurig de vorming van geaggregeerde soorten in levende C. eleganste controleren , zowel tijdens de natuurlijke veroudering en wanneer onderworpen aan stress. We selecteerden vier verschillende stammen van transgene aaltjes die polyglutamine-eiwitten uitdrukken van 40Q, 44Q of 85Q herhalingen. Deze eiwitten worden gesynthetiseerd in verschillende weefsels en werden gesmolten tot verschillende fluorophoren. De C. elegans stammen ofwel uitgedr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een op microscopie gebaseerde techniek om geaggregeerde soorten in het C. elegans-modelsysteem te identificeren. FLIM kan de aanwezigheid van zowel geaggregeerde als oplosbare soorten die tot fluorophore zijn gefuseerd nauwkeurig karakteriseren door meting van hun fluorescentielevensduurverval. Wanneer een fusie-eiwit begint te aggregeren zal de geregistreerde gemiddelde levensduur verschuiven van een hogere naar een lagere waarde16. De neiging .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De spier-Q40-mRFP stam die door de CGC, die wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Het neuronale Q40-GVB was een soort geschenk van het Morimoto Lab. Wij erkennen de DFG (KI-1988/5-1 aan JK, NeuroCure PhD fellowship door de NeuroCure Cluster of Excellence aan MLP), EMBO (Korte termijn fellowship to MLP) en het Bedrijf van Biologen (reissubsidies aan CG en MLP) voor financiering. We erkennen ook de Advanced Light Microscopy imaging faciliteit in het Max Delbrück Centre for Molecular Medicine, Berlijn, voor het verstrekken van de setup om de YFP constructies beeld.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agar-Agar Kobe ICarl Roth GmbH + Co. KG5210.2NGM component
Ahringer Library hsp-1 siRNASource BioScience UK LimitedF26D10.3
AmpicillinCarl Roth GmbH + Co. KGK029.3Antibiotic
B&H DCS-120 SPC-150Becker & Hickl GmbHFLIM Aquisition software
B&H SPC830-SPC ImageBecker & Hickl GmbHFLIM Aquisition software
BD Bacto PeptoneBD-Bionsciences211677NGM component
C. elegans iQ44-YFPCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OG412
C. elegans iQ85-YFPKind gift from Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFPKind gift from Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFPKind gift from Morimoto Lab
Deckgläser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2Cover slips
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)Carl Roth GmbH + Co. KG2316.4
Leica M165 FCLeica Camera AGMounting Stereomicroscope
Leica TCS SP5Leica Camera AGConfocal Microscope
Levamisole HydrochlorideAppliChem GmbHA4341Anesthetic
OP50 Escherichia coliCAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)OP50
PicoQuant PicoHarp300PicoQuant GmbHFLIM Aquisition software
Sodium AzideCarl Roth GmbH + Co. KGK305.1Anesthetic
Sodium ChlorideCarl Roth GmbH + Co. KG3957.2NGM component
Standard-ObjektträgerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1Glass slides
Universal AgaroseBio & Sell GmbHBS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1Carl Zeiss AGConfocal Microscope
Zeiss LSM510-Meta NLOCarl Zeiss AGConfocal Microscope

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  2. Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Bio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Lifetime ImagingAmyloid FibrilizationC Elegans ModelProtein Aggregation AnalysisNoninvasive MonitoringFLIM AcquisitionLifetime MeasurementPhoton DetectionAgarose Pad PreparationNeurodegenerative Disease Study

Related Articles