Method Article

Gelijktijdige kwantificering van geselecteerde kynurenines geanalyseerd door vloeibare chromatografie-massaspectrometrie in medium verzameld uit kankercelculturen

DOI:

10.3791/61031

⸱

May 9th, 2020

 ,  , 
1Laboratory of Separation and Spectroscopic Method Applications, Centre for Interdisciplinary Research, The John Paul II Catholic University of Lublin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreven is een protocol voor de bepaling van vier verschillende tryptofaanmetabolieten gegenereerd in de kynurenine route (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic zuur, 3-hydroxyanthranilic zuur) in het medium verzameld uit kankercelculturen geanalyseerd door vloeibare chromatografie in combinatie met een enkele viervoudige massaspectrometrie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kynurenine route en de tryptofaan katabolieten genaamd kynurenines hebben meer aandacht gekregen voor hun betrokkenheid bij immuunregulatie en kankerbiologie. Een in vitro celkweektest wordt vaak gebruikt om te leren over de bijdrage van verschillende tryptofaankabolieten in een ziektemechanisme en voor het testen van therapeutische strategieën. Celkweekmedium dat rijk is aan uitgescheiden metabolieten en signaalmoleculen weerspiegelt de status van het tryptofaanmetabolisme en andere cellulaire gebeurtenissen. Nieuwe protocollen voor de betrouwbare kwantificering van meerdere kynurenines in het complexe celkweekmedium zijn gewenst om een betrouwbare en snelle analyse van meerdere monsters mogelijk te maken. Dit kan worden bereikt met vloeibare chromatografie in combinatie met massaspectrometrie. Deze krachtige techniek wordt in veel klinische en onderzoekslaboratoria gebruikt voor de kwantificering van metabolieten en kan worden gebruikt voor het meten van kynurenines.

Hier wordt het gebruik van vloeibare chromatografie in combinatie met enkele viervoudige massaspectrometrie (LC-SQ) gepresenteerd voor de gelijktijdige bepaling van vier kynurenines, d.w.z. kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic en xanthurenic acid in het medium dat wordt verzameld uit in vitro gekweekte kankercellen. SQ-detector is eenvoudig te gebruiken en goedkoper in vergelijking met andere massaspectrometers. In de SQ-MS-analyse worden meerdere ionen uit het monster gegenereerd en gescheiden op basis van hun specifieke massa-tot-ladingsverhouding(m/z),gevolgd door de detectie met behulp van een Sim-modus (Single Ion Monitoring).

Dit document vestigt de aandacht op de voordelen van de gerapporteerde methode en geeft enkele zwakke punten aan. Het is gericht op kritieke elementen van LC-SQ-analyse, waaronder monstervoorbereiding, samen met chromatografie en massaspectrometrieanalyse. Ook de kwaliteitscontrole, methodekalibratieomstandigheden en matrixeffectproblemen komen aan bod. We beschreven een eenvoudige toepassing van 3-nitrotyrosine als één analoge standaard voor alle doelanalyten. Zoals bevestigd door experimenten met menselijke eierstok- en borstkankercellen, genereert de voorgestelde LC-SQ-methode betrouwbare resultaten en kan deze verder worden toegepast op andere in vitro cellulaire modellen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kynurenine pathway (KP) is de belangrijkste route van tryptofaan (Trp) katabolisme in menselijke cellen. Indoolamine-2,3-dioxygenase (IDO-1) in extrahepatische cellen is het eerste en beperkende enzym van KP en zet Trp om in N-formylkynurenine1. Verdere stappen binnen KP genereren andere secundaire metabolieten, namelijk kynurenines die verschillende biologische eigenschappen vertonen. Kynurenine (Kyn) is de eerste stabiele Trp-katabole die toxische eigenschappen vertoont en cellulaire gebeurtenissen reguleert na binding aan de arylkoolwaterstofreceptor (AhR)2. Vervolgens wordt Kyn omgezet in verschillende moleculen, hetzij spontaan, hetzij in de enzymgemedieerde processen, waardoor dergelijke metabolieten zoals 3-hydroxykynurenine (3HKyn), anthranilic acid (AA), 3-hydroxyanthranilic acid (3-HAA), kynurenic acid (Kyna) en xanthurenic acid (XA) worden gegenereerd. Een andere downstream metaboliet, 2-amino-3-carboxymuconzuur-6-semialdehyde (ACMS), ondergaat niet-enzymatische cyclisatie naar chinolienzuur (QA) of picolininezuur (PA)1. Ten slotte wordt QA verder omgezet in nicotinamide-adenine dinucleotide (NAD+)3, de KP-eindpuntmetaboliet die een belangrijke enzymcofactor is. Sommige kynurenines hebben neuroprotectieve eigenschappen zoals Kyna en PA, terwijl de andere, d.w.z. 3HAA en 3HKyn, giftig zijn4. Xanthurenic zuur, dat wordt gevormd uit 3HKyn, presenteert antioxiderende en vasorelaxatie eigenschappen5. XA hoopt zich op in verouderende lenzen en leidt tot apoptose van epitheelcellen6. KP, beschreven in het midden van de 20e eeuw, kreeg meer aandacht toen zijn betrokkenheid bij verschillende aandoeningen werd aangetoond. Verhoogde activiteit van deze metabolische route en accumulatie van sommige kynurenines moduleren de immuunrespons en worden geassocieerd met verschillende pathologische aandoeningen zoals depressie, schizofrenie, encefalopathie, HIV, dementie, amyotrofische laterale sclerose, malaria, Alzheimer, de Ziekte van Huntington en kanker4,7. Sommige veranderingen in het Trp-metabolisme worden waargenomen in tumormicromilieus en kankercellen2,8. Bovendien worden kynurenines beschouwd als veelbelovende ziektemarkers9. In kankeronderzoek worden in vitro celkweekmodellen goed ingeburgerd en veel gebruikt voor preklinische evaluatie van reacties op geneesmiddelen tegen kanker10. Trp-metabolieten worden door cellen uitgescheiden in het kweekmedium en kunnen worden gemeten om de status van de kynurenineroute te beoordelen. Daarom is het nodig om geschikte methoden te ontwikkelen voor de gelijktijdige detectie van zoveel mogelijk KP-metabolieten in een verscheidenheid aan biologische specimens met een eenvoudig, flexibel en betrouwbaar protocol.

In dit artikel beschrijven we een protocol voor de gelijktijdige bepaling van vier kynurenine pathway metabolieten: Kyn, 3HKyn, 3HAA en XA door LC-SQ in een post-culture medium verzameld uit kankercellen. In een moderne analytische benadering heeft vloeibare chromatografie13,14,15,16 de voorkeur voor de gelijktijdige detectie en kwantificering van de individuele tryptofaankabolieten, in tegenstelling tot biochemische niet-specifieke tests met behulp van Ehrlich-reagens11,12. Op dit moment zijn er veel methoden beschikbaar voor kynurenines bepaling in menselijke specimens, voornamelijk gebaseerd op vloeibare chromatografie met ultraviolette of fluorescentiedetectoren13,17,18,19. Vloeibare chromatografie in combinatie met een massaspectrometriedetector (LC-MS) lijkt meer geschikt voor dit type analyse, vanwege hun hogere gevoeligheid (lagere detectiegrenzen), selectiviteit en herhaalbaarheid.

Trp-metabolieten zijn al bepaald in menselijk serum, plasma en urine13,20,21,22,23, maar de methoden voor andere biologische specimens, zoals celkweekmedium, zijn ook gewenst. Voorheen werd LC-MS gebruikt voor Trp-afgeleide verbindingen in een medium dat werd verzameld na cultivering van menselijke glioomcellen, monocyten, dendritische cellen of astrocyten behandeld met interferon gamma (IFN-γ)24,25,26. Momenteel is er behoefte aan nieuwe gevalideerde protocollen die een beoordeling van verschillende metabolieten in verschillende kweekmedia, cellen en behandelingen die in kankermodellen worden gebruikt, mogelijk kunnen maken.

Het doel van de ontwikkelde methode is om (binnen één analytische run) vier belangrijke kynurenines te kwantificeren die kunnen wijzen op afwijkingen in KP. Hier worden kritieke stappen gepresenteerd van ons onlangs gepubliceerde protocol voor kwantitatieve LC-SQ-analyse van geselecteerde betekenisvolle kynurenines met behulp van één interne standaard (3-nitrotyrosine, 3NT) in het medium verzameld uit in vitro gekweekte menselijke kankercellen27. Voor zover wij weten, is het het eerste LC-SQ-protocol voor gelijktijdige kwantificering van 3HKyn, 3HAA, Kyn en XA in een kweekmedium verkregen uit de in vitro gekweekte cellen. Bij sommige wijzigingen kan de methode verder worden toegepast om de veranderingen in het Trp-metabolisme in een breder scala aan celkweekmodellen te bestuderen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van standaard 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standaard voorraadoplossingen

  1. Weeg de reagentia in een flacon met de hoogste nauwkeurigheid (0,3 mg per stuk). Voor een betere nauwkeurigheid schaalt u de reagentia op en past u het volume van het oplosmiddel aan volgens stap 1.2.
  2. Los de reagentia op in 300 μL van het oplosmiddel om een voorraadoplossing van 1 g/L te verkrijgen. Los 3NT op in 1% (v/v) mierenzuur (FA) in water; Kyn, 3HAA en XA in dimethylsulfoxide (DMSO); 3HKyn in water verzuurd tot pH 2,5 met zoutzuur (HCl).
    LET OP: 3HAA irriteert ogen, neus, keel en longen. Het is schadelijk bij inademing, in contact met de huid en bij inslikken. Draag de juiste bescherming, d.w.z. handschoenen en masker.
  3. Sluit de flacon goed en plaats deze gedurende 1 minuut in een ultrasoon bad om de ontbinding te versnellen.
    OPMERKING: Bewaar de voorraadoplossingen bij -20 °C en minimaliseer bevriezing/ontdooien (maximaal 3 cycli) vanwege de instabiliteit van de voorraadoplossingen.

2. Bereiding van houtskoolbehandeld kweekmedium

  1. Weeg in een buis 280 mg actieve kool en voeg 5 ml van het vloeibare medium toe dat is bereid om de cellen van belang te cultiveren.
  2. Schud de buis met het medium en houtskool op een see saw rocker gedurende 2 uur, bij kamertemperatuur (stel snelheid in op 50 oscillaties/min). Centrifugeer vervolgens de buizen gedurende 15 minuten op 6000 x g.
  3. Verwijder de buis van de centrifuge en verzamel voorzichtig het supernatant zonder het sediment te verstoren. Herhaal indien nodig centrifugatie om alle houtskoolresten te verwijderen.
  4. Filter het supernatant met een spuitfilter van 0,45 μm.
  5. Zorg ervoor dat het voorbehandelde kweekmedium van houtskool geen kynureninessporen heeft door een proefmonster uit te voeren op LC-MS zoals beschreven in stap 6.3.2. Herhaal anders stap 2.1-2.4.
    OPMERKING: Als het volledige kweekmedium in eerste instantie geen kynurenines bevat, kan zuiveringsstap met houtskool worden weggelaten. Bereid in dit geval kalibratienormen en kwaliteitscontrolemonsters voor met behulp van het volledige medium dat gewoonlijk is voorbereid voor celculuring.
  6. Bewaar het bereide medium op 4 °C tot de analyse.

3. Het maken van de kalibratieoplossingen en kalibratiecurven

  1. Spike het houtskool voorbehandelde kweekmedium met 0,75 μL van 0,1 g/L 3NT-oplossing en voeg vier normen (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) toe aan ten minste zes verschillende concentraties om kalibratiebereiken te dekken. Houd het uiteindelijke volume van elk monster op 150 μL. Vortex goed. Gebruik 1,5 ml centrifugebuizen voor monstervoorbereiding.
    OPMERKING: Voorgestelde kalibratiepunten voor 3HKyn: 0,018, 0,045, 0,22, 1,12, 2,23, 4,46 μmol/L; voor Kyn: 0,0096, 0,048, 0,24, 1,20, 2,40, 3,84 μmol/L; voor 3HAA: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 μmol/L; voor XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 μmol/L.
  2. Voeg 150 μL koude methanol (bewaard bij -20 °C) met 1% (v/v) mierenzuur toe aan elke buis voor monsterdeproteïnisatie. Sluit de buizen en vortex goed.
  3. Incubeer de monsters bij -20 °C gedurende 40 minuten.
  4. Centrifugeer de monsters bij 14.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Verwijder de buizen van de centrifuge. Verzamel supernatanten in de nieuwe buizen. Verstoort het sediment niet.
  5. Breng 270 μL van het supernatant over in de glazen flacon met behulp van een automatische pipet. Doe de flacons in de verdamper en verdamp zachtjes tot ze droog zijn. Gebruik het juiste programma voor water/methanolfracties om vluchtige componenten te verdampen. Breng geen temperatuur aan hoger dan 40 °C en vermijd overdrogen.
    OPMERKING: Glazen flacons met platte bodem, d.w.z. chromatografische flacons vergemakkelijken een snellere verdamping en hogere terugwinning in vergelijking met plastic conische buizen.
  6. Controleer na 30 minuten de verdampingsstatus. Ga indien nodig verder met verdampen (voeg bijvoorbeeld 10 minuten extra toe). Vermijd overdrogen.
  7. Verwijder de flacons van de verdamper. Reconstitueren elk monster in 60 μL van 0,1% (v/v) mierenzuur in water. Voeg het oplosmiddel toe aan de flacon die het restmateriaal bevat. Sluit de flacons en vortex-put goed.
  8. Breng het monster over in een tube van 1,5 ml en draai gedurende 15 minuten bij 4 °C op 14.000 x g om het neergeslagen eiwit te scheiden.
  9. Zonder de eiwitkorrel te storen, breng de supernatanten over in chromatografische flacons met conische glazen inzetstukken met een automatische pipet. Sluit de flacons goed af.
  10. Controleer op de aanwezigheid van luchtbellen in de injectieflacon en verwijder ze indien nodig (bijv. door vortexing).
  11. Breng de chromatografische flacons met monsters over in LC autosampler. Noteer de positie van monsters die in een autosamplerlade zijn geplaatst.

4. Voorbereiding van kwaliteitscontrole (QC) monsters

  1. Spike het voorbehandelde kweekmedium van houtskool (bereid in een centrifugaalbuis van 1,5 ml) met 0,75 μL van 0,1 g/L 3NT-oplossing en normen van vier kynurenines (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) in één concentratie geselecteerd uit het lineaire bereik van de kalibratiecurven. Houd het uiteindelijke volume van het monster op 150 μL.
    OPMERKING: Bereid indien van toepassing verschillende QC-monsters voor in verschillende concentraties die onder het lineaire bereik van de kalibratiecurve vallen.
  2. Volg het protocol beschreven in sectie 3 (stappen 3.2-3.11).

5. Instellen van het LC-MS systeem

  1. Bereid de mobiele fase-oplosmiddelen voor: Oplosmiddel A: 20 mmol/L ammoniumformaat in ultrapaanwater (pH 4.3 aangepast met mierenzuur); Oplosmiddel B: 100% acetonitril.
    OPMERKING: Gebruik alleen borosilicaatglasflessen. Spoel flessen af met ultrapure water voordat u het bijvult. Gebruik geen flessen die met reinigingsmiddelen zijn gereinigd.
    LET OP: Acetonitrile veroorzaakt ernstige gezondheidseffecten of overlijden. Het wordt gemakkelijk aangestoken door hitte. Acetonitril vloeistof en damp kunnen ogen, neus, keel en longen irriteren.
    1. Bereid 5 mol/L bouillonoplossing van ammoniumformaat door een kristallijn reagens (15,77 g) in 50 ml ultrapure water in een glazen fles op te lossen. Roer tot alle resten oplossen. Filtreer door het membraan van 0,45 μm om restafval te verwijderen (bijv. met behulp van een nylon spuitfilter). Bewaar de voorraadoplossing op 4 °C.
    2. Bereid oplosmiddel A door 4 ml van 5 mol/L ammoniumformaat in water toe te voegen aan 980 ml ultrapure water in een amberkleurige glazen fles en roer goed. Dompel een roerstaaf onder en leg de fles met het oplosmiddel op een magneetroerder. Dompel een pH-elektrode onder in de oplossing en controleer de pH onder roeren. Voeg mierenzuurvoorraadoplossing toe (98%-100%) dropwise met behulp van een automatische pipet met 0,2 ml tip om pH 4.3 te verkrijgen, stel het volume in tot 1 L met ultrapure water en roer goed.
      OPMERKING: Bereid de oplosmiddelen minstens één keer per week voor om microbiële groei te voorkomen.
      LET OP: Mierenzuur (FA) is giftig bij inademing en veroorzaakt brandwonden aan de huid en oogbeschadiging. Werk onder de afzuigkap; draag beschermende handschoenen en jas.
    3. Filter alle oplossingen door het membraan van 0,22 μm (bijv. nylon spuitfilter) om eventuele restafval te verwijderen. Gebruik optioneel de oplosmiddelinlaatfilters voor LC-oplosmiddelreservoirs om het systeem te beschermen tegen binnenkomende deeltjes.
  2. Start LC-MS-besturings- en gegevensverwervingssoftware.
  3. Zuiver het LC-systeem met de mobiele fase om bellen te verwijderen en alle oplosmiddelkanalen te primen.
  4. Ensemble een beschermkolom om de analytische kolom te beschermen tegen verstopping.
  5. Spoel de beschermkap en analytische kolom (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm) gedurende ongeveer 30 minuten door met 100% acetonitril en vervolgens met 100% oplosmiddel A totdat een stabiele druk in de kolom wordt waargenomen. Bedien de systeemprestaties met behulp van de besturingssoftware.
  6. Stel de juiste LC-parameters in de software voor gegevensverwerving in.
    1. Stel het gradiëntprogramma in: 0-8 min oplosmiddel B 0%; 8-17 min oplosmiddel B 0-2%; 17-20 min oplosmiddel B 2%; 20-32 min oplosmiddel B 10-30%; 32-45 min oplosmiddel B 0%.
    2. Stel het mobiele fasedebiet in op 0,15 ml/min, totale analyseduur gedurende 45 min, kolomtemperatuur op +40 °C en injectievolume op 10 μL.
  7. Stel de aanschafparameters van de massaspectrometriedetector in.
    1. Ionisatieparameters toepassen: enkelvoudige ionenbewaking (SIM), positieve ionisatie, verneveldruk van 50 psi, +350 °C drooggastemperatuur, drooggasstroom van 12 L/min en 5500 V capillaire spanning.
    2. Selecteer de analytbewakingsionen: voor 3HKyn m/z 225.0 (scanperiode: 2-6 min, fragmentorspanning: 100 V); voor Kyn m/z 209.0 (scanperiode: 6-12 min, fragmentorspanning: 80 V); voor 3HAA m/z 154,0 (scanperiode: 12-18 min, fragmentorspanning: 80 V); voor 3NT m/z 227,0 (scanperiode: 18-23 min, fragmentorspanning: 100 V); voor XA m/z 206.0 (scanperiode: 23-45 min, fragmentorspanning: 100 V).
  8. Maak een werklijst en voer voorbeelden uit op het LC-systeem.
  9. Voer eerst, vóór de analyse van de experimentele monsters, een blanco monster (oplosmiddel A) uit, ten minste in drievoud, gevolgd door één QC-monster.
  10. Open de data-analysesoftware en laad de verkregen resultaten voor het QC-monster.
  11. Controleer de positie van analytpieken op het chromatogram. Wanneer signalen verder gaan dan de verwachte positie, pas dan de tijdpoorten aan voor de juiste analytsignalenverzameling. Zie de softwarehandleiding voor instructies over signaalintegratie.

6. De kalibratiecurve construeren

  1. Voeg in de software voor gegevensverwerving kalibratiestandaarden toe aan de werklijst en voer de standaarden in drievoud uit.
  2. Integreer en meet het piekgebied dat overeenkomt met 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT en XA bij de retentietijd van respectievelijk ongeveer 4,4 min, 10 min, 16 min, 21 min en 30 min.
  3. Maak afzonderlijke kalibratiecurven voor elke metaboliet met behulp van een spreadsheetprogramma.
    1. Als u het kalibratiegrafiek wilt maken, plot u de waarde voor een verhouding van het analytenpiekgebied over het 3NT-piekgebied versus de concentratie van de analyt.
    2. Analyseer het blanco monster (houtskoolvoorbehandeld kweekmedium alleen met 3NT) om er zeker van te zijn dat er geen spoor is van de bestudeerde analyten in het medium. Trek anders de verkregen waarde af van elk kalibratiepunt.
    3. Controleer de lineariteit van elke kalibratiecurve.
      1. Afzonderlijk, voor elke analyt, maak een helling-onderschepping lineaire vergelijking (y = ax +b), waarbij y overeenkomt met de verhouding van het analyt piekgebied versus 3NT piekgebied, a is de helling, x is de analytenconcentratie (μmol/L), en b verwijst naar de curve onderschepping. Het plotten van de grafiek 'y' versus 'x' genereert de kalibratiecurve.
      2. Voeg een lineaire trendlijn toe aan de grafiek, geef de kalibratiecurvevergelijking en regressiecoëfficiënt weer in de grafiek. Zorg ervoor dat de regressiecoëfficiënt > 0,990 is. In geval van niet-overeenkomende kalibratienormen, bereid deze opnieuw voor en/of analyseer deze opnieuw. Wijzig optioneel het concentratiebereik van de kalibratiecurve.
    4. Analyseer de QC-monsters om de systeemprestaties te controleren voordat u de experimentele monsters analyseert. In geval van onverenigbaarheden (± 20% afwijking van de referentiewaarde) de nieuwe kalibratiecurven voorbereiden.

7. In vitro celkweek en monsterverzameling voor analyse

  1. Plaat de bestudeerde kankercellen (MDA-MB-231 of SK-OV-3) in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) met 4,5 g/L ᴅ-glucose, 10% (v/v) foetaal runderserum (FBS), 2 mmol/L ʟ-glutamine en 1 U penicilline/streptomycine en kweek bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 om ze voor het experiment uit te breiden. Passage de cellen bij 80% van de samenvloeiing.
  2. Maak cellen los van de kweekschaal met trypsine, zaad voor het experiment op 12-putplaten met een dichtheid van 0,3 × 106 cellen per put en plaats 's nachts in een incubator.
  3. Aspireer de volgende dag het kweekmedium en voeg verse DMEM toe met of zonder toevoeging van de bestudeerde verbindingen, afhankelijk van het experimentele ontwerp.
  4. Verzamel na 48 uur het medium van boven de cellen (ongeveer 500 μL) in een buis van 1,5 ml. Centrifugeer op 14.000 x g gedurende 5 minuten om eventuele celresten te verwijderen. Verzamel het supernatant en bewaar bij -80 °C tot de analyse.
  5. Bewaar de cellulaire pellet van stap 7.4 voor eiwitschatting. Vries de monsters in bij -20 °C.
    OPMERKING: De resultaten die voor een medium uit verschillende putten worden verkregen, moeten worden genormaliseerd tot het totale eiwitgehalte om rekening te houden met de variabiliteit in celnummer in afzonderlijke putten. De eiwitconcentratie kan worden beoordeeld zoals beschreven in stap 9.

8. Bereid monsters voor op LC-MS-analyse

  1. Ontdooi het bevroren monster op kamertemperatuur en meng goed. Breng 149,25 μL van het kweekmedium over in een centrifugatiebuis (1,5 ml).
  2. Voeg 0,75 μL 0,1 g/L 3NT-oplossing (interne standaard) toe. Sluit de buizen en vortex goed.
  3. Voeg 150 μL gekoeld bij -20 °C methanol met 1% (v/v) FA toe voor monsterdeproteïnisatie. Sluit de buizen en vortex goed.
  4. Ga verder met de monstervoorbereiding zoals beschreven in rubriek 3 (stappen 3.3-3.11).
    OPMERKING: Sommige kankercellen zoals SK-OV-3 scheiden grote hoeveelheden Kyn af in een kweekmedium. Om de gegevens in een lineair bereik van de kalibratiecurve te plaatsen, is een ongeveer 100-voudige verdunning van het monster noodzakelijk. Verdun in dit geval een deel van het monster met 0,1% (v/v) FA in water en analyseer naast het onverdunde monster. De referentiemonsters van normen voor de kalibratiecurve moeten worden bereid in 100 keer verdund volledig kweekmedium. U ook meer punten in de kalibratiecurve toevoegen (als de juiste oplosbaarheid en lineariteit worden bereikt) om deze aan te passen aan het concentratieniveau van Kyn in het experimentele monster.
  5. Analyseer de monsters door LC-MS zoals beschreven in sectie 5. Maak een werklijst en voer elk voorbeeld in drievoud uit.
  6. Nadat de werklijst is voltooid, meet u het piekgebied van analyt.
  7. Genereer een spreadsheet met behulp van de beschikbare software en de verkregen numerieke gegevens.
  8. Bereken in één spreadsheetkolom de verhouding van het analytpiekgebied over het 3NT-piekgebied.
  9. Gebruik een individuele lineaire kalibratievergelijking die is toegewezen voor elke analyt (vanaf stap 6.3.) om concentraties van analyten in de experimentele monsters te berekenen.

9. Beoordeling van eiwitgehalte en datanormalisatie

  1. Resuspendeer de cellulaire pellet uit stap 7.5 met 100 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in 1,5 ml buis.
    OPMERKING: Bereid PBS-oplossing door 8 g natriumchloride, 0,2 g kaliumchloride, 1,44 g natriumfosfaat dibasic, kaliumdihydrogenfosfaat op te lossen in 950 ml ultrapure water. Goed roeren. Stel de pH in op 7,4 met zoutzuur (druppelsgewijs). Stel het volume in tot 1 L met ultrapaan water. Roer goed tot het homogeen is.
    LET OP: Zoutzuur is zeer corrosief en moet met passende veiligheidsmaatregelen worden behandeld. Contact met de menselijke huid kan roodheid, pijn, brandwonden van de huid veroorzaken. Werk onder de afzuigkap; draag beschermende handschoenen en jas.
  2. Vries de monsters in bij -20 °C en ontdooi vervolgens op ijs. Herhaal deze stap 3x.
  3. Centrifugeer de monsters bij 14.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Verzamel de supernatanten in de nieuwe buizen. Stoor de pellet niet.
  4. Verdun de supernatanten 10x met PBS.
  5. Bouw een kalibratiecurve van 0 tot 2 μg eiwit per putbereik.
    1. Bereid de standaardoplossing voor runderserumalbumine (BSA) voor de kalibratie. Los 1,23 μg BSA op in 1 ml ultrapaanwater en vortexput.
    2. Laad op een plaat met 96 putten verschillende hoeveelheden BSA-standaardoplossing (1,23 μg/ml): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.
    3. Vul de put met PBS tot het uiteindelijke volume van 50 μL.
  6. Laad 10 - 15 μL cel lysaat vanaf stap 9.4 op dezelfde 96-putplaat. Vul de putten met PBS om het uiteindelijke volume van 50 μL te bereiken.
    OPMERKING: Pas indien nodig het volume van de cel lysaat aliquot in elke put aan om in het lineaire bereik van de kalibratiecurve te passen. Houd het uiteindelijke volume op 50 μL van het monster per put.
  7. Voeg 200 μL van een Bradford-reagens (5 keer verdund met ultrapure water) toe aan elke put.
  8. Incubeer de 96-put paté gedurende ten minste 5 minuten op kamertemperatuur. Plaats de plaat in een microplaatlezer. Meet de absorptie bij λ = 595 nm.
  9. Maak een kalibratiecurve met behulp van een spreadsheetprogramma. Plot de BSA-hoeveelheid (μg) versus absorptie. Voeg een lineaire trendlijn toe, geef de kalibratiecurvevergelijking en regressiecoëfficiënt weer in de grafiek.
  10. Gebruik de lineaire vergelijking (y = bijl +b, waarbij y overeenkomt met de absorptie bij λ = 595 nm, a is de helling, x is een eiwitgehalte (μg) en b verwijst naar de curve-interceptie) om de eiwithoeveelheid in het monster te berekenen.
    OPMERKING: Overweeg een monsterverdunningsfactor bij berekeningen.
  11. Gebruik het geschatte eiwitgehalte om de kynureninehoeveelheid in het monster per 1 mg eiwit te normaliseren. Om dit te doen, verdeel de concentratie kynurenines bepaald in stap 8.9 met het totale eiwitgehalte van stap 9.10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LC-MS biedt onbetwistbare voordelen bij de kwantificering van biologisch actieve moleculen, hoewel sommige componenten van complexe specimens zogenaamde matrixeffecten veroorzaken en de ionisatie van analyten in gevaar brengen. Het leidt tot ionenonderdrukking of ionenverbetering, sterk afnemende nauwkeurigheid en beïnvloedt een detectie-/kwantificeringsgrens van LC-MS, die wordt beschouwd als een "zwak" punt van de methode. In ons protocol worden de ionen gegenereerd door elektrospray-ionisatie (ESI) in de positieve mod...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel presenteert een gedetailleerd LC-SQ-protocol voor de gelijktijdige kwantificering van vier belangrijke Trp-metabolieten (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) die worden gemeten in een medium uit in vitro gekweekte menselijke kankercellen. Speciale aandacht wordt besteed aan het monsterpreparaat, de chromatografische/massaspectrometrieprocedure en de gegevensinterpretatie, de belangrijkste punten binnen de analyse.

Over het algemeen vereist LC-MS-analyse, vanwege hoge gevoeligheid, de hoo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Europese Unie van het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling in het kader van het Operationeel Programma Ontwikkeling oost-Polen 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), door de Faculteit Biotechnologie en Milieuwetenschappen van de John Paul II Catholic University of Lublin (Young Scientists grant for Ilona Sadok), Polish National Science Centre, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 voor Magdalena Staniszewska, Principle Investigator).  De auteurs danken Prof. Agnieszka Ścibior van het Laboratory of Oxidative Stress, Centre for Interdisciplinary Research, JPII CUL voor het delen van de apparatuur voor celcultiuring en eiwitkwantificering.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-hydroksy-DL-kynureninaSigma-AldrichH1771
3-hydroxyanthranilic acidSigma-Aldrich14877697%
3-nitro-L-tyrosineSigma-AldrichN7389
AcetonitrileSupelco1.00029hypergrade for LC-MS LiChrosolv
Geactiveerde houtskoolSupelco05105poeder
Analytische weegschaalOhaus
Analytische kolomAgilent Technologies959764-902Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm)
AmmoniumformiaatSupelco7022eluentadditief voor LC-MS, LiChropur, ≥99.0%
Bovine Serum AlbuminSigma1001887398
Doppen voor chromatografische flaconsAgilent Technologies5185-5820blauwe schroefdoppen, PTFE/rood sil sepa
CelcultuurschaalNest704004polystyreen, niet-pyrogeen, steriele
CelcultuurplaatBiologix07-601212-well, niet-pyrogeen, niet-cytotoxisch, sterille
CelincubatorThermo Fisher ScientificHERAcell 150i Cu
CentrifugeEppendorfmodel 5415R
CentrifugeEppendorfmodel 5428
CentrifugebuizenBionovoB-2278Eppendorf type, 1,5 mL
CentrifugebuizenBionovoB-3693Falcon type, 50 mL, PP
Software voor chromatografische dataverwerving en analyseAgilent TechnologiesLC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Chromatografische inzetflessenAgilent Technologies9301-1387100 µL
Chromatografische flaconsAgilent Technologies5182-07142 mL, helder glas
DimethylsulfoxideSupelco1.02950Uvasol
Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)PAN BiotechP04-41450
Duaal meter pH/geleidingsvermogenMettler ToledoSevenMulti
VerdamperGenevacmodel EZ-2.3 Elite
Fetaal bovien serumSigma-AldrichF9665
MierenzuurSupelco5.33002voor LC-MS LiChropur
Glasfles voor opslag van reagentiaBionovoS-207050 mL, helder glas
Guard kolomAgilent Technologies959757-902Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm)
ZoutzuurMerck1.00317.1000
L-kynurenineSigma-AldrichK8625≥98% (HPLC)
MagneetslingerWigoES 21 H
MicrobalanceMettler Toledomodel XP6
Milli-Q systeemMilliporeZRQSVPO30Direct-Q 3 UV met pomp
Quadruple massaspectrometerAgilent TechnologiesG1948Bmodel 6120
Penicilline-StreptomycineSigma-Adrich048M4874V
Plate readerBio TekSynergy 2 bediend door Gen5
KaliumchlorideMerck1.04936.1000
KaliumdiwaterstoffosfaatMerck1.05108.0500
Proteïne Assay Dye Reagent ConcentrateBioRad500-0006
ZagslagwiegschaalStuartSSL4
Serologische pijpNest3260015 mL, polystyreen, niet-pyrogeen, steriele
NatriumchlorideSigma-Aldrich7647-14-5
Natriumfosfaat dibasischMerck1.06346.1000
SolventinlaatfilterAgilent Technologies5041-2168glasfilter, 20 μm poriegrootte
Solvent reservoir (voor LC-MS)Agilent Technologies9301-65241 L, helder glas
Solvent reservoir (voor LC-MS)Agilent Technologies9301-65261 L, barnsteenkleurig glas
Spreadsheet programmaMicrosoft OfficeMicrosoft Office Excel
RoerbarBionovo6-2003teflon gecoat
Spuitfilters voor filtratie van kweekmediumBionovo7-8803geregenereerde cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm
Spuitfilters voor filtratie van mobiele fasecomponentenBionovo6-0018nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm
WeefselcultuurplatenVWR10062-90096-wells, steriele
Trypsine-EDTA OplossingSigma-AldrihT4049-100 mL
Ultra-High Performance Liquid Chromatography systeemAgilent TechnologiesG1367D, G1379B, G1312B, G1316C1200 Infinity systeem bestaande uit autosampler (G1367D), ontgasser (G1379B), binaire pomp (G1312B), kolomthermostaat (G1316C)
UltrasoonbadPolsonic104533model 6D
VortexBiosanmodel V-1 plus
XantureenzuurSigma-AldrichD12080496%

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
  2. Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
  3. Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
  4. Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
  5. Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
  6. Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
  7. Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
  8. Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286(2018).
  9. Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
  10. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
  11. Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
  12. Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
  13. Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. Chromatographic analysis of tryptophan metabolites. Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).
  14. Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
  15. Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
  16. Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
  17. Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
  18. Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
  19. Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
  20. Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75(2017).
  21. Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
  22. Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
  23. Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
  24. Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
  25. Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
  26. Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
  27. Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
  28. Annesley, T. M. Ion suppression in mass spectrometry. Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).
  29. Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
  30. Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
  31. Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416(2009).
  32. Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kynurenine QuantificationLiquid ChromatographyMass SpectrometryCancer Cell CultureSample PreparationCalibration CurveSingle Ion MonitoringProtein NormalizationQuality ControlInternal Standard

Related Articles