Dit protocol beschrijft een effectieve in situ hybridisatie benadering om de mRNA expressie niveaus en ruimtelijke patronen van doelgenen in Sipunculus nudus coelomic vloeistof te detecteren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In situ Hybridisatie voor Sipunculus nudus Coelomic Fluid
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In situ hybridisatie (ISH) is een zeer informatieve techniek om cellulaire distributiepatronen van specifieke genen (bijvoorbeeld mRNA en ncRNA) in weefsels te presenteren. De sipunculid worm Sipunculus nudus is een cruciale visbestanden omdat het hoge voedingswaarden en medicinale waarden heeft. Momenteel staat het onderzoek naar de moleculaire biologie van Sipunculus nudus nog in de kinderschoenen. Het doel van dit artikel is het ontwikkelen van een gevoelige methode voor het lokaliseren van specifieke mRNA in Sipunculus nudus coelomic vloeistof. Het protocol omvat gedetailleerde stappen van ISH, met inbegrip van digoxigenin-gelabeld antisense en zin riboprobe voorbereiding, coelomic vloeistof collectie en sectie voorbereiding, specifieke riboprobe hybridisatie, antilichaam incubatie, kleuring en post-coloration behandelingen. De representatieve resultaten verkregen uit een succesvol experiment met behulp van deze methode worden aangetoond. Het protocol moet ook van toepassing zijn op andere Sipuncula-soorten.
Inleiding
ISH, met behulp van een gelabelde nucleïnezuursonde om de specifieke DNA- of RNA-sequentie van belang te detecteren, is een nuttige methode om het ruimtelijke expressiepatroon van doelgenen in morfologisch bewaarde weefsels te beschrijven1,2,3. Normaal gesproken wordt de doelsequentie gegenereerd door polymerase kettingreactie (PCR) en vervolgens gebruikt als sjabloon om de antisense/sense RNA-sonde te synthetiseren met digoxigenin uridine-5'-trifosfaat. Monsters worden vastgemaakt en permeabilized voor incubatie met riboprobe. Na het afwassen van de overtollige sonde, hybrid....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De dierprocedure werd goedgekeurd door het Comité voor dierenwelzijn en welzijn van de Huaqiao-universiteit.
1. Voorbereiding van de ribosonde
- Primer ontwerp
- Open het programma Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Kopieer de dmrt1-reeks (GenBank: MK182259) naar het sequentievenster.
- Stel de primerlengte (23-25 bp), smelttemperatuur (55-60 °C) en g/c-gehalte (40-60%) in. Klik op Primers kiezen.
OPMERKING: De minimale grootte die nodig is voor de RNA-sonde is ongeveer 500 bp. Langere sondes hebben normaal gesproken een hogere specificiteit. - Voeg de T7 RNA ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een samenvatting van de stappen die betrokken zijn bij ISH wordt geïllustreerd in figuur 1. Antisense en overeenkomstige zin riboprobes voor dmrt1 werden gesynthetiseerd uit PCR-producten versterkt uit de coelomic vloeistof cDNO's. De authenticiteit van de PCR-producten werd geverifieerd door middel van directe sequencing. Riboprobes werden gesynthetiseerd met behulp van T7 RNA polymerases volgens de protocollen van de fabrikant en een vorig rapport4 met enke.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Eerdere studies toonden aan dat ISH geschikt is voor het opsporen van meerdere doel-RNAs16,17,18. In dit protocol beschreven we een ISH-methode met hoge resolutie om het mRNA in coelomic vloeistof te detecteren en de geoptimaliseerde hybridisatieomstandigheden in Sipunculus nudus te benadrukken. De voor de hand liggende signalen van dmrt1 die we waarnamen toonden de succesvolle toepassing van dit protocol bij d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het Young Scientists Fund van de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31801034), de Natural Science Foundation van de provincie Fujian, China (2016J01161), de Wetenschappelijke Onderzoeksfondsen van de Huaqiao University (15BS306) en het Innovatieve Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek van de Huaqiao University.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkaline phosphatase color development kit | Beyotime | C3206 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Citric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 5949-29-1 | |
| Citric acid trisodium | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 4/3/6132 | |
| Coverslips | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionized formamide | Amresco | 12/7/1975 | |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma | D5758 | Schadelijk |
| Digoxigenin (DIG) RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-free | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Electrophoresis gel imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 64-17-5 | |
| Gel extraction kits | Omega | D2500 | |
| Gel-electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 56-81-5 | |
| Glycine | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 67-56-1 | Schadelijk |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 1310-73-2 | Corrosief |
| Paraffin film | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyde, PFA | Sigma | 158127 | Schadelijk |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-lysine treated microscope slides | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | SRE0005 | |
| RNase free water | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Sheep serum | Beyotime | C0265 | |
| Slide staining jar | Beyotime | FG010 | |
| Slide storage box | Beyotime | FBX011 | |
| Small autoclaved scissors | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spectrophotometers | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA polymerases | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Water bath | Zhengzhou Great Wall Scientific Industrial | HH-S2 |
Referenties
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
