We beschrijven een intracisternalinjectie die een naald gebruikt die aan de punt is gebogen en die kan worden gestabiliseerd aan de schedel, waardoor het risico op schade aan de onderliggende parenchyma wordt geëlimineerd. De aanpak kan worden gebruikt voor genetische lot mapping en manipulaties van leptomeningealcellen en voor het bijhouden van cerebrospinale vloeistof beweging.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Inductie van Leptomeningeal Cellen Wijziging Via Intracisternal Injectie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het hier beschreven protocol beschrijft hoe u veilig en handmatig oplossingen injecteren via de cisterna magna terwijl het risico op schade aan de onderliggende parenchyma wordt geëlimineerd. Eerder gepubliceerde protocollen raden het gebruik van rechte naalden die moeten worden verlaagd tot een maximum van 1-2 mm van het dural oppervlak. De plotselinge daling van de weerstand zodra het durale membraan is doorboord, maakt het moeilijk om de naald in een stabiele positie te houden. Onze methode, in plaats daarvan, maakt gebruik van een naald gebogen op de punt die kan worden gestabiliseerd tegen het occipital bot van de schedel, waardoor de spuit niet in het weefsel doordringt na perforatie van het durale membraan. De procedure is eenvoudig, reproduceerbaar en veroorzaakt geen langdurig ongemak bij de geopereerde dieren. We beschrijven de intracisternal injectiestrategie in de context van genetische fate mapping van vasculaire leptomeningealcellen. Dezelfde techniek kan bovendien worden gebruikt om een breed scala van onderzoeksvragen aan te pakken, zoals het onderzoeken van de rol van leptomeninges in neuroontwikkeling en de verspreiding van bacteriële meningitis, door genetische ablatie van genen putatief betrokken bij deze verschijnselen. Bovendien kan de procedure worden gecombineerd met een geautomatiseerd infusiesysteem voor een constante levering en worden gebruikt voor het volgen van cerebrospinale vloeistofbeweging via injectie van fluorescerende gelabelde moleculen.
Inleiding
Leptomeningealcellen zijn een fibroblast-achtige populatie van cellen georganiseerd in een dunne laag die de hersenen overlegt en genen uitdrukt die betrokken zijn bij collageencrosslinking (bijvoorbeeld Dcn en Lum), en bij de oprichting van een hersen-meningeale barrière (bijvoorbeeld Cldn11)1,2. Leptomeningeale cellen zijn betrokken bij een breed scala van fysiologische functies, van strikte controle over de cerebrospinale vloeistof drainage3 tot begeleiding van neurale voorouders in de zich ontwikkelende hersenen4,5. Een recente studie heeft ook voorgesteld dat leptomeninges in de pasgeborene kan haven radiale glia-achtige cellen die migreren naar de hersenen parenchyma en ontwikkelen tot functionele corticale neuronen6.
Leptomeningealcellen bevinden zich in de nabijheid van oppervlakteastrocyten en delen met hen, evenals andere parenchymale astroglia, expressie van connexin-30 (Cx30)7. De onderstaande chirurgische procedure maakt een wijdverbreide en specifieke etikettering van deze meningealecellen mogelijk via een eenmalige levering van endoxifen in de cisterna magna van transgene muizen die tdTomato in Cx30+ cellen voorwaardelijk uitdrukken (d.w.z. met behulp van een CreER-loxP-systeem voor het in kaart brengen van het lot). Endoxifen is een actieve metaboliet van Tamoxifen en induceert recombinatie van CreER-uitdrukkende cellen op dezelfde manier als Tamoxifen doet. Het is echter de aanbevolen oplossing voor actuele toepassing, omdat het oplost in 5-10% DMSO, in plaats van hoge concentraties ethanol. Bovendien kruist endoxifen niet de hersen-meningeale barrière, waardoor een specifieke recombinatie van leptomeningeale cellen mogelijk wordt, zonder etikettering van de onderliggende Cx30+ astrogliale populatie (zie representatieve resultaten).
De hier gepresenteerde techniek is gericht op het handmatig en veilig injecteren van de verbinding in het hersenvocht, via directe toegang tot de cisterna magna. In tegenstelling tot andere, meer invasieve procedures die craniotomie vereisen, maakt deze aanpak het mogelijk om verbindingen te bezielen zonder schade aan de schedel of het brein parenchyma te veroorzaken. Het wordt dus niet geassocieerd met de inductie van ontstekingsreacties veroorzaakt door activering van parenchymale gliacellen. Net als bij andere injectiestrategieën beschreven vóór8,9,10, is de huidige aanpak gebaseerd op de chirurgische blootstelling van het atlanto-occipital dural membraan dat de cisterna magna bedekt, na een stompe dissectie van de overlopende nekspieren. Echter, in tegenstelling tot andere procedures, raden we het gebruik van een naald gebogen aan de punt, die kan worden gestabiliseerd tegen het occipital bot tijdens toediening. Dit voorkomt het risico dat de naald te diep doordringt en het onderliggende cerebellum en medulla beschadigt.
Deze chirurgische ingreep is compatibel met afstammingsonderzoeken die gericht zijn op het in kaart brengen van veranderingen in celidentiteiten en migratieroutes via haakjeslagen. Het kan ook worden aangepast aan genetische ablatiestudies die van plan zijn de rol van leptomeningealcellen in gezondheid en ziekte te onderzoeken, zoals hun bijdrage aan corticale ontwikkeling5 of de verspreiding van bacteriële meningitis3,11. Ten slotte kan het worden gebruikt om cerebrospinale vloeistof beweging te volgen in combinatie met de levering van fluorescerende tracers in wildtype dieren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De hierbij voorgestelde chirurgische procedures werden goedgekeurd door Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd en uitgevoerd in overeenstemming met de specificaties van het onderzoeksinstituut (Karolinska Instituut, Zweden).
LET OP: Intracisternalinjectie kan flexibel worden aangepast voor meerdere onderzoeksdoeleinden. We presenteren hieronder een procedure die is ontwikkeld om leptomeningealcellen efficiënt te labelen voor fate mapping op basis van injectie van endoxifen in een transgene muislijn met R26R-tdTomato12 en CreER, de laatste onder de Cx30 promotor13. De etikettering van deze populatie cellen kan worden bereikt door injectie van virale constructies volgens dezelfde procedure die hieronder wordt beschreven. Ten slotte kan deze aanpak worden gebruikt voor het bijhouden van hersenvochtstroom, door infusie van fluorescerende tracers.
1. Voorbereiding van het injectiesysteem
LET OP: Wij raden aan de procedure uit te voeren in een geschikte chirurgische ruimte, en in aseptische omstandigheden. Chirurgische hulpmiddelen kunnen worden gesteriliseerd met behulp van warmte (autoclave, glazen kraal sterilisator) of ontsmet met behulp van een hoog niveau chemisch ontsmettingsmiddel als ze hittegevoelig zijn. Spoel de instrumenten voor gebruik bij het gebruik van chemische desinfectie of laat ze afkoelen wanneer ze ontsmet worden met warmte.
- Buig met behulp van tangen de naald van de injectiespuit tot 30° op 3 mm van de punt.
LET OP: Gebruik Hamilton spuiten met een 30 G schuine naald. - Bereid 1 mg/mL endoxifen oplossing, verdund in 10% DMSO en vul de spuit met de gebogen naald.
OPMERKING: Toedien 5 μL van de verbinding toe om te zorgen voor wijdverspreide blootstelling van hersencellen in de volwassen C57Bl/6j-muis (ca. 25-30 g), hoewel proefexperimenten die verschillende concentraties en injectievolumes testen nodig kunnen zijn bij de behandeling van dieren van verschillende leeftijden en stammen. - Pas de muishoofdhouder zo in dat het mondstuk zich op ongeveer 30° van het oppervlak van de chirurgische tafel bevindt.
LET OP: Een stereotactisch frame met driepuntsfixatie (d.w.z. oren en mond) kan ook voor deze procedure worden gebruikt. In dit geval wordt het dier echter alleen met het mondstuk bevestigd, terwijl de oorstaven onder de voorpoten van het dier kunnen worden verlengd en kunnen worden gebruikt om het lichaam van het dier tijdens de procedure te ondersteunen.
2. Inductie van anesthesie
- Gebruik voor injecteerbare anesthesieconcentraties en toedieningswijzen die door de veterinaire eenheid van de plaatselijke instelling worden aanbevolen.
- Voor inhalatie-verdoving, zoals isofluraan, bereid de administratie-eenheid volgens de specificaties van de fabrikant.
- Met isofluraan, ingestelde concentratie van de verbinding op 4% voor inductie van anesthesie.
- Lever lucht met een snelheid van 400 mL/min.
- Laat de anesthesie-eenheid de kamer een paar minuten vullen met de verdoving en plaats de muis daarna in de kamer.
LET OP: Voor de huidige experimenten hebben we volwassen (>2 maanden oud en ongeveer 30 g) mannelijke en vrouwelijke transgene muizen gebruikt die Cx30-CreER en R26R-tdTomato dragen en gefokt op een C57Bl/6j achtergrond. - Houd het dier in de gaten tijdens de inductie van anesthesie. Het ademhalingspatroon moet vertragen wanneer de muis onder volledige anesthesie is.
- Haal het dier uit de kamer en controleer op onderdrukking van de pootreflex door de achterpoten subtiel te knijpen.
LET OP: De reflex kan nog steeds aanwezig zijn, maar vertraagd een paar seconden. Als dat het geval is, plaats het dier terug in de kamer totdat volledige onderdrukking van de pootreflex is bereikt. - Analgesic (bijvoorbeeld Carprofen, 5 mg/kg door onderhuidse injectie) toedienen om postoperatieve pijnbestrijding te helpen.
3. Plaatsing van het dier voor de procedure
- Bevestig het hoofd van het dier op de hoofdhouder. Om de toegankelijkheid van de cisterna magna te verbeteren, positioneer je het lichaam van het dier op ongeveer 30° van het oppervlak van de tafel en het hoofd naar beneden, om een hoek van 120° met de rest van het lichaam vast te stellen en de achterkant van de nek uit te breiden om de toegang tot de cisterna magna(figuur 1A )te vergemakkelijken.
- Voeg papieren handdoeken onder het dier om zijn lichaam te ondersteunen tijdens de procedure.
- Veilige anesthesie levering via de mond stuk en vermindering isoflurane concentratie tot 2,5% en luchtlevering tot 200 ml/min.
- Breng oogheelkundige zalf aan.
4. Blootstelling van de Cisterna Magna
- Scheer de achterkant van de nek van het dier en ontsmet het gebied met 70% ethanol en Betadine.
- Met behulp van chirurgische schaar, het uitvoeren van een middellijn incisie (ca. 7 mm in lengte) te beginnen op het niveau van het occipital bot en uit te breiden naar achteren.
- Scheid voorzichtig oppervlakkig bindweefsel en nekspieren die zijwaarts van de middellijn trekken met fijne tippincet. Dit zal bloot het durale membraan overdeed van de cisterna magna, gevormd als een omgekeerde driehoek.
- Gebruik steriele absorptie speren of wattenstaafjes om eventuele resulterende bloeden controle.
- Plaats een kleine chirurgische separator om de nekspieren opzij getrokken te houden en visualisatie van de cisterna magna gedurende de hele procedure mogelijk te maken.
5. Intracisternal Injectie
- Om toegang te krijgen tot de cisterna magna, identificeert u het staarteinde van het occipital bot en plaatst u de naald die eerder onmiddellijk eronder werd gebogen.
LET OP: Er zal een plotselinge daling van de weerstand als de dural membraan wordt doorboord. De punt van de naald dringt echter slechts iets door onder het meningealeoppervlak, dankzij de gehaakte vorm. - Zodra de dura is geperforeerd, laat de gebogen punt van de naald door te dringen onder het dural oppervlak door voorzichtig te trekken de spuit naar boven en parallel aan het lichaam van het dier, om "haak" de naald aan de schedel (zie figuur 1B). Dit zorgt voor een betere stabiliteit en voorkomt dat de naald dieper doordringt, waardoor het risico van beschadiging van het onderliggende cerebellum of medulla wordt vermeden.
- Injecteer de verbinding langzaam om interferentie met de natuurlijke stroom van het hersenvocht te voorkomen.
LET OP: Afhankelijk van het doel van het experiment kan de infusiesnelheid variëren. Als een langzame en constante infusiesnelheid vereist is (bijvoorbeeld bij het gebruik van de procedure om de beweging van hersenvocht te traceren), kan het raadzaam zijn om een geautomatiseerd microinfusiesysteem te gebruiken in combinatie met de spuit. - Laat de naald na de injectie 1 min op de plaats rusten en verwijder deze voorzichtig. Gebruik fijne tip tangen om te helpen het terugtrekken van de naald uit zijn aangesloten positie.
LET OP: Het gebruik van een dunne naald (bijvoorbeeld 30 G) leidt niet tot aanzienlijke schade aan het hersenvlies en de daaruit voortvloeiende uitstroom van het hersenvocht. Als grotere naaldmaten nodig zijn, raden we aan het lekken van vloeistof te stoppen door druk uit te oefenen op de injectieplaats met behulp van een steriele katoenen punt.
6. Afsluiting van de procedure en postoperatieve zorg
- Verwijder de separator en laat de spieren terug te gaan naar hun oorspronkelijke positie overhet dural membraan.
- Sluit de huidincisie met behulp van een paar druppels cyanoacrylaatlijm.
LET OP: U ook absorberende hechtingen gebruiken (bijvoorbeeld 5-0 vicrylhechtingen) en de huidincisie sluiten met onderbroken hechtingen. - Breng lokale verdoving (bijvoorbeeld 100 μL van 5% lidocaine) aan op de incisieplaats.
- Haal het dier uit de houder en plaats in een schone kooi op een verwarmingskussen. Hou het dier in de gaten tot het weer bij bewustzijn is.
LET OP: De procedure zal naar verwachting geen langdurige pijn of angst bij het dier veroorzaken. Niettemin moet de muis gedurende de eerste postoperatieve dagen nauwlettend worden gevolgd en kunnen pijnbestrijdingsmaatregelen worden genomen wanneer dit nodig wordt geacht, en in overeenstemming met de aanbevelingen van de veterinaire eenheid van uw instelling.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Intracisternal injectie van endoxifen in transgene muizen uitdrukken CreER onder de Cx30 promotor13 en een ondoordringbare fluorescerende verslaggever zorgt voor een specifieke recombinatie van leptomeningeal cellen zonder etikettering van de naburige Cx30-uitdrukkende oppervlak en parenchymale astrocyten in de cortex (Figuur 1). Om toegang te krijgen tot de cisterna magna, wordt het verdoofde dier geplaatst met zijn lichaam en zijn ho...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hier geschetste protocol presenteert een eenvoudige en reproduceerbare procedure om leptomeningealcellen te labelen voor het in kaart brengen van het lot. We gebruiken intracisternalinjectie van endoxifen, een actieve metaboliet van Tamoxifen, om expressie van tdTomato fluorescerende reporter in Cx30-CreER te induceren; R26R-tdTomato muizen12,13.
In vergelijking met andere protocollen die worden gebruikt voor het verkrijgen van toe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Zweedse Onderzoeksraad, de Swedish Cancer Society, de Zweedse Stichting voor Strategisch Onderzoek, Knut en Alice Wallenbergs Stiftelse en het Strategic Research Programme in Stem Cells and Regenerative Medicine van Karolinska Institutet (StratRegen).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Compleet met verdamper, kamer en slang die aansluit op kamer en muis kop houder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commerciële naam Rymadil |
| Cyanoacrylate lijm | Carl Roth | 0258.1 | Gebruik zijde 5-0 hechtingen, als alternatief |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton spuit (30 G geslepen naald) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Muis kop houder | Narishige International | SGM-4 | Met mondstuk voor inhalatie anesthetica. Alternatief, gebruik een stereotactische frame |
| Schaar | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Steriele absorptiespijkers | Fine Science Tools | 18105-01 | Steriele wattenstaafjes zijn ook een goede optie |
| Chirurgisch scheider | World Precision Instrument | 501897 | |
| Pincet | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
Referenties
- Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
- Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions. Frontiers in Neuroscience. 9, 16(2015).
- Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS. Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).
- Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation. Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139 (3), 597-609 (2009).
- Bifari, F., et al. Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex. Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).
- De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins? FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
- Ramos, M., et al. Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function. Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
- Slezak, M., et al. Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells. Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).
- Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges. Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726(2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
