Methodenartikel

Translaminair autonoom systeemmodel voor de modulatie van intraoculaire en intracraniale druk in posterieure donorsegmenten van menselijke donoren

DOI:

10.3791/61006

⸱

24 april 2020

 ,  ,  , 
1North Texas Eye Research Institute, Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center, 2Mechanical Engineer Consultant, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven en detailleren het gebruik van het translaminaire autonome systeem. Dit systeem maakt gebruik van het menselijke posterieure segment om onafhankelijk de druk in het segment (intraoculair) en rond de oogzenuw (intracranieel) te reguleren om een translaminaire drukgradiënt te genereren die kenmerken van glaucomateuze optische neuropathie nabootst.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is een huidige onvervulde behoefte aan een nieuw preklinisch menselijk model dat zich ex vivo op ziekte-etiologie kan richten met behulp van intracraniale druk (ICP) en intraoculaire druk (IOP) die verschillende pathogene paradigma's met betrekking tot de pathogenese van glaucoom kan identificeren. Ex vivo humane anterieure segment perfusie orgaankweekmodellen zijn eerder met succes gebruikt en toegepast als effectieve technologieën voor de ontdekking van glaucoompathogenese en het testen van therapeutica. Preklinische screening van geneesmiddelen en onderzoek uitgevoerd op ex vivo menselijke orgaansystemen kunnen beter vertaalbaar zijn naar klinisch onderzoek. Dit artikel beschrijft in detail de generatie en werking van een nieuw ex vivo menselijk translaminair drukmodel genaamd het translaminaire autonome systeem (TAS). Het TAS-model kan ICP en IOP onafhankelijk reguleren met behulp van menselijke donorposterieure segmenten. Het model maakt het mogelijk om pathogenese op een preklinische manier te bestuderen. Het kan het gebruik van levende dieren in oogheelkundig onderzoek verminderen. In tegenstelling tot in vitro experimentele modellen kunnen de weefselstructuur, complexiteit en integriteit van de oogzenuwkop (ONH) ook binnen het ex vivo TAS-model worden gehandhaafd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wereldwijde schattingen in recente enquêtes suggereren dat 285 miljoen mensen met een visuele beperking leven, waaronder 39 miljoen blind1. In 2010 documenteerde de Wereldgezondheidsorganisatie dat drie van de negen genoemde belangrijkste oorzaken van blindheid voorkomen in het achterste segment van het oog1. Oogziekten in het achterste segment omvatten het netvlies, vaatvlies en oogzenuw2. Het netvlies en de oogzenuw zijn uitbreidingen van het centrale zenuwstelsel (CZS) van de hersenen. De retinale ganglioncel (RGC) axonen zijn kwetsbaar voor schade omdat ze het oog verlaten via de oogzenuwkop (ONH) om de oogzenuw te vormen3. De ONH blijft het meest kwetsbare punt voor de RGC-axonen vanwege het 3D-netwerk van bindweefselbundels die de lamina cribrosa (LC) worden genoemd4. De ONH is de eerste plaats van belediging van RGC-axonen bij glaucoom5,6,7, en genexpressieveranderingen binnen de ONH zijn bestudeerd in oculaire hypertensie- en glaucoommodellen8,9,10. De RGC-axonen zijn gevoelig bij de ONH als gevolg van drukverschillen tussen het intraoculaire compartiment, de intraoculaire druk (IOP) genoemd, en binnen de externe perioptische subarachnoïdale ruimte, de intracraniale druk (ICP) genoemd11. Het LC-gebied scheidt beide gebieden, met behoud van normale drukverschillen, met IOP variërend van 10-21 mmHg en ICP van 5-15 mmHg12. Het drukverschil door de lamina tussen de twee kamers wordt de translaminaire drukgradiënt (TLPG)13 genoemd. Een belangrijke risicofactor voor glaucoom is verhoogde IOP14.

Verhoogde IOP verhoogt de spanning binnen en over het laminaire gebied6,15,16. Experimentele waarnemingen in mens- en diermodellen presenteren de ONH als de eerste plaats van axonale schade17,18. Het biomechanische paradigma van IOP-gerelateerde stress en spanning die glaucomateuze schade veroorzaken bij de ONH beïnvloedt ook de pathofysiologie van glaucoom19,20,21. Hoewel bij mensen drukgeïnduceerde veranderingen RGC-axonen mechanisch beschadigen22, kunnen knaagdieren zonder collageenachtige platen in de lamina ook glaucoom ontwikkelen7,23. Bovendien blijft verhoogde IOP de meest prominente risicofactor bij patiënten met primair open hoekglaucoom, terwijl patiënten met een normale spanning glaucoom glaucomateuze optische neuropathie ontwikkelen, zelfs zonder verhoogde IOP. Bovendien zijn er ook een subgroep van oculaire hypertensieve patiënten die geen schade aan de oogzenuw vertonen. Er is ook gesuggereerd dat cerebrospinale vloeistofdruk (CSFp) een rol kan spelen bij de pathogenese van glaucoom. Er zijn aanwijzingen dat de ICP is verlaagd tot ~5 mmHg bij glaucoompatiënten in vergelijking met normale personen, waardoor een verhoogde translaminaire druk wordt veroorzaakt en een cruciale rol wordt gespeeld bij ziekte24,25. Eerder werd in een hondenmodel aangetoond dat door het regelen van IOP- en CSFp-veranderingen, er grote verplaatsingen van de optische schijf26 kunnen zijn. Het verhogen van CSFp in varkensogen heeft ook een verhoogde hoofdbelasting aangetoond in het LC-gebied en retrolaminair neuraal weefsel. Verhoogde druk op de RGC's en het LC-gebied draagt bij aan axonale transportblokkade en verlies van RGC's27. Progressieve degeneratie van RGC's is in verband gebracht met verlies van trofische ondersteuning28,29, stimulatie van ontstekingsprocessen/immuunregulatie30,31 en apoptotische effectoren29,32,33,34,35. Bovendien veroorzaakt axonaal letsel (figuur 3) schadelijke effecten op de RGC's, waardoor regeneratief falen wordt veroorzaakt36,37,38,39. Hoewel de effecten van IOP goed zijn bestudeerd, is er minimaal onderzoek gedaan naar abnormale translaminaire drukveranderingen. De meeste behandelingen voor glaucoom richten zich op het stabiliseren van IOP. Hoewel verlaging van de IOP de progressie van de ziekte vertraagt, keert het gezichtsveldverlies niet om en voorkomt het volledig verlies van RGC's. Inzicht in drukgerelateerde neurodegeneratieve veranderingen in glaucoom zal cruciaal zijn om RGC-dood te voorkomen.

Het huidige bewijs geeft aan dat translaminaire drukmodulaties als gevolg van verschillende mechanische, biologische of fysiologische veranderingen bij patiënten die lijden aan traumatische of neurodegeneratieve visuele beperkingen aanzienlijk verlies van het gezichtsvermogen kunnen veroorzaken. Momenteel bestaat er geen echt preklinisch menselijk posterieur segmentmodel dat de studie van glaucomateuze biomechanische schade binnen de ex vivo menselijke ONH mogelijk maakt. Observatie en behandeling van het achterste segment van het oog is een enorme uitdaging in de oogheelkunde27. Er zijn fysieke en biologische barrières om het achterste oog te richten, waaronder hoge eliminatiesnelheden, bloed-retinale barrière en potentiële immunologische reacties40. De meeste werkzaamheids- en veiligheidstests voor nieuwe geneesmiddeldoelen worden uitgevoerd met behulp van in vitro cellulaire en in vivo diermodellen41. Oculaire anatomie is complex en in vitro studies bootsen niet nauwkeurig de anatomische en fysiologische barrières na die worden gepresenteerd door weefselmodelsystemen. Hoewel diermodellen een noodzaak zijn voor farmacokinetische studies, kan de oculaire fysiologie van het menselijk achterste oog variëren tussen verschillende diersoorten, waaronder cellulaire anatomie van het netvlies, vasculatuur en ONH41,42.

Het gebruik van levende dieren vereist intensieve en gedetailleerde ethische voorschriften, een hoge financiële inzet en effectieve reproduceerbaarheid43. Onlangs zijn er meerdere andere richtlijnen gevolgd voor het ethisch gebruik van dieren in experimenteel onderzoek44,45,46. Een alternatief voor dierproeven is het gebruik van ex vivo human eye-modellen om de pathogenese van ziekten te onderzoeken en mogelijke analyse van geneesmiddelen voor het beschermen van ONH-schade. Menselijk postmortaal weefsel is een waardevolle hulpbron voor het bestuderen van menselijke ziekteparadigma's, vooral in het geval van menselijke neurodegeneratieve ziekten, omdat identificatie van potentiële geneesmiddelen die in diermodellen zijn ontwikkeld, de noodzaak vereist om naar mensen te vertalen47. Het ex vivo menselijke donorweefsel is uitgebreid gebruikt voor de studie van menselijke aandoeningen47,48,49, en menselijke anterieure segment perfusie orgaankweeksystemen hebben eerder een uniek ex vivo model geleverd om de pathofysiologie van verhoogde IOP50,51,52 te bestuderen.

Om translaminaire druk gerelateerd aan IOP en ICP in menselijke ogen te bestuderen, hebben we met succes een tweekamer translaminair autonoom systeem (TAS) ontworpen en ontwikkeld dat IOP en ICP onafhankelijk kan reguleren met behulp van posterieure segmenten van menselijke donorogen. Het is het eerste ex vivo menselijke model dat translaminaire druk bestudeert en de biomechanische effecten van TLPG op de ONH benut.

Dit ex vivo menselijke TAS-model kan worden gebruikt om cellulaire en functionele modificaties te ontdekken en te classificeren die optreden als gevolg van chronische verhoging van IOP of ICP. In dit rapport beschrijven we het stapsgewijze protocol voor het ontleden, instellen en bewaken van het TAS-model voor menselijke posterieure segmenten. Het protocol zal andere onderzoekers in staat stellen om dit nieuwe ex vivo onder druk staande menselijke posterieure segmentmodel effectief te reproduceren om de pathogenese van biomechanische ziekten te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogen werden verkregen volgens de bepalingen van de Verklaring van Helsinki voor onderzoek met menselijk weefsel.

OPMERKING: Ogen van gerenommeerde oogbanken (bijv. Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) werden binnen 6-12 uur na overlijden geoogst en donorserum werd getest op hepatitis B, hepatitis C en humaan immunodeficiëntievirus 1 en 2. Nadat ze waren ontvangen, werden de ogen binnen 24 uur ontleed en in het TAS-model geplaatst. Exclusiecriteria omvatten elke oculaire pathologie. Ogen werden niet uitgesloten op basis van leeftijd, ras of geslacht. Om de levensvatbaarheid van het netvlies bij ontvangst te garanderen, werden retinale explantaten geoogst van de weefseldonoren en gedurende 7 en 14 dagen gekweekt (aanvullende figuur 1). Deze netvliezen werden ook gedissocieerd en groeiden gezonde RGC's in cultuur gedurende 7 dagen met positieve kleuring voor RGC-marker, RNA-bindend eiwit met multiple splicing (RBPMS), evenals positieve neurofilament light chain (NEFL) kleuring in hun neurofilamenten (aanvullende figuur 2). .

1. Voorbereiding en sterilisatie van apparatuur en benodigdheden

  1. Raadpleeg de tabel met materialen voor een volledige lijst van benodigde benodigdheden en leveranciers- en catalogusnummers.
  2. Steriliseer voor gebruik alle apparatuur en instrumenten door ethyleenoxideampullen te autoclaveren of te gebruiken.

2. Bereiding van het perfusiemedium

  1. Voeg 1% penicilline streptomycine (10.000 E / ml penicilline, 10.000 μg / ml streptomycine in 0,85% NaCl) en 1% L-glutamine (200 mM) toe aan 1.000 ml hoge glucose Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM).
  2. Steriliseer het perfusiemedium door een filter van 0,22 μm te laten gaan.

3. Translaminair autonoom systeem (TAS) setup

  1. Stel instroomspuiten in (IOP- en ICP-reservoirs).
    1. Voeg 30 ml van het perfusiemedium (sectie 2) toe aan een spuit van 30 ml. Bevestig een 3-weg stopkraan aan de spuit van 30 ml. Bevestig een hydrofiel filter van 0,22 μm aan de 3-weg stopkraan. Bevestig een 15 G Luer stub adapter aan het 0,22 μm hydrofiele filter.
    2. Verwijder luchtbellen uit de opstelling van de spuit. Bevestig de slang aan de 15 G Luer stub adapter. Sluit de zijpoort van de stopkraan met een ongeventileerde universele slotdop. Herhaal dit voor in totaal twee opstellingen.
    3. Label de ene spuit als kanaal 1 intracraniale druk (CH1 ICP) en de andere spuit als kanaal 2 intraoculaire druk (CH2 IOP).
  2. Stel uitstroomspuiten (IOP- en ICP-reservoirs) in.
    1. Bevestig een 3-weg stopkraan aan een spuit van 30 ml. Bevestig een 15 G Luer stub adapter aan de 3-weg stopkraan. Bevestig de slang aan de 15 G Luer stub adapter.
    2. Sluit de zijpoort van de stopkraan met een ongeventileerde universele slotdop. Herhaal dit voor in totaal twee opstellingen. Label de ene spuit als CH1 ICP en de andere spuit als CH2 IOP.

4. Voorbereiding van de hele menselijke oogbol

OPMERKING: Als hele ogen worden ontvangen, volgt u de onderstaande procedure om het voorste segment te scheiden van het achterste segment van het oog. Als de ogen doorsneden zijn, begin dan bij stap 4.4.

  1. Plaats een heel oog in povidon-jodiumoplossing gedurende 2 minuten.
  2. Spoel het oog in steriele fosfaat gebufferde oplossing (PBS) om het povidon-jodium af te spoelen. Herhaal dit 2 keer.
  3. Verwijder de adnexa van de hele oogbol met een tang en schaar. Bisect het oog op de evenaar om de voorste en achterste segmenten van het oog te scheiden.
  4. Verwijder de oogzenuwschede. Verwijder de glasvochthumor uit het achterste segment.
  5. Trim indien nodig extra sclera uit het achterste segment om een goede pasvorm op de ronde koepel van de IOP (onderste) kamer te garanderen. Zorg er met een tang voor dat het netvlies gelijkmatig over de achterkant van het segment wordt verdeeld.
  6. IOP (onderste) kameropstelling
    1. Plaats het menselijke achterste segment in de IOP (onderste) kamer van de TAS over de ronde koepel met de oogzenuw naar boven gericht.
    2. Sluit het achterste segment af met de epoxyhars O-ring met vier schroeven, wat zorgt voor een strakke afdichting.
    3. Steek de slang in de IN- en UIT-poorten van de IOP(onderste) kamer. De IOP-instroomspuit met slanghoudend medium wordt in de IN-poort gestoken en de lege IOP-uitstroomspuit met slang wordt in de OUT-poort geplaatst.
    4. Gebruik de push/pull-methode om het perfusiemedium langzaam in de instroompoort te injecteren om de achterste oogschelp te vullen en tegelijkertijd het perfusiemedium langzaam door de uitstroomspuit naar buiten te trekken om eventuele luchtbellen uit de leidingen te verwijderen. Stop met het infunderen van medium zodra zowel de IN- als de OUT-buizen geen luchtbellen hebben.
    5. Vergrendel de stopkranen in de uit-stand. Verwijder de spuit van 30 ml uit de IOP IN-poortfilterassemblage en vul deze bij met in totaal 30 ml medium. Plaats de spuit van 30 ml terug op de filterassemblage.
  7. ICP (bovenste) kameropstelling
    1. Plaats de ICP (bovenste) kamer/deksel over de achterkant van het achterste segment. Zorg ervoor dat de oogzenuw zich in de bovenste kamer bevindt. Sluit de bovenste kamer af met vier schroeven.
    2. Steek de slang in de IN- en UIT-poorten van de ICP(bovenste) kamer. De ICP-instroomspuit met slanghoudend medium wordt in de IN-poort ingebracht en de lege ICP-uitstroomspuit met slang wordt in de OUT-poort geplaatst.
    3. Breng het medium voorzichtig en langzaam in de IN-poort om de ICP-kamer te vullen en luchtbellen van de lijnen te verwijderen met behulp van de push/pull-methode. Stop met het infunderen van medium zodra de ICP-kamer en zowel de IN- als de OUT-slang geen luchtbellen hebben.
    4. Vergrendel de stopkranen in de uit-stand. Verwijder de spuit van 30 ml uit de ICP in poortfilterassemblage en vul deze bij met in totaal 30 ml medium. Plaats de spuit van 30 ml terug op de filterassemblage.

5. Gegevensregistratiesysteem instellen

OPMERKING: Het gegevensregistratiesysteem bestaat uit een 8-kanaals stroombron, meerkanaals brugversterker, hydrostatische drukomvormers en een computer met software voor gegevensverzameling (zie Materiaaltabel). Hieronder wordt beschreven hoe u het systeem instelt en kalibreert.

  1. Sluit het netsnoer aan op de achterkant van de 8-kanaals voedingsbron en sluit het aan op een back-upapparaat voor de batterij.
  2. Sluit de USB-kabel van de 8-kanaals voedingsbron aan op de achterkant van de computer.
  3. Sluit de 8-kanaals voedingsbron aan op de meerkanaals brugversterker met behulp van het meegeleverde I2C-snoer.
  4. Sluit de Bayonet Neill-Concelman (BNC) kabels aan op de kanaalingangen voor de 8-kanaals stroombron en het uiteinde van de kabels op de overeenkomstige kanalen aan de achterkant van de meerkanaalsversterker.
  5. Sluit de transducerkabels aan op de voorkant van de meerkanaalsversterker.
  6. Installeer de software voor gegevensverzameling op de computer.
    1. Voer het installatieprogramma voor gegevensverzamelingssoftware uit vanaf de meegeleverde software-cd.
    2. Volg de instructies op het computerscherm.
    3. Wanneer de installatie is voltooid, selecteert u Voltooien.
  7. Schakel de 8-kanaals voedingsbron in.
  8. Schakel de computer in en start de software voor gegevensverzameling.
    1. Selecteer Bestand | Nieuw.
    2. Selecteer Setup | Kanaalinstellingen. Selecteer drie kanalen (linksonder in het scherm). Wijzig in de kolom Kanaaltitel de naam van de kanalen als volgt: CH1 ICP; CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
    3. Selecteer 2 mV voor het bereik op alle kanalen. Selecteer in de kolom Berekening de optie Geen berekening voor kanalen 1 en 2.
    4. Selecteer in de kolom Berekening de optie Rekenen voor kanaal 3. In het gedeelte Formule : Selecteer kanalen/CH2; Selecteer rekenkundige "-"; Selecteer kanalen/CH1. Selecteer in het gedeelte Uitvoer mmHg. Selecteer OK. Selecteer nogmaals OK .
  9. Stel de hydrostatische drukomvormers in en kalibreer ze.
    OPMERKING: Hydrostatische drukomvormers moeten voorafgaand aan experimenten worden gekalibreerd met behulp van de volgende methode.
    1. Sluit de hydrostatische drukomvormers aan op de transducerleidingen die aan de meerkanaals brugversterker zijn bevestigd.
    2. Bevestig een spuit gevuld met lucht van 30 ml aan de zijpoort van de CH1 (ICP) drukomvormer. Bevestig de bloeddrukmeter aan de onderkant van de CH1 (ICP) drukomvormer.
    3. Bekijk in de grafiek de pagina van de software voor gegevensverzameling, stel de bemonsteringssnelheid in door met de linkermuisknop op de pijl naast de bemonsteringstijd te klikken en 100 te selecteren. Klik vervolgens met de rechtermuisknop in het CH1 (ICP) gebied van de pagina.
    4. Selecteer Bridge Amp. Selecteer Netfilter. Selecteer Nul en wacht tot het systeem nul uitvalt, waarbij u ervoor zorgt dat u de drukomvormer niet verplaatst.
    5. Knijp in de witte lipjes van de drukomvormer en duw lucht door de transducer totdat 40 mmHg op de bloeddrukmeter is verkregen. Laat de witte lipjes los en verwijder de spuit en bloeddrukmeter.
    6. Selecteer op de pagina Eenhedenconversie het teken 'min (-)'. Markeer het hoogste plateau om 40 mmHg aan te geven. Klik op de pijl voor punt 1 en voer 40 in.
    7. Markeer het laagste plateau om 0 mmHg aan te geven. Klik op de pijl voor punt 2 en voer 0 in. Selecteer mmHg voor de units. Selecteer OK.
    8. Selecteer OK (Bridge Amp-pagina). Herhaal stap 9.1-9.7 voor CH2 (IOP) met 100 mmHg voor het hoogste plateau en 0 voor het laagste plateau.
  10. Sluit de TAS/posterieure segmenteenheid aan op het data-acquisitiesysteem.
    1. Plaats de TAS/posterieure segmenteenheid in een incubator (37 °C, 5% CO2). Bevestig de ICP-slang van de OUT-poort aan de CH1 (ICP) drukomvormer.
    2. Bevestig de IOP-buis van de OUT-poort aan de CH2 (IOP) drukomvormer.
    3. Bevestig de spuitopstellingen (ICP en IOP) met medium van de IN-poorten aan de ringstandaard.
    4. Selecteer op de pagina Grafiekweergave de optie Bemonstering starten. Stel de bemonsteringssnelheid in door met de linkermuisknop op de pijl naast de bemonsteringstijd te klikken en selecteer Langzaam en 1 min.
    5. Stel de spuiten op de ringstand omhoog of omlaag om de ICP- en IOP-drukken te regelen volgens de protocolvereisten.
    6. Voer systemische aanvulling van het medium in het systeem uit om de 48-72 uur via de duw- en trekmethode.

6. Ophalen en analyseren van gegevens

  1. Open het gegevensbestand in de software voor gegevensverzameling.
  2. Klik in het gedeelte Data Pad op het pictogram Meerdere toevoegen aan Data Pad . Er verschijnt een nieuw venster.
    1. Selecteer in het gedeelte Zoeken met de optie Tijd in het vervolgkeuzemenu.
    2. Selecteer in het gedeelte Selecteren 1 uur per 1 uur in de vervolgkeuzemenu's.
    3. Selecteer in het gedeelte Doorstap de optie Heel bestand en klik vervolgens op Toevoegen.
  3. Klik in het gedeelte Data Pad op het pictogram Data Pad View . Markeer alle gegevens en kopieer/plak in een spreadsheet.
  4. Bereken de gemiddelde en standaarddeviaties voor IOP, ICP en TLPG voor elke 24 uur. Verzamel de gegevens met de draaitabeloptie in een spreadsheetprogramma en grafiek.

7. Immunohistochemie en hematoxyline- en eosinekleuring van achterste segmenten

  1. Verwijder de achterste oogsegmenten volgens verschillende tijdspunten uit het TAS-model en fixeer in formaline voordat u paraffineert.
  2. Snijd de ogen om sagittale weefselvlakken te produceren.
  3. Deparaffiniseer de paraffine-ingebedde segmenten met een 100% xyleen, 95% ethanol, 50% ethanol oplossing.
  4. Was de glaasjes met PBS gedurende 10 minuten en blokkeer met een blokkeerbuffer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  5. Labelsecties met primaire antilichamen: anti-collageen IV (extracellulaire matrix (ECM) marker, NB120-6586, 1:100) en anti-laminine (ECM marker, NB300-144, 1:100, anti-RBPMS (RGC marker), GTX118619, 1:50).
  6. Detecteer de primaire antilichamen met behulp van Alexa Fluor secundaire antilichamen (Alexa Fluor 488 geiten anti-konijn, A11008, 1:500).
  7. Counterstain de celkernen met behulp van DAPI anti-fade oplossing.
  8. Leg beelden vast van de gekleurde secties en fasebeelden met 4x en 10x objectieve lenzen met behulp van een fluorescentiemicroscoop (zie Materialentabel).
  9. Voor de hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring verwerkt u de secties in een geautomatiseerd kleuringssysteem (zie Tabel met materialen) voor deparaffinisatie met behulp van een 100%, xyleen 95% ethanol, 50% ethanoloplossing en kleuring met H&E.
  10. Leg foto's vast met de 4x en 10x objectieflenzen met behulp van een microscoop met een heldere veldlichtbron.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ontwerp en creatie van het translaminaire autonome systeem
Translaminair drukverschil is een potentieel sleutelmechanisme in de pathogenese van verschillende ziekten, waaronder glaucoom. Toepassingen voor het beschreven model omvatten, maar zijn niet beperkt tot, de studie van glaucoom (verhoogde IOP, misschien verminderde ICP), traumatisch hersenletsel (verhoogde ICP) en langdurige blootstelling aan microzwaartekracht-geassocieerde visuele beperking (verhoogde ICP, verhoogde IOP). Om moleculaire path...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke postmortale weefsels zijn een bijzonder waardevolle bron voor het bestuderen van menselijke neurodegeneratieve ziekten, omdat identificatie van potentiële geneesmiddelen die in diermodellen zijn ontwikkeld, vertaalbaar moet zijn naar mensen47. De effecten van menselijke IOP-verhoging zijn goed ingeburgerd, maar er is minimaal onderzoek gedaan naar abnormale ONH translaminaire drukveranderingen. Hoewel er meerdere diermodellen en eindige modellering van menselijke ONH bestaan, is er geen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs van het manuscript hebben geen potentiële belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiering voor dit project was via discretionaire fondsen van Dr. Colleen M. McDowell. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een onbeperkte subsidie van Research to Prevent Blindness, Inc. aan het UW Madison Department of Ophthalmology and Visual Sciences. Wij danken Drs. Abbot F. Clark en Weiming Mao voor hun technische hulp bij het perfusie orgaankweekmodel. We bedanken het Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, FL) voor het leveren van de menselijke donorogen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick,
755 Durometer 50 Pack		AmazonB07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100)AmazonB000FMYRHK
30 mL Syringes without NeedleVitality Medical302832
3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented CapQOSINA2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriverBrikksen Stainless Steel FastnersPPMSSSCH4C.5 
ANPROLENE 16 LARGE AMPULEFisher ScientificNC9085343 
BetadinePurduePUR1815001EACH 
Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishesSigma-AldrichCLS430167-100EA 
Corning L-glutamine SolutionFisher ScientificMT25005CI
Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CSMed Plus Medical SupplyCOV-3033-CS
Dressing Forceps Delicate Curved (serrated)KatenaK5-4010
Dumont #5 - Fine ForcepsF.S.T.11254-20
Eye Scissors Standard CurvedKatenaK4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri DishesCapitol Scientific351058
Fisherbrand 4 oz. Specimen ContainersFisher Scientific16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization PouchesFisher Scientific01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization PouchesFisher Scientific01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization PouchesFisher Scientific01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles MediumFisher ScientificSH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X SolutionFisher ScientificSV30010
Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and ClearQosina28217
Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rateAD instrumentsDPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/BoxJenson GlobalJG15-0.5HPX 15
Keyence B2?X710 microscopeKeyenceB2-X710
LabChart 8AD instrumentsLabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainerLeicaST5020
Non-Vented Universal Luer Lock Cap, WhiteQOSINA65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228)AD instrumentsFE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOFFisher ScientificNC1675398
Phosphate Buffered Solution (PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508)AD instrumentsPL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPIThermoFisherP36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT MaleMcMAster-Carr7880T113
Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 PipeMcMAster-Carr51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft.Fisher Scientific14-171-268
Superblock T20Fisher ScientificPI37536
Surgical Scissors - Sharp-BluntF.S.T.14001-14
Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth CurvedKatenaK5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS)University of North Texas Health Science CenterN/A
USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N
(NBR, Nitrile, Buna)		Marco Rubber & PlasticsB1000-030

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
  3. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
  4. Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
  5. Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
  6. Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
  7. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  8. Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
  9. Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
  10. Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094(2013).
  11. Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
  12. Berdahl, J. P., Allingham, R. R. Intracranial pressure and glaucoma. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (2), 106-111 (2010).
  13. Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
  14. Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
  15. Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
  16. Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
  17. Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
  18. Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
  19. Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
  20. Sigal, I. A., Ethier, C. R. Biomechanics of the optic nerve head. Experimental Eye Research. 88 (4), 799-807 (2009).
  21. Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
  22. Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
  23. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  24. Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
  25. Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
  26. Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
  27. Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
  28. Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
  29. Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
  30. Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
  31. Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
  32. Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
  33. Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
  34. Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
  35. Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
  36. Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
  37. Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
  38. Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
  39. Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
  40. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  41. Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
  42. Vézina, M. Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , Humana Press. 1-21 (2012).
  43. de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
  44. Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
  45. Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
  46. Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
  47. White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
  48. Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
  49. Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
  50. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  51. Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
  52. Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
  53. Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409(2009).
  54. Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
  55. Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
  56. Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
  57. Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
  58. Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
  59. Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
  60. Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Translamanar Autonomous SystemIntraocular Pressure RegulationIntracranial Pressure ControlHuman Posterior SegmentOptic Nerve HeadPressure Gradient ModelingEx Vivo Ocular ModelHydrostatic Pressure TransducersPerfusion Fluid SetupData Acquisition System

Gerelateerde artikelen