Gelijktijdige kwantificering van geselecteerde kynurenines geanalyseerd door vloeibare chromatografie-massaspectrometrie in medium verzameld uit kankercelculturen

Summary

Hier beschreven is een protocol voor de bepaling van vier verschillende tryptofaanmetabolieten gegenereerd in de kynurenine route (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic zuur, 3-hydroxyanthranilic zuur) in het medium verzameld uit kankercelculturen geanalyseerd door vloeibare chromatografie in combinatie met een enkele viervoudige massaspectrometrie.

Abstract

De kynurenine route en de tryptofaan katabolieten genaamd kynurenines hebben meer aandacht gekregen voor hun betrokkenheid bij immuunregulatie en kankerbiologie. Een in vitro celkweektest wordt vaak gebruikt om te leren over de bijdrage van verschillende tryptofaankabolieten in een ziektemechanisme en voor het testen van therapeutische strategieën. Celkweekmedium dat rijk is aan uitgescheiden metabolieten en signaalmoleculen weerspiegelt de status van het tryptofaanmetabolisme en andere cellulaire gebeurtenissen. Nieuwe protocollen voor de betrouwbare kwantificering van meerdere kynurenines in het complexe celkweekmedium zijn gewenst om een betrouwbare en snelle analyse van meerdere monsters mogelijk te maken. Dit kan worden bereikt met vloeibare chromatografie in combinatie met massaspectrometrie. Deze krachtige techniek wordt in veel klinische en onderzoekslaboratoria gebruikt voor de kwantificering van metabolieten en kan worden gebruikt voor het meten van kynurenines.

Hier wordt het gebruik van vloeibare chromatografie in combinatie met enkele viervoudige massaspectrometrie (LC-SQ) gepresenteerd voor de gelijktijdige bepaling van vier kynurenines, d.w.z. kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic en xanthurenic acid in het medium dat wordt verzameld uit in vitro gekweekte kankercellen. SQ-detector is eenvoudig te gebruiken en goedkoper in vergelijking met andere massaspectrometers. In de SQ-MS-analyse worden meerdere ionen uit het monster gegenereerd en gescheiden op basis van hun specifieke massa-tot-ladingsverhouding(m/z),gevolgd door de detectie met behulp van een Sim-modus (Single Ion Monitoring).

Dit document vestigt de aandacht op de voordelen van de gerapporteerde methode en geeft enkele zwakke punten aan. Het is gericht op kritieke elementen van LC-SQ-analyse, waaronder monstervoorbereiding, samen met chromatografie en massaspectrometrieanalyse. Ook de kwaliteitscontrole, methodekalibratieomstandigheden en matrixeffectproblemen komen aan bod. We beschreven een eenvoudige toepassing van 3-nitrotyrosine als één analoge standaard voor alle doelanalyten. Zoals bevestigd door experimenten met menselijke eierstok- en borstkankercellen, genereert de voorgestelde LC-SQ-methode betrouwbare resultaten en kan deze verder worden toegepast op andere in vitro cellulaire modellen.

Introduction

Kynurenine pathway (KP) is de belangrijkste route van tryptofaan (Trp) katabolisme in menselijke cellen. Indoolamine-2,3-dioxygenase (IDO-1) in extrahepatische cellen is het eerste en beperkende enzym van KP en zet Trp om in N-formylkynurenine¹. Verdere stappen binnen KP genereren andere secundaire metabolieten, namelijk kynurenines die verschillende biologische eigenschappen vertonen. Kynurenine (Kyn) is de eerste stabiele Trp-katabole die toxische eigenschappen vertoont en cellulaire gebeurtenissen reguleert na binding aan de arylkoolwaterstofreceptor (AhR)². Vervolgens wordt Kyn omgezet in verschillende moleculen, het....

Protocol

1. Voorbereiding van standaard 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standaard voorraadoplossingen

1. Weeg de reagentia in een flacon met de hoogste nauwkeurigheid (0,3 mg per stuk). Voor een betere nauwkeurigheid schaalt u de reagentia op en past u het volume van het oplosmiddel aan volgens stap 1.2.
2. Los de reagentia op in 300 μL van het oplosmiddel om een voorraadoplossing van 1 g/L te verkrijgen. Los 3NT op in 1% (v/v) mierenzuur (FA) in water; Kyn, 3HAA en XA in dimethylsulfoxide (DMSO); 3HKyn in water verzuurd tot pH 2,5 met zoutzuur (HCl).
   LET OP: 3HAA irriteert ogen, neus, keel en longen. Het is schadelijk bij inademing, in contact met de huid en bij in....

Results

LC-MS biedt onbetwistbare voordelen bij de kwantificering van biologisch actieve moleculen, hoewel sommige componenten van complexe specimens zogenaamde matrixeffecten veroorzaken en de ionisatie van analyten in gevaar brengen. Het leidt tot ionenonderdrukking of ionenverbetering, sterk afnemende nauwkeurigheid en beïnvloedt een detectie-/kwantificeringsgrens van LC-MS, die wordt beschouwd als een "zwak" punt van de methode. In ons protocol worden de ionen gegenereerd door elektrospray-ionisatie (ESI) in de positieve mod.......

Discussion

Dit artikel presenteert een gedetailleerd LC-SQ-protocol voor de gelijktijdige kwantificering van vier belangrijke Trp-metabolieten (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) die worden gemeten in een medium uit in vitro gekweekte menselijke kankercellen. Speciale aandacht wordt besteed aan het monsterpreparaat, de chromatografische/massaspectrometrieprocedure en de gegevensinterpretatie, de belangrijkste punten binnen de analyse.

Over het algemeen vereist LC-MS-analyse, vanwege hoge gevoeligheid, de hoo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-hydroksy-DL-kynurenina	Sigma-Aldrich	H1771
3-hydroxyanthranilic acid	Sigma-Aldrich	148776	97%
3-nitro-L-tyrosine	Sigma-Aldrich	N7389
Acetonitrile	Supelco	1.00029	hypergrade for LC-MS LiChrosolv
Activated charcoal	Supelco	05105	powder
Analytical balance	Ohaus
Analytical column	Agilent Technologies	959764-902	Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 µm)
Ammonium formate	Supelco	7022	eluent additive for LC-MS, LiChropur, ≥99.0%
Bovine Serum Albumin	Sigma	1001887398
Caps for chromatographic vials	Agilent Technologies	5185-5820	blue screw caps,PTFE/red sil sepa
Cell culture dish	Nest	704004	polystyrene, non-pyrogenic, sterile
Cell culture plate	Biologix	07-6012	12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille
Cell incubator	Thermo Fisher Scientific		HERAcell 150i Cu
Centrifuge	Eppendorf		model 5415R
Centrifuge	Eppendorf		model 5428
Centrifuge tubes	Bionovo	B-2278	Eppendorf type, 1.5 mL
Centrifuge tubes	Bionovo	B-3693	Falcon type, 50 mL, PP
Chromatographic data acqusition and analysis software	Agilent Technologies		LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
Chromatographic insert vials	Agilent Technologies	9301-1387	100 µL
Chromatographic vials	Agilent Technologies	5182-0714	2 mL, clear glass
Dimethyl sulfoxide	Supelco	1.02950	Uvasol
Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-41450
Dual meter pH/conductivity	Mettler Toledo		SevenMulti
Evaporator	Genevac		model EZ-2.3 Elite
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F9665
Formic acid	Supelco	5.33002	for LC-MS LiChropur
Glass bottle for reagents storage	Bionovo	S-2070	50 mL, clear glass
Guard column	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm)
Hydrochloric acid	Merck	1.00317.1000
L-kynurenine	Sigma-Aldrich	K8625	≥98% (HPLC)
Magnetic stirrer	Wigo		ES 21 H
Microbalance	Mettler Toledo		model XP6
Milli-Q system	Millipore	ZRQSVPO30	Direct-Q 3 UV with Pump
Quadrupole mass spectrometer	Agilent Technologies	G1948B	model 6120
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Adrich	048M4874V
Plate reader	Bio Tek		Synergy 2 operated by Gen5
Potassium chloride	Merck	1.04936.1000
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1.05108.0500
Protein Assay Dye Reagent Concentrate	BioRad	500-0006
See-saw rocker	Stuart	SSL4
Serological pipette	Nest	326001	5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Sodium phosphate dibasic	Merck	1.06346.1000
Solvent inlet filter	Agilent Technologies	5041-2168	glass filter, 20 μm pore size
Solvent reservoir (for LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6524	1 L, clear glass
Solvent reservoir (for LC-MS)	Agilent Technologies	9301-6526	1 L, amber glass
Spreadsheet program	Microsoft Office		Microsoft Office Excel
Stir bar	Bionovo	6-2003	teflon coated
Syringe filters for culture medium filtration	Bionovo	7-8803	regenerated cellulose, Ø 30 mm, 0,45 µm
Syringe filters for mobile phase components filtration	Bionovo	6-0018	nylon, Ø 30 mm, 0,22 µm
Tissue culture plates	VWR	10062-900	96-wells, sterille
Trypsin-EDTA Solution	Sigma-Aldrih	T4049-100 mL
Ultra-High Performance Liquid Chromatography system	Agilent Technologies	G1367D, G1379B, G1312B, G1316C	1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C)
Ultrasound bath	Polsonic	104533	model 6D
Vortex	Biosan		model V-1 plus
Xanthurenic acid	Sigma-Aldrich	D120804	96%