Detectie van eiwit s-acylation met behulp van Acyl-Hars Assisted Capture

Samenvatting

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) is een zeer gevoelige, betrouwbare en gemakkelijk uit te voeren methode om omkeerbare lipidemodificatie van cysteïneresiduen (S-acylation) in een verscheidenheid van biologische monsters op te sporen.

Samenvatting

Eiwit S-acylation, ook wel S-palmitoylation genoemd, is een omkeerbare posttranslationele modificatie van cysteïneresten met lange-keten vetzuren via een labiele thioesterbinding. S-acylation, die in opkomst is als een wijdverbreid regelgevend mechanisme, kan bijna alle aspecten van de biologische activiteit van eiwitten moduleren, van complexe vorming tot eiwithandel en eiwitstabiliteit. De recente vooruitgang in het begrijpen van de biologische functie van eiwit S-acylation werd grotendeels bereikt door de ontwikkeling van nieuwe biochemische instrumenten waardoor robuuste en gevoelige detectie van eiwit S-acylation in een verscheidenheid van biologische monsters. Hier beschrijven we acyl hars-ondersteunde vangst (Acyl-RAC), een recent ontwikkelde methode gebaseerd op selectieve vangst van endogene S-acylated eiwitten door thiol-reactieve Sepharose kralen. In vergelijking met bestaande benaderingen vereist Acyl-RAC minder stappen en kan het betrouwbaardere resultaten opleveren in combinatie met massaspectrometrie voor de identificatie van nieuwe S-acylation-doelen. Een belangrijke beperking in deze techniek is het gebrek aan vermogen om onderscheid te maken tussen vetzuursoorten die via dezelfde thioesterbinding aan cysteïnes zijn verbonden.

Inleiding

S-acylation is een omkeerbare posttranslationele modificatie waarbij een vetacylketen wordt toegedeeld aan een intern cysteïneresidu op een doeleiwit via een labiele thioesterbinding¹. Het werd voor het eerst gemeld als een wijziging van eiwitten met palmitaat, een verzadigd 16-koolstofvetzuur², en daarom wordt deze wijziging vaak aangeduid als S-palmitoylation. Naast palmitaat kunnen eiwitten omkeerbaar worden gewijzigd door een verscheidenheid aan langere en kortere verzadigde (myristaat en stearate), enkelvoudig onverzadigd (oleaat) en meervoudig onverzadigd (arachidonaat en eicosapentanoaat) vetzuren^3,4,5,6,7. In eukaryotische cellen wordt S-acylation gekatalyseerd door een familie van enzymen die bekend staan als DHHC-eiwitacyltransferases en de omgekeerde reactie van cysteinedeacylation wordt gekatalyseerd door eiwitthioesterases, waarvan de meeste nog steeds^{raadselachtig}8 blijven.

De laaitbaarheid van de thioesterbinding maakt deze lipidemodificatie omkeerbaar, waardoor het eiwitclustering, plasmamembraanlokalisatie, intracellulaire handel, eiwit-eiwitinteracties en eiwitstabiliteit⁹,^10kandynamisch reguleren. Bijgevolg is S-acylation gekoppeld aan verschillende aandoeningen, waaronder de ziekte van Huntington, de ziekte van Alzheimer en verschillende vormen van kanker (prostaat, maag, blaas, long, colorectale), die de ontwikkeling van betrouwbare methoden om deze post-translationele eiwitmodificatie te detecteren^{vereist 11}.

Metabolische etikettering met radioactief ([³H], [¹⁴C] of [¹²⁵I]) palmitaat was een van de eerste benaderingen ontwikkeld om testeiwit S-acylation^12,13,14. Echter, radiolabeling-gebaseerde methoden presenteren gezondheidsproblemen, zijn niet erg gevoelig, tijdrovend, en alleen detecteren lipidatie van zeer overvloedige eiwitten¹⁵. Een sneller en niet-radioactief alternatief voor radiolabeling is metabolische etikettering met bioorthogonale vetzuursondes, die routinematig wordt gebruikt om de dynamiek van eiwit S-acylation¹⁶te assay. Bij deze methode wordt een vetzuur met een chemische reporter (alkyne of azidegroep) door een eiwit acyltransferase in het S-acylated eiwit verwerkt. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition reactie (klik chemie) kan vervolgens worden gebruikt om een gefunctionaliseerde groep, zoals een fluoroftaan of biotine, hechten aan het geïntegreerde vetzuur waardoor detectie van de S-acylated eiwit^17,18,19.

Acyl-biotine uitwisseling (ABE) is een van de veel gebruikte biochemische methoden voor het vangen en identificeren van S-acylated eiwitten die een aantal van de tekortkomingen van metabole etikettering omzeilt, zoals ongeschiktheid voor weefselmonsters¹⁵. Deze methode kan worden toegepast voor de analyse van S-acylation in een breed scala van biologische monsters, waaronder weefsels en diepgevroren celmonsters^20,21. Deze methode is gebaseerd op selectieve decolleté van de thioesterbinding tussen de acylgroep en het cysteïneresidu door neutrale hydroxylamine. De bevrijde thiolgroepen worden vervolgens gevangen met een thiol-reactief biotinederivaat. De gegenereerde bioatlateeiwitten worden vervolgens affiniteitgezuiverd met streptavidinaaga en geanalyseerd door immunoblotting.

Een alternatieve aanpak genoemd acyl-hars bijgestaan vangen (Acyl-RAC) werd later geïntroduceerd om de biotinylation stap te vervangen door directe vervoeging van vrije cysteïnedoor een thiol-reactieve hars^22,23. Deze methode heeft minder stappen in vergelijking met ABE en kan op dezelfde manier worden gebruikt om eiwit S-acylation te detecteren in een breed scala van monsters¹.

Acyl-RAC bestaat uit 4 hoofdstappen (figuur 1),
1. Blokkering van vrije thiolgroepen;
2. Selectieve splitsing van de cysteïne-acylthioesterbinding met neutrale hydroxylamine (HAM) om cysteïnethiolgroepen bloot te leggen;
3. Het vastleggen van de lipide cysteïnen met een thiol-reactieve hars;
4. Selectieve verrijking van de S-acylated eiwitten na elutie met reducerende buffer.

De gevangen eiwitten kunnen vervolgens worden geanalyseerd door immunoblotting of onderworpen aan massaspectrometrie (MS) gebaseerde proteomics om het S-acylated proteome te beoordelen in een gevarieerd scala van soorten en weefsels^22,24,25. Individuele S-acylation sites kunnen ook worden geïdentificeerd door trypsine vertering van de gevangen eiwitten en analyse van de resulterende peptiden door LC-MS/MS²². Hier laten we zien hoe acyl-RAC kan worden gebruikt voor gelijktijdige detectie van S-acylation van meerdere eiwitten in zowel een cellijn als een weefselmonster.

Protocol

Muizen gebruikt in dit protocol werden geëuthanaseerd volgens NIH richtlijnen. Het Comité voor dierenwelzijn van de University of Texas Health Science Center in Houston keurde al het dierenwerk goed.

1. Bereiding van cellysataten

1. Bereid de lysisbuffer voor zoals beschreven in tabel 1. Voeg 0,1 g n-dodecyl β-D-maltoside wasmiddel (DDM) toe en draai om op te lossen tot 10 mL PBS. Voeg 100 μL fosforremmercocktail 2, ML211 (10 μM), PMSF (10 mM) en proteaseremmercocktail (1x) toe en koel de buffer voor gebruik op ijs.
2. Breng de vereiste media met cellen uit de couveuse over in conische buizen van 15 mL of 50 mL en spincellen op 350 x g gedurende 5 min en aangezogen om zich te ontdoen van elk celpuin.
   OPMERKING: We gebruikten 1 x 10⁷ cellen voor elke acyl-RAC reactie die moest worden uitgevoerd.
3. Was de pellet door het opnieuw op te schorten in 5 mL PBS en te spinnen op 350 x g gedurende 5 min.
   OPMERKING: Voer stap 1.3 snel uit om cellyse te voorkomen als gevolg van langdurige incubatie in PBS.
4. Voeg 600 μL lysisbuffer bereid in stap 1.1 toe aan de pellet en lyse door te schudden bij 1500 tpm in een thermische shaker gedurende 30 min bij 4 °C.
5. Duidelijk lysates door centrifugering bij 20.000 x g bij 4 °C gedurende 30 min tot pellet wasmiddel-onoplosbare materialen. Verzamel gerooide lysate in voorgekoelde 1,5 mL microfuge buizen en houd ze op ijs.
6. Voer een Bradford / BCA test uit om de eiwitconcentratie te schatten. Het is van cruciaal belang om dezelfde hoeveelheid eiwit te garanderen in verschillende monsters voorafgaand aan het uitvoeren van het experiment. Wij raden aan om minstens 500 μg eiwit per reactie te gebruiken.
   OPMERKING: In de beschreven experimenten gebruikten we gekweekte (Jurkat) cellen en primaire splenocyten uit muizenweefsel. De hierboven beschreven lysismethode kan ook worden gebruikt voor andere celtypen. De gemiddelde eiwitconcentratie voor bovengenoemde celtypen is ongeveer 500 μg per 1 x 10⁷ cellen. Jurkatcellen werden gehandhaafd in RPMI-1640 medium dat is aangepast tot 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvaat, 4.500 mg/L glucose en 1.500 mg/L natriumbicarbonaat aangevuld met 10% FBS bij 37 °C met 5% CO₂. We gebruikten 1 x 10⁷ Jurkat cellen per reactie. Primaire splenocyten werden geïsoleerd van muis miltweefsel zoals beschreven²⁶. Kortom, miltweefsel werd gemacereerd op ijs, gevolgd door lyse van erythrocyten in hypotonische oplossing en scheiding van de lymfocyten door centrifugatie. We gebruikten 1 x 10⁷ primaire cellen per reactie.

2. Acyl-RAC: Blokkeren van vrije thiolgroepen

LET OP: Alle volgende stappen kunnen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT).

1. Breng lysate in een verse 1,5 mL microfuge buis en voer chloroform-methanol (CM) neerslag zoals hieronder beschreven.
   1. Voeg methanol (MeOH) en chloroform (CHCl₃₎toe aan het lysaat bij een eindverhouding van lysaat: MeOH: CHCl₃ van 2:2:1 en schud krachtig om een homogene suspensie te creëren.
   2. Draai op 10.000 x g gedurende 5 min om een pellet ("pannenkoek") te vormen in de interfase tussen waterige en organische fasen.
   3. Kantel de buis en zuig zoveel mogelijk oplosmiddel en een naald of een gellaadtip.
   4. Laat de eiwitpellet een paar minuten drogen en was het voorzichtig door 600 μL MeOH toe te voegen en voorzichtig te mengen om te voorkomen dat de pellet wordt afgebroken
   5. Verwijder voorzichtig de resterende MeOH en droog de eiwitpellet op een benchtop gedurende ongeveer 5 minuten.
   6. (Optioneel) Voer een extra centrifugatiestap uit om een afgebroken pellet na de MeOH-wasbeurt te laten lopen om verlies van monster te voorkomen.
      OPMERKING: Het experiment kan worden gestopt na de CM-neerslagstap. Zodra de pellet is verkregen, kan deze tot een week in 500 μL MeOH worden opgeslagen in -20 °C.
      1. Los de eiwitpellet op in 200 μL 2SHB-buffer door bij 42 °C/1500 tpm in een thermische shaker te draaien totdat de pellet is opgelost.
   7. (Optioneel) Incubeer voor een extra 5-10 min in een sonicerend waterbad om de pellet op te lossen.
      LET OP: De lengte van de sonicatie varieert afhankelijk van de oplosbaarheid van het materiaal. Langdurige sonicatie kan echter eiwitafbraak veroorzaken.
2. Bereid 0,2% methylmethaanthiosulfonaat (MMTS) (v/v) voor in 2SHB door 2 μL MMTS toe te voegen aan 998 μL 2SHB-buffer.
   LET OP: Gebruik vers bereide 0,2% MMTS voor elk experiment.
3. Voeg 200 μL van 0,2% MMTS in 2SHB toe aan elke buis tot een uiteindelijke concentratie van 0,1% MMTS. Incubeer gedurende 15 min bij 42 °C met schudden bij 1500 tpm in een thermische shaker.

3. Acyl-RAC: Hydroxylamine (HAM) decolleté en vangst van S-acylated eiwitten

1. Herhaal 3-4x CM neerslag zoals hierboven beschreven om MMTS te verwijderen. Verwijdering van MMTS kan worden geschat door het ontbreken van verschillende geur van MMTS. Los na elke neerslag de pellet op in 100 μL 2SHB-buffer door bij 42 °C/1500 tpm in een thermische shaker te draaien totdat de pellet oplost en verdun dan met 300 μL buffer A.
2. Los na de laatste neerslag monsters op in 200 μL 2SHB-buffer zoals hierboven beschreven en verdun met 240 μL buffer A.
3. In het geval van het vergelijken van veranderingen in S-acylation in reactie op verschillende behandelingsvoorwaarden, meet u de eiwitconcentratie opnieuw en gaat u verder met een gelijke hoeveelheid eiwit voor elke aandoening.
4. Bewaar 40 μL van elk monster als invoerregeling.
5. Splits monsters in twee gelijke delen van 200 μL en markeer buizen als "+ HAM" en "- HAM". Voeg 50 μL vers bereide neutrale 2 M HAM (pH 7,0-7,5) toe aan een eindconcentratie van 400 mM aan een van de buizen (+ HAM) en 50 μL neutrale 2 M NaCl aan de tweede buis (- HAM), die zal worden gebruikt als een negatieve controle. Ga over tot toevoeging van thiopropyl-Sepharose (TS) kralen.
   OPMERKING: Het experiment kan worden gestopt na een van de CM-neerslagstappen. Zodra de pellet is verkregen, kan deze tot een week in 500 μL MeOH worden opgeslagen in -20 °C. Neutrale pH van 2 M HAM zorgt voor de selectiviteit van de acyl-cysteïne thioester binding en moet zorgvuldig worden aangepast. Bij het hanteren van monsters in de 2SHB-buffer moet worden opgelet om verlies van monster als gevolg van overmatig schuimvorming te voorkomen. Alle volgende stappen zijn identiek voor - HAM en + HAM monsters.
6. Voeg 30 μL TS-kraaldrijfmest toe aan elke buis en draai de buizen 1-2 uur bij RT.
7. Was de TS kralen 4x met 1% SDS in Buffer A om resterende HAM te verwijderen.
   1. Draai voorzichtig alle kraalmonsters met behulp van een microfuge voor 1 min en voorzichtig aanzuigen de supernatant.
   2. Hang de kralen opnieuw op in 500 μL of 1% SDS in Buffer A.
   3. Herhaal stap 3.7.1–3.7.2 driemaal.
      LET OP: Geactiveerde thiopropyl-Sepharose (TS) wordt gevriesdroogd in aanwezigheid van additieven die vóór de koppeling bij neutrale pH moeten worden weggespoeld. Gedestilleerd water wordt aanbevolen voor zwelling en wassen. Weeg 0,1 g kralen en resuspend in 1 mL van gedestilleerd water en laat het zwellen tijdens het draaien gedurende 30 min-1 uur bij RT. Was kralen 1x met buffer A en bereid een drijfmest met buffer A, in een verhouding van 50% geregeld medium tot 50% buffer. Gezwollen TS kan worden opgeslagen bij neutrale pH in aanwezigheid van 20% ethanol bij 4 °C tot een week. Gebruik natriumazide niet als bacteriostatisch middel, omdat azide-ionen reageren met de 2-pyridyldisulfidegroepen. Voor een hogere efficiëntie, bereiden verse kralen. Tijdens het hanteren van de kralen kan de punt van een P200 pipettip iets worden gesneden om schade te voorkomen.
      LET OP: Het experiment kan worden gestopt in elk stadium na CM neerslag. De pellet mag tot een week in 500 μL MeOH worden opgeslagen in -20 °C.

4. Elutie en detectie van S-acylated eiwitten

1. Na de laatste wasbeurt, voorzichtig spin de kralen zoals hierboven beschreven en aanzuigen zoveel supernatant mogelijk zonder verstoring van de kralen.
2. Herstel de eiwitten uit kralen met 4x SDS monsterbuffer met DTT.
   1. Voeg 50 μL 4x SDS monsterbuffer toe aan de kralen en incubeer bij 80 °C, 1500 tpm gedurende 15 min in een thermische shaker. Laat de buizen afkoelen.
   2. Centrifugeer de kralen op 5.000 x g gedurende 3 min om de kralen volledig te pelleten en de geëlute eiwitten over te brengen naar een verse buis van 1,5 mL met behulp van een gellaadtip.
3. Voer SDS-PAGE uit en analyseer S-acylation van het eiwit(en) van belang door westerse blotting.

Resultaten

Naar aanleiding van het hierboven beschreven protocol, gebruikten we eerst acyl-RAC om tegelijkertijd s-acylation van verschillende eiwitten in Jurkat cellen te detecteren, een vereeuwigde T-cellijn oorspronkelijk afgeleid van het perifere bloed van een T-cel leukemie patiënt²⁷. Regulerende T-celeiwitten die eerder als S-acylated⁹,^28,,29 werden geïdentificeerd om het nut van deze methode aan te tonen. Zoa...

Discussie

Hier hebben we met succes gebruik gemaakt van de acyl-RAC test om S-acylation van geselecteerde eiwitten te detecteren in zowel gekweekte menselijke cellen en primaire cellen afgeleid van muisweefsel. Deze methode is eenvoudig, gevoelig, en kan gemakkelijk worden uitgevoerd met minimale apparatuur eisen met behulp van standaard biochemie technieken. Deze methode is aangetoond dat het met succes nieuwe S-acylated eiwitten te identificeren, zoals de β-subeenheid van het eiwit translocating systeem (Sec61b),Sriboso...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail tablets	Sigma	11836170001
Eppendorf Centrifuge 5424	Eppendorf	22620444
Hydroxylamine (HAM)	Sigma	159417
Methyl methanethiosulfonate (MMTS)	Sigma	64306
Mini tube rotator	LabForce
ML211	Cayman	17630
Multi-Therm Cool-Heat-Shake	Benchmark Scientific	H5000-HC
n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM)	Sigma	D641
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5726
Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)	Sigma	T8387
Ultrasonics Quantrex Sonicator	L & R