Terahertz Imaging and Characterization Protocol for Freshly Excised Breast Cancer Tumors

Samenvatting

Vers uitgesneden menselijke borstkankertumoren worden gekenmerkt door terahertzspectroscopie en beeldvorming volgens protocollen voor de behandeling van vers weefsel. Weefselpositionering wordt in aanmerking genomen om effectieve karakterisering mogelijk te maken en tegelijkertijd tijdig analyses te leveren voor toekomstige intraoperatieve toepassingen.

Samenvatting

Dit manuscript presenteert een protocol voor het behandelen, karakteriseren en beelden van vers uitgesneden menselijke borsttumoren met behulp van gepulseerde terahertz beeldvorming en spectroscopie technieken. Het protocol omvat terahertz transmissie modus bij normale incidentie en terahertz reflectie modus onder een schuine hoek van 30°. De verzamelde experimentele gegevens vertegenwoordigen tijddomeinpulsen van het elektrische veld. Het terahertz elektrische veldsignaal dat via een vast punt op het uitgesneden weefsel wordt overgebracht, wordt via een analytisch model verwerkt om de brekingsindex en absorptiecoëfficiënt van het weefsel te extraheren. Met behulp van een stepper motor scanner, de terahertz uitgezonden puls wordt weerspiegeld van elke pixel op de tumor die een vlakke afbeelding van verschillende weefselgebieden. De afbeelding kan worden gepresenteerd in tijd of frequentie domein. Bovendien worden de geëxtraheerde gegevens van de brekingsindex en absorptiecoëfficiënt bij elke pixel gebruikt om een tomografisch terahertzbeeld van de tumor te geven. Het protocol toont een duidelijke differentiatie tussen kanker en gezonde weefsels. Aan de andere kant, niet vasthouden aan het protocol kan resulteren in luidruchtige of onnauwkeurige beelden als gevolg van de aanwezigheid van luchtbellen en vloeistof blijft op het tumoroppervlak. Het protocol biedt een methode voor chirurgische marges beoordeling van borsttumoren.

Inleiding

Terahertz (THz) beeldvorming en spectroscopie is een snel groeiend gebied van onderzoek in het afgelopen decennium. De voortdurende ontwikkeling van efficiëntere en consistenteTHz-zenders in het bereik van 0,1-4 THz heeft ervoor gezorgd dat hun toepassingen aanzienlijk groeien¹. Een gebied waar THz heeft aangetoond belofte en aanzienlijke groei is de biomedische veld². THz-straling is aangetoond dat nonionizing en biologisch veilig op de vermogensniveaus die over het algemeen worden gebruikt om vaste weefsels te analyseren³. Als gevolg hiervan is THz imaging en spectroscopie gebruikt om verschillende weefselkenmerken te classificeren en te differentiëren, zoals watergehalte om brandschade en genezing aan te geven⁴, levercirrose⁵, en kanker in uitgesneden weefsels^6,7. Kankerbeoordeling omvat met name een breed scala aan potentiële klinische en chirurgische toepassingen, en is onderzocht op^{hersenkanker8,}lever⁹, eierstokken¹⁰, maag-darmkanaal¹¹en borst^{7,12,13,14,15,16,17,18,19}.

THz toepassingen voor borstkanker zijn voornamelijk gericht op het ondersteunen van borstsparenchirurgie, of lumpectomie, via margebeoordeling. Het doel van een lumpectomie is het verwijderen van de tumor en een kleine laag omringend gezond weefsel, in tegenstelling tot volledige borstamputatie, die de hele borst verwijdert. De chirurgische marge van het uitgesneden weefsel wordt vervolgens beoordeeld via pathologie zodra het monster is vastgesteld in formaline, verdeeld, ingebed in paraffine, en gemonteerd in 4 μm-5 μm plakjes op microscoopdia's. Dit proces kan tijdrovend zijn en vereist een secundaire chirurgische ingreep op een later tijdstip als een positieve marge wordt waargenomen²⁰. Huidige richtlijnen van de American Society of Radiation Oncology definiëren deze positieve marge als het hebben van kankercellen contact opnemen met het oppervlak-niveau marge inkt²¹. THz beeldvorming voor hoog-absorptie gehydrateerd weefsel is voornamelijk beperkt tot oppervlakte beeldvorming met een aantal verschillende penetratie op basis van weefsel type, dat is voldoende voor het voldoen aan de chirurgische behoeften van een snelle marge beoordeling. Een snelle analyse van de margevoorwaarden tijdens de chirurgische instelling zou de chirurgische kosten en het beoordelingsproces sterk verlagen. Tot op heden heeft THz bewezen effectief te zijn in het onderscheiden van kanker en gezond weefsel in formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) weefsels, maar aanvullend onderzoek is nodig om betrouwbare detectie van kanker in vers uitgesneden weefsels te bieden⁷.

Dit protocol beschrijft de stappen voor het uitvoeren van THz-beeldvorming en spectroscopie op vers uitgesneden menselijke weefselmonsters die zijn verkregen bij een biobank. THz-toepassingen gebouwd op vers uitgesneden menselijke borstkanker weefsels zijn zelden gebruikt in gepubliceerd onderzoek^7,18,22,23, vooral door onderzoeksgroepen niet geïntegreerd met een ziekenhuis. Het gebruik van vers uitgesneden weefsels is eveneens zeldzaam voor andere kankertoepassingen, met de meeste niet-borstkankervoorbeelden die voor darmkanker^24,25worden gemeld. Een van de redenen hiervoor is dat FFPE weefselblokken zijn veel gemakkelijker te bereiken en te hanteren dan vers uitgesneden weefsel, tenzij de THz-systeem wordt gebruikt voor de studie is onderdeel van de chirurgische workflow. Op dezelfde manier zijn de meeste commerciële laboratorium THz-systemen niet bereid om vers weefsel te verwerken, en degenen die dat wel doen, bevinden zich nog in de stadia van het gebruik van cellijngroei of zijn pas begonnen met het bekijken van uitgesneden weefsel van diermodellen. Om THz toe te passen op een intraoperatieve instelling moeten imaging- en karakteriseringsstappen vooraf worden ontwikkeld voor vers weefsel, zodat de analyse de mogelijkheid om standaardpathologie uit te voeren niet verstoort. Voor toepassingen die niet inherent bedoeld zijn om intraoperatief te zijn, is de karakterisering van vers weefsel nog steeds een uitdagende stap die moet worden aangepakt om te werken aan in vivo toepassingen en differentiatie.

Het doel van dit werk is om een richtlijn te bieden voor THz-toepassing voor vers uitgesneden weefsel met behulp van een commercieel THz-systeem. Het protocol werd ontwikkeld op een THz imaging en spectroscopie systeem²⁶ voor murine borstkanker tumoren^13,17,19 en werd uitgebreid tot menselijk chirurgisch weefsel verkregen uit biobanken^7,18. Terwijl het protocol werd gegenereerd voor borstkanker, dezelfde concepten kunnen worden toegepast op soortgelijke THz imaging systemen en andere vormen van vaste-tumor kankers die worden behandeld met een operatie waar succes hangt af van marge beoordeling²⁷. Door een vrij kleine hoeveelheid gepubliceerde THz-resultaten op vers uitgesneden weefsels, is dit het eerste werk voor de kennis van de auteurs om zich te concentreren op het protocol van vers weefselbehandeling voor THz-beeldvorming en karakterisering.

Protocol

Dit protocol voldoet aan alle eisen van de afdeling Milieugezondheid en Veiligheid van de Universiteit van Arkansas.

1. Het weefselbehandelingsgebied instellen

1. Neem een roestvrijstalen metalen lade en bedek deze met de biohazard zak zoals afgebeeld in figuur 1. Elke behandeling van de biologische weefsels zal worden uitgevoerd binnen de lade gebied (dat wil zeggen, het weefsel handling gebied).
2. Bereid laboratorium pincet, weefsel doekjes, papieren handdoeken, filter papieren verpakking, weefsel kleurstof flessen, bleekmiddel fles, en ethanol fles rond de lade voor gemakkelijke toegang wanneer dat nodig is. Bewaar gebruikte weefsels, doekjes en handschoenen op het oppervlak van het biohazard materiaal om aan het einde van het protocol te verwijderen.
3. Vul een centrifugebuis van 50 mL met maximaal 45 mL van 10% neutraal gebufferd formaline en plaats deze in de centrifugeopslaglade in de buurt van de tissuehandlingtray.

Figuur 1: Opstelling van weefselbehandelingsgebied. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

2. Behandeling van verse borstkanker tumor voor THz Transmission Spectroscopie

LET OP: Voordat u met levende weefsels omgaat, trekt u nitrilhandschoenen, oogbeschermingsbril, een gezichtsmasker en een labjas aan. Gebruik altijd laboratoriumpincet om weefsels te behandelen en te voorkomen dat ze direct met de handen worden aangeraakt. Alle werkzaamheden met vers weefsel buiten een verzegelde recipiënt of het scanstadium moeten worden uitgevoerd in het weefselbehandelingsgebied dat in stap 1.1 is vastgesteld.

LET OP: Alle weefsels behandeld in dit werk werden verzonden in Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) en antibiotica oplossing van de biobank.

1. Verwijder de bulktumor uit de DMEM-oplossing en plaats deze in een petrischaaltje op het weefselbehandelingsgebied (zie figuur 2A).
2. Van grove inspectie, identificeren verschillende tumor regio's van waaruit kleine stukjes snijden voor transmissie karakterisering. Snijd een 0,5 mm dik segment van de tumor van de geïdentificeerde punten met behulp van een roestvrij stalen low profile mes, zoals weergegeven in figuur 2B. Plaats dit gesneden gedeelte tussen twee kwartsramen met een afstand van 0,1 mm dikte in een vloeistofmonsterhouder, zoals afgebeeld in figuur 2C.

Figuur 2: Tumorsectie voor de THz transmissiespectroscopie metingen. (A) Foto van de bulktumor. (B) Foto van de kleine secties (0,5 mm) van de tumor gesneden uit de bulk tumor. (C) De gesneden tumorsectie die in de vloeistofmonsterhouder tussen de twee kwartsramen is geplaatst met een polytetrafluorethyleenspacer van 0,1 mm voor spectroscopiemeting. Figuur opnieuw gepubliceerd van T. Bowman et al.¹⁸ met toestemming van SPIE. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

3. THz Transmission Spectroscopie Metingen

1. Stel de transmissiespectroscopiemodule in de THz-kernkamer in door de handgrepen van de module over de montagepalen in het kernsysteem uit te lijnen en het podium naar beneden in het systeem te schuiven. Draai de twee montageschroeven in de linkerbovenhoek en de linkerbenedenhoek van de module aan, zoals afgebeeld in figuur 3A.
2. Zuiver het systeem met droog stikstofgas bij 5 L/min (LPM) tijdens de gehele spectroscopieprocedure om waterdamp uit de monsterruimte te verwijderen.
3. Open de THz-transmissiespectroscopie-meetsoftware van het bureaublad dat is aangesloten op het THz-systeem. Het opent het hoofdvenster.
4. Klik op het tabblad Scannen boven aan het venster. Er verschijnt een spectra-scaninstallatievenster. Selecteer Transmissie om transmissiespectroscopie in te stellen in het vervolgkeuzemenu van het tabblad Metingsmodus rechtsboven in het venster. Als de piek niet automatisch zichtbaar is, schakelt u de optie Inschakelen in onder het tabblad Handmatig zoeken naar pieken en zet u de optische vertraging handmatig in om de piek in beeld te brengen.
5. Na 30 min van het zuiveren, registreert een luchtreferentiesignaal door de onderstaande stappen te volgen.
   1. Voer onder het tabblad Scaninstellingen in het venster voor het instellen van spectra scannen een geschikte naam voor het referentiebestand in, stel Num Scans in op 1.800 en stel de startvertraging (s)in op 0. Laat de andere instellingen als hun standaardwaarden.
   2. Klik op Referentie meten in het venster voor de installatie van de scan om de luchtreferentiemeting uit te voeren. Klik vervolgens op Measure Sample om het transmissiesignaal door de lucht te meten als een monstergemiddelde van 1.800 signalen van meer dan ~ 1 min.

Figuur 3: THz transmissie spectroscopie module setup. (A) THz-kernkamer met de transmissiemodule erop gemonteerd. bB) Een foto van de vloeistofmonsterhouder. (C) De monsterhouder die voor de metingen in de kernkamer is geplaatst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

6. Meet de twee kwartsramen in de vloeistofmonsterhouder zoals aangegeven in figuur 3B.
   1. Plaats de twee kwartsramen in de vloeistofmonsterhouder zonder spaander ertussen.
   2. Open de THz-kernkamer. Monteer de vloeistofmonsterhouder op de transmissiespectroscopiemodule, zoals aangegeven in figuur 3C. Sluit de kamer.
   3. Klik op het tabblad Scannen in het hoofdvenster. Herhaal stap 3.5.1–3.5.2 voor het kwartsmonster, maar werk Start Delay (s)bij naar 900. Dit maakt het mogelijk om alle waterdamp te zuiveren voor de meting.
   4. Als het kwarts gewenst is als referentie voor extra monsters, klikt u op het tabblad Duidelijke verwijzing onder de scaninstellingen. Dit maakt de luchtreferentie vrij. Klik vervolgens op het tabblad Metenverwijzing om de kwartsmetingen als nieuwe referentie op te nemen.
7. Plaats het gesneden tumorgedeelte tussen de twee kwartsramen in de vloeistofmonsterhouder en plaats de houder in de kamer voor een transmissiemeting met één punt van het weefsel. Als u de meting wilt opnemen, herhaalt u stap 3.6.3.
8. Haal de vloeistofmonsterhouder uit de kamer wanneer de metingen zijn voltooid en breng deze naar het gebied dat is aangewezen voor weefselbehandeling. Demonteer de vloeistof monsterhouder, veeg de tumorsectie uit de kwartsramen met de weefseldoekjes en plaats de gebruikte weefseldoekjes in dezelfde lade om samen met het andere biohazard-afval in de biohazard-zak te gooien.
9. Herhaal stap 2.2, 3.7 en 3.8 indien nodig om extra tumorsegmenten te karakteriseren. Wanneer de metingen zijn voltooid, gaat u naar het hoofdvenster en klikt u op het tabblad Bestand om de meetgegevens op te slaan. Sluit het softwarevenster.

4. Behandeling verse borstkanker tumor voor THz Reflectie Mode Imaging

1. Verwijder het verse tumormonster uit de DMEM en antibioticaoplossing en leg het op een petrischaaltje. Met behulp van grove inspectie, selecteer een kant van de tumor te worden afgebeeld die voldoende plat is en heeft weinig bloed en weinig bloedvaten. Vermijd beeldvorming weefsel met bloed of bloedvaten indien mogelijk.
2. Plaats de tumor met de kant te worden afgebeeld op rang 1 filterpapier om de overtollige DMEM drogen en duidelijk het weefsel van vloeistof of afscheidingen van de tumor, zoals blijkt uit figuur 4A. Herpositioneer de tumor op het filterpapier naar een droge plek als het papier verzadigd. Droog de tumor voor ~ 5 min.

Figuur 4: Verse tumormonstervoorbereiding voor THz-beeldvorming. (A) Tumor geplaatst op filterpapier te drogen. (B) Tumor geplaatst op polystyreen plaat over de beeldvorming venster met weefsel veegkussens om overtollige vloeistoffen te absorberen. (C) Tumor bekeken van onderen naar oriëntatie te volgen en te controleren op luchtbellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

3. Monteer de transmissiespectroscopiemodule en stel de reflectiebeeldmodule (RIM)-spiegelbasis in op het THz-kernsysteem zoals afgebeeld in figuur 5A. Bij het instellen van de spiegels, monteer de RIM scanning stage boven de spiegel basis en schroef het in de kern systeem (zie figuur 5B).
4. Zuiver het systeem met droog stikstofgas op 5 LPM gedurende 30 minuten voorafgaand aan de beeldvormingsprocedure om waterdamp uit het monstercompartiment te verwijderen. Na 30 min, de hoeveelheid droog stikstof gas te verminderen tot 3 LPM voor de rest van de tijd het systeem in gebruik is.
5. Plaats een polystyreenplaat van dikte ~ 1,2 mm op het scanvenster met een diameter ~37 mm. Centreer het scanvenster samen met de polystyreenplaat op het monsterstadium.

Figuur 5: Systeemopstelling voor reflectiebeeldvorming. (A) Reflectie imaging module spiegel basis. (B) Scanfase. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

LET OP: Andere diktes en plaatmaterialen zijn geschikt voor stap 4.5, maar moeten een uniforme dikte hebben en laag genoeg absorptie hebben om het THz-signaal niet te belemmeren.

6. Open de THz reflectie imaging measurement software van het bureaublad aangesloten op het THz-systeem. Er verschijnt een venster met verschillende dialoogvensterpictogrammen voor specifieke functies en twee subvensters voor THz-veldplots (willekeurige eenheden a.u.) tegen respectievelijk de tijd en frequentie.
7. Als u de parameters voor de RIM-set-set wilt instellen, klikt u op het pictogram Afbeeldingsparameterdialoogvenster boven aan het venster. Er verschijnt een venster Parameters voor afbeeldingsacquisitie. Selecteer RIM in het vervolgkeuzemenu van het tabblad Sjabloon voor reflectieweergave ingesteld. Druk op OK en ga terug naar het hoofdvenster van de software.
8. Klik in het hoofdvenster op het pictogram Scannen met vaste punten. Dit activeert de THz-antennes om te beginnen met het verzenden van het incident THz-signaal en het ontvangen van de gereflecteerde THz-signaal vanaf een enkel punt op de polystyreenplaat.
9. Klik op het pictogram Dialoogvenster Motorfase boven aan het hoofdvenster. Het motorcontrolevenster gaat open. Pas de optische vertragingsas aan door op de pijlen vooruit/achteruit te klikken om de gereflecteerde puls van het polystyreen in het hoofdvenster te centreren.
   LET OP: Na het aanpassen van de optische vertragingsas moeten twee pulsen op het venster verschijnen, zoals weergegeven in figuur 6:een van de onderste interface van de polystyreenplaat (primaire reflectie) en een van de bovenste interface van de polystyreenplaat (secundaire reflectie).
10. Raam de primaire reflectie van de polystyreenplaat uit en houd de secundaire reflectie in het venster, wat zal bijdragen aan de reflecties van het weefsel tijdens de beeldvormingsprocedure. Dit gebeurt in twee stappen.
    1. Klik eerst op de knop DAQ-instellingen boven aan het hoofdvenster om het dialoogvenster DAQ-instellingen te openen. Wijzig de optische vertragingswaarde van 5 V (standaard) naar 4 V.
    2. Ten tweede, pas de verticale positie van de scanfase aan met de micrometerschaal op het scanstadium totdat de minima van de secundaire puls de sterkste zijn. Pas de optische vertraging van de as in het motorcontrolevenster aan om de primaire reflectie buiten het bereik van het gemeten gereflecteerde signaal te plaatsen.
       LET OP: Voor een 1,2 mm dikke polystyreenplaat wordt de primaire reflectie uitgevensterd wanneer de secundaire reflectieminimale piek ongeveer -0,3 mm bedraagt op de optische vertragingsas van het tijddomeinvenster.

Figuur 6: THz-reflecties van de onderste en bovenste interfaces van de polystyreenplaat. (A) THz signaal incident aan en gereflecteerd van een 1,2 mm dikke polystyreen plaat. (B) Gemeten primaire en secundaire THz-tijddomeinsignalen van het polystyreen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

11. Niveau van de monsterfase en neem het referentiesignaal op.
    1. Selecteer twee punten op elke as (A-as en B-as) die locaties aanduiden op de polystyreenplaat aan de rand van het voorbeeldvenster. Voor de A-as van -15 mm–15 mm kunnen de twee positiepunten bijvoorbeeld -10 mm en 10 mm zijn; en voor de B-as van -15 mm–15 mm kunnen de twee positiepunten -10 mm en 10 mm zijn.
    2. Klik op de knop Dialoogvenster Motorbesturing om het venster van het motorbesturingsvenster te openen. Plaats het motorcontrolevenster en het hoofdvenster van de software zo dat het tijddomeinsignaal zichtbaar is tijdens het aanpassen van de motorische posities. Stel zowel de A-as als de B-as in op 0 mm.
    3. De A-as nivelleermet de volgende stappen. Een bereik van -10 mm–10 mm wordt als voorbeeld gebruikt.
    4. Wijzig in het venster Motorbesturingde waarde van de A-as van 0 naar -10 en druk op Enter. Het podium verplaatst zich naar de positie -10 mm op de A-as en er wordt een verschuiving in de signaalpositie op het hoofdvenster waargenomen.
    5. Gebruik de verstelbare micrometerschaal op de scanfase in figuur 5B om de minimale piek van het signaal terug te brengen naar de positie in stap 4.10.2.
    6. Wijzig de waarde van de A-as in +10 en druk op enter. Het podium wordt nu verplaatst van de -10 mm-positie naar de +10 mm-positie op de A-as en er wordt opnieuw een verschuiving in het signaal waargenomen. Let op de richting en de afstand die het signaal verschoven van de vorige positie en verander de Waarde van de A-as opnieuw in -10. Het signaal gaat terug naar de positie in stap 4.11.5.
    7. Draai de nivelleringsschroef op de A-as van de scanfase, zoals weergegeven in figuur 5B en verschuif het signaal om de afstand te verdubbelen in dezelfde richting die het van de oorspronkelijke positie verplaatste. Gebruik de micrometer op het scanstadium om het signaal terug te verschuiven naar de oorspronkelijke positie (-0,3 mm voor 1,2 mm polystyreen).
    8. Herhaal stap 4.11.6–4.11.7 totdat het signaal op +10 en -10 gelijk is en de piek voor beide posities is gericht op de oorspronkelijke positie (-0,3 mm op de optische as).
12. Zodra de nivellering van de A-as is bereikt, wijzigt u de Waarde van de A-as in 0 en herhaalt u dezelfde procedure voor de B-as. Begin met het wijzigen van de waarde van de B-as op het motorbesturingsvenster van 0 naar de meest positieve waarde (bijvoorbeeld +10 mm). Gebruik tijdens het nivelteren ook de nivelleringsschroef op de B-as van de scanfase, die wordt weergegeven in figuur 5B.
13. Zodra beide assen zijn genivelleerd, geeft u zowel de A-as als de B-as terug naar 0 mm. Sluit het motorcontrolevenster en controleer of het signaal zich in de oorspronkelijke positie bevindt voor het geval het een beetje wordt verschoven.
14. Neem dit signaal op als referentie.
    1. Ga naar het venster DAQ-eigenschappen. Wijzig de gemiddeldewaarde in 5 en houd alle andere parameters standaard.
    2. Klik op Nieuwe referentie. De gemiddelde teller rechtsboven in het venster telt van 0-20. Zodra de teller 20 is, wijzigt u de gemiddeldewaarde in 1 en klikt u op OK. Het gereflecteerde signaal van het polystyreen wordt opgeslagen als referentie voor eventuele scans die later worden genomen.
       OPMERKING: Als alleen de THz-beeldvormingsprocedure moet worden uitgevoerd, u het beste stappen 4.3–4.14 uitvoeren voordat u het tumorweefsel uit de DMEM-oplossing haalt.
15. Monteer de tumor op de polystyreenplaat die het venster van het scanstadium bedekt.
    1. Verwijder het beeldvenster uit het scanstadium en breng het naar het weefselbehandelingsgebied. Plaats de tumor op een polystyreenplaat, zoals afgebeeld in figuur 4B.
    2. Zorg ervoor dat er geen significante luchtbellen tussen de plaat en de tumor. Als luchtbellen worden waargenomen, druk op de tumor met een pincet of til de tumor op en rol deze voorzichtig op het polystyreen totdat de luchtopeningen worden geminimaliseerd.
    3. Plaats absorptievertome afstandhouders op regelmatige tijdstippen rond het monster zoals aangegeven in figuur 4B. Plaats een andere polystyreenplaat boven de tumor en druk zachtjes om het tumoroppervlak zo plat mogelijk te maken. Plak deze polystyreen-tumor-polystyreen opstelling op het monstervenster.
16. Draai het voorbeeldvenster zoals weergegeven in figuur 4Cen maak foto's van de tumor om de oriëntatie bij te houden. Breng het voorbeeldvenster met de tumor terug naar het scanstadium.
17. Klik op de knop Dialoogvenster Afbeeldingsparameter om het venster Parameters voor afbeeldingsverwerving te openen. Stel de waarden van Axis1min, Axis1max, Axis2minen Axis2max in om de positie van de tumor volledig in het beeldvenster te plaatsen
    OPMERKING: Axis1 is standaard de A-as en Axis2 is de B-as.
18. Stel Axis1step en Axis2step in op 0,2 mm voor de beeldscan.
    OPMERKING: Als u de stapgrootte van de as1stap en As2step instelt, worden de stapgrootte van de stappermotoren ingesteld op 200 μm-stappen tijdens het scanproces. De totale scantijd kan worden geschat in het venster Parameters voor afbeeldingsacquisitie.
19. Klik op het tabblad Meten in het hoofdvenster en selecteer de optie Flyback 2D Scan. Geef in het venster dat verschijnt de map en bestandsnaam aan waaronder de scangegevens kunnen worden opgeslagen.

5. Nabewerking van het verse weefsel ter voorbereiding van de histopathologieprocedure

1. Verwijder na voltooiing van het scanproces het monstervenster, de polystyreenplaten en het monster van het kern-THz-systeem en verplaatst deze naar het gebied dat is aangewezen voor gevaarlijk afval. Verwijder de tumor van de polystyreenplaat en plaats deze op een plat stuk karton van een grootte die vergelijkbaar is met dat van de tumor. Zorg ervoor dat de oriëntatie van de tumor is hetzelfde als het was op het polystyreen, met de beeldvorming gezicht het aanraken van het karton.
2. Dip een wattenstaafje in rode weefsel kleurstof en vlek de linkerkant van de tumor tot waar de rand van de tumor contact met het karton. Ook vlek de rechterkant van de tumor met blauw weefsel kleurstof. Bevlek het blootgestelde oppervlak van de tumor met een lijn van gele weefselkleurstof die de rode vlek verbindt met de blauwe vlek om de achterkant van het monster aan te duiden, zoals afgebeeld in figuur 7A.
   LET OP: Om te voorkomen dat de inkt de formaline oplossing kleurt, breng je slechts een dunne laag aan op het weefsel. Dit kan worden bereikt door het wattenstaafje op een ander oppervlak te deppen voordat het weefsel kleurt of een schoon wattenstaafje gebruikt om overtollige kleurstof af te vegen. Vermijd de kleurstof contact te laten opnemen met de huid of kleding. Dit tumorkleuringsproces wordt uitgevoerd als een verwijzing naar informatie over de beeldvormingskant van de tumor en de oriëntatie ervan op de patholoog.

Figuur 7: Nabewerking op de tumor na THz-beeldvorming. (A) Tumor geplaatst gezicht naar beneden op kartonnen houder en geverfd met weefsel markering kleurstof. (B) Filter papier geplaatst over tumor en afgeplakt om contact te houden. (C) Gekleurde tumor vast op het karton ondergedompeld in 10% neutraal gebufferde formaline oplossing en verzegeld met parafilm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

3. Laat de inkt ongeveer 3-4 min drogen. Snijd een stuk filterpapier met dezelfde geschatte afmetingen als het karton. Plaats het op de tumor en wikkel een stuk tape volledig rond het filterpapier en karton zoals afgebeeld in figuur 7B. Het tape- en filterpapier moet de tumor tegen het karton beveiligen zonder significante druk uit te oefenen.
4. Dompel het gekleurde weefsel dat op het karton is aangebracht onder in 10% neutrale gebufferde formalineoplossing en sluit de centrifugebuis af met een paraffinefolie, zoals afgebeeld in figuur 7C. Wijs het monsternummer, de datum, het weefseltype en het tumornummer aan voor het monster op het buisetiket. Stuur de tumor naar de patholoog voor verdere histopathologie verwerking.

6. Verwijdering van gevaarlijk afval

1. Verzamel al het afval van de tissue handling tray samen met de biohazard zak gebruikt om de lade te dekken en zet het in een nieuwe biohazard zak, zoals afgebeeld in figuur 8. Breng de zak naar de aangewezen biogevaarlijke afvalruimte in het gebouw en maak een afspraak met de afdeling Environmental Health and Safety (EH&S) voor het ophalen van afval. Reinig de tissue handling tray en de omgeving op de tafel met 10% bleekmiddel oplossing en ethanol.

Figuur 8: Foto van de biogevaarlijke afvalzak. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

2. Neem de vloeistofmonsterhouder met de afstandhouders en kwartsramen, het bemonsteringsvenster waarop de tumor is gemonteerd, polystyreenplaten en laboratoriumpincet naar de wasruimte. Spoel alle materialen met water en vervolgens 10% bleekmiddel oplossing, afvegen met papieren handdoeken indien nodig om weefsel puin te verwijderen. Spoel opnieuw af met water, schrob met alconox-oplossing en spoel grondig af. Voor glas en plasticware, spoel in 70% isopropyl alcohol en zet apart om te drogen.
   LET OP: Zodra de tumor in formaline is en de monsterruimte schoon is, kan de gegevensverwerking tegelijkertijd met beeldvorming of een later tijdstip worden behandeld.

7. Gegevensverwerking om THz-beelden te construeren

1. Exporteer de opgeslagen .tvl-gegevensbestanden van het THz-systeem. De ruwe gegevensbestanden die uit het systeem worden verkregen, worden in Python geschreven en worden het best gelezen in Python voordat ze worden opgeslagen als MATLAB-gegevensbestanden.
2. Als u de THz-afbeelding van het gescande verse weefsel wilt construeren, zet u de gegevens van de opnamevan de raw-time-domeinreflectie om in het frequentiedomein met Behulp van Fourier-transformatie op de derde dimensie van de ruwe gegevensmatrix (d.w.z. de tijddimensie). Neem ook de Fourier-transformatie van de referentiegegevens.
   LET OP: Een typisch frequentiedomeinspectrum moet gegevens bieden variërend van 0,1 THz-4 THz.
3. Normaliseer de monstergegevens met de referentiegegevens en voer de vermogensspectra uit op basis van de integratie van de genormaliseerde gegevens over het frequentiebereik van f₁ = 0,5 THz tot f₂ = 1,0 THz met behulp van de volgende vergelijking¹⁹:
   
   LET OP: Hier E_monster is de frequentie domein reflectie imaging gegevens van het weefsel monster en E_referentie is de frequentie domein van een enkel punt reflectie gegevens van het referentiesignaal.
4. Bouw de tweedimensionale afbeelding door de berekende vermogensspectragegevens op elk punt in de matrix die door de A-as en b-as wordt gedefinieerd, in kaart te brengen. Dit staat bekend als de power spectra THz beeld.
   LET OP: De methode om in plaats daarvan een tomografische THz-afbeelding te verkrijgen, wordt beschreven in stappen 7,5–7.7.
5. Bereken voor karakterisering de theoretische frequentieafhankelijke reflectie voor een reeks potentiële weefseleigenschappen met behulp van de volgende vergelijking¹⁸:
   
   LET OP: Hier ρ_T,ij is de complexe Fresnel reflectiecoëfficiënt tussen regio i en regio j;d_j is de dikte van regio j; en de_j hoek van de voortplanting in regio j gerelateerd aan de invalshoek van de Wet van Snell. is de complexe voortplantingscoëfficiënt in gebied j, waar ω de hoekfrequentie is, c is de lichtsnelheid in vacuüm, n_j is het werkelijke deel van de brekingsindex, en α_abs,j is de absorptiecoëfficiënt¹⁸. Regio 1 is lucht, regio 2 is de polystyreenplaat, en regio 3 is het weefsel.
6. Bereken de reflectie in vergelijking (2) voor een reeks door de gebruiker gedefinieerde brekingsindexen en absorptiecoëfficiënten voor regio 3 (n₃ en α_abs,3) en vergelijk met het gemeten signaal op elk punt om de gecombineerde gemiddelde kwadraatfout voor de omvang en fase te berekenen.
   LET OP: De oplossing voor de brekingsindex en absorptiecoëfficiënt is het paar waarden dat de laagste fout geeft.
7. Bouw de tomografische THz-afbeelding uit de geëxtraheerde brekingsindex- en absorptiecoëfficiëntgegevens(n₃ en α_abs,3)bij elke pixel. Analyseer de tumorgebieden door te vergelijken met het pathologiediabeeld dat is verkregen van de patholoog. Representatieve resultaten worden weergegeven in figuur 9, met voorbeelden van onvoldoende naleving van het protocol in figuur 10 en figuur 11.

8. Extractie van elektrische eigenschappen van het weefsel met behulp van transmission spectroscopie gegevens

1. Ga in het hoofdvenster van de thz-transmissiespectroscopie-meetsoftware naar het tabblad Bestand en klik op de optie Exporteren. Er verschijnt een venster om het gegevenstype en voorbeeld te selecteren dat u wilt exporteren. Kies gegevenstypen overdrachts- en doorgiftefase voor de kwarts- en weefselmonstermetingen.
2. Bereken de theoretische frequentieafhankelijke transmissie voor een reeks potentiële weefseleigenschappen met de volgende vergelijking¹⁵:
   
   LET OP: Hier is de verhouding tussen De transmissiecoëfficiënten van Fresnel voor de steekproef en verwijzingsopstellingen; γ₁ en γ₃ zijn respectievelijk de complexe voortplantingsconstanten van lucht en weefsel; en d is de dikte van het weefsel. De voortplantingsconstante in het algemeen wordt gedefinieerd als . ñ is de complexe brekingsindex gedefinieerd als , wanneer n het werkelijke deel van de brekingsindex is; c is de snelheid van het licht; ω is de hoekfrequentie; en α_abs is de absorptiecoëfficiënt¹⁵.
3. Bereken de gecombineerde gemiddelde kwadraatfout tussen de omvang en fase van de transmissie in vergelijking (3) en de meetgegevens van het systeem voor een reeks door de gebruiker gedefinieerde n- en α_abs-waarden.
   LET OP: De oplossing voor de brekingsindex en absorptiecoëfficiënt is het paar waarden dat de laagste fout geeft.
4. Plot de geëxtraheerde brekings- en absorptiecoëfficiëntgegevens ten opzichte van het frequentiebereik van 0,15-3,5 THz. Representatieve resultaten worden weergegeven in figuur 12.

Resultaten

De THz beeldvormingresultaten¹⁸ verkregen volgens het bovengenoemde protocol van menselijke borstkanker tumor specimen #ND14139 ontvangen van de biobank worden gepresenteerd in figuur 9. Volgens het pathologierapport was de #ND14139 tumor een I/II-graad was die het ductalcarnoom (IDC) infiltreerde van een 49-jarige vrouw via een operatie in de linkerborstlumpectomie. De foto van de tumor wordt getoond in figuur 9A, het pathologiebeeld in ...

Discussie

Effectieve THz reflectie beeldvorming van vers weefsel is in de eerste plaats afhankelijk van twee kritische aspecten: 1) de juiste overweging van weefselbehandeling (secties 2 en 4.15); en 2) de stage setup (voornamelijk sectie 4.11). Onvoldoende drogen van het weefsel kan leiden tot een verhoogde reflectie en onvermogen om gebieden te visualiseren als gevolg van hoge reflecties van DMEM en andere vloeistoffen. Ondertussen, slecht weefsel contact met de beeldvorming venster creëert ringen of vlekken van lage reflectie i...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
70% isopropyl alcohol	VWR	89108-162	Bevat 70% USP-kwaliteit isopropanol en 30% USP-kwaliteit gedeïoniseerd water
Alconox poederreiniger	VWR	21835-032	Geconcentreerde reiniger om organische verontreinigingen te verwijderen van glas, metaal, roestvrij staal, porselein, keramiek, plastic, rubber en glasvezel
Bio Hazaard Zakken	Fisher Scientific	19-033-712	Justrite FM-Goedgekeurde Biohazard Waste Container Vervangende Zakken
Karton houder	N/A	N/A	Schrootkarton om het weefselbeeldvlak intact te houden wanneer ondergedompeld in formaline
Centrifugebuizen	VWR	10026-078	Centrifugebuizen met platte doppen, kegelvormige bodem, polypropyleen, steriel, standaardlijn
Wattenstaafjes	Walmart	551398298	Q-tips Originele Wattenstaafjes gebruikt om het weefsel te verven
Ethyl Alcohol	VWR	71002-426	KOPTECH Pure (onverdund) anhydrisch (200 proof/100%) ethyl alcohol
Oogbeschermingsbril	VWR	89130-918	Kimberly-clark professionele veiligheidsbrillen
Gezichtsmasker	VWR	95041-774	DUKAL Corporation chirurgische maskers
Filterpapier	Sigma Aldrich	Z240087	Whatman grade 1 cellulosefilters
Formaline oplossing	Sigma Aldrich	HT501128-4L	10% neutraal gebufferde formaline
Menselijke vers vers geëxciseerde tumoren (Infiltererend ductaal carcinoom (IDC))	National Disease Research Interchange (NDRI biobank	N/A	Er is een protocol ondertekend met de NDRI voor het type tumoren dat vereist is
IRADECON Bleekmiddeloplossing	VWR	89234-816	Voorverdunde natriumhypochloriet bleekmiddeloplossing
KIMTECH SCIENCE doekjes	VWR	21905-026	Kimberly-clark professionele Kim doekjes
Laboratoriumjas	VWR	10141-342	Dit catalogusnummer is voor een middelgrote jas
Laboratoriumpincetten/forceps	VWR	82027-388	Elke laboratoriumpincet kan worden gebruikt zolang het het weefsel niet beschadigt
Vloeibare monsterhouder (twee kwartsvensters met een 0,1 mm teflon-afstandhouder)	TeraView, Ltd	N/A	1" diameter, en 0,1452" dikke kwartsvensters
Nitril handschoenen	VWR	82026-426	Dit catalogusnummer is voor middelgrote handschoenen
Stikstofcilinder	Airgas	NI UHP300	STOFN UHP GR 5.0 SIZE 300
Papieren handdoek	VWR	14222-321	11" x 8,78" vellen, 1 laag
Parafilm	VWR	52858-076	Flexibele thermoplast. Opgerolde, waterdichte laag, verweven met papier om zelf-aanhechting te voorkomen.
Petrischaal	VWR	470210-568	VWR Petrischaal, Slippable, Mono Plate (onverdeelde bodem)
Polystyreen plaat	Home Depot	1S11143A	~ 10 cm x 10 cm vierkant stuk gesneden uit een 11" x 14" x 0,05" Non-glare styreenplaat
ScanAcquire Software	TeraView, Ltd	N/A	Systeemsoftware voor THz reflectie beeldvorming metingen
Roestvrij stalen laag profielmes (#4689)	VWR	25608-964	Tissue-Tek Accu-Edge Wegwerp Microtoommessen
Roestvrij stalen metalen lade	Quick Medical	10F	Polar Ware Roestvrij Staal Medische Instrumentenbakken
Weefselmarkeringskleurstoffen	Ted Pella, Inc	Gele kleurstof #27213-1 Rode kleurstof #27213-2 Blauwe kleurstof #27213-4	Gebruikt om verwijderde weefselmonsters te orienteren naar het histopathologie laboratorium gestuurd
TPS Spectra 3000	TeraView, Ltd	N/A	THz beeldvormings- en spectroscopiesysteem
TPS Spectra Software	TeraView, Ltd	N/A	Systeemsoftware voor THz transmissie spectroscopie metingen