Methodenartikel

Fluorescerende immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines in de celwand van plantenweefsels

6.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61034

⸱

27 februari 2021

 ,  , 
1Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, 2Laboratório Associado para a Química Verde, 3Dipartimento di Bioscienze, Universitá degli Studi di Milano

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft in detail hoe het plantaardige materiaal voor immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines is bevestigd, ingebed in een hydrofiele acrylhars, doorsneden en gemonteerd op glazen dia's. We laten zien dat celwandgerelateerde epitopen worden gedetecteerd met specifieke antilichamen.

Samenvatting

Plantontwikkeling omvat constante aanpassingen van de celwandsamenstelling en structuur als reactie op zowel interne als externe stimuli. Celwanden bestaan uit cellulose en niet-cellulosepolysachariden samen met eiwitten, fenolverbindingen en water. 90% van de celwand bestaat uit polysachariden (bijv. pectines) en arabinogalactan-eiwitten (APP's). De fluorescerende immunolocalisatie van specifieke glycanepotopen in histologische secties van planten blijft een belangrijk hulpmiddel om de renovatie van wandpolysaccharidenetwerken, structuur en componenten te ontdekken.

Hier rapporteren we een geoptimaliseerde fluorescerende immunolocalisatieprocedure om glycanepotopen van APP's en pectines in plantenweefsels te detecteren. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixatie werd gebruikt samen met LR-White inbedding van de plantenmonsters, waardoor een betere conservering van de weefselstructuur en samenstelling mogelijk was. Dunne delen van de ingebedde monsters verkregen met een ultra-microtome werden gebruikt voor immunolocalisatie met specifieke antilichamen. Deze techniek biedt een hoge resolutie, hoge specificiteit en de kans om meerdere glycan epitopen in hetzelfde monster te detecteren. Deze techniek maakt subcellulaire lokalisatie van glycanen mogelijk en detecteert hun accumulatieniveau in de celwand. Het maakt ook de bepaling van spatio-temporele patronen van AGP en pectineverdeling tijdens ontwikkelingsprocessen mogelijk. Het gebruik van deze tool kan uiteindelijk leidend zijn voor onderzoeksrichtingen en glycanen koppelen aan specifieke functies in planten. Bovendien kan de verkregen informatie een aanvulling vormen op biochemische en genexpressiestudies.

Inleiding

Plantencelwanden zijn complexe structuren die bestaan uit polysachariden en glycoproteïnen. Celwanden zijn uiterst dynamische structuren waarvan de architectuur, organisatie en samenstelling variëren afhankelijk van celtype, lokalisatie, ontwikkelingsfase, externe en interne stimuli1. Arabinogalactan-eiwitten (APP's) en pectines zijn belangrijke componenten van de plantencelwand. APP 's zijn sterk geglycosyleerde eiwitten en pectines zijn homogalacturonan polysachariden waarvan de samenstelling, hoeveelheid en structuur sterk variëren tijdens verschillende ontwikkelingsstadia2,3,4. ASP's en pectinestudies hebben hun betrokkenheid bij verschillende plantprocessen aan het licht gebracht, zoals geprogrammeerde celdood, reactie op abiotische stress, seksuele plantenreproductie, en vele anderen5. De meeste van deze studies begonnen met informatie verkregen uit immunolocalisatiestudies.

Gezien de complexiteit vereist de studie van celwanden veel verschillende hulpmiddelen. Detectie van glycan epitopen met behulp van monoklonale antilichamen (mAbs) is een waardevolle aanpak om polysaccharide en glycoproteïne distributie langs deze structuur op te lossen. Er is een grote verzameling mAbs beschikbaar om glycan epitopen te detecteren en de specificiteit van elke mAb wordt ook voortdurend verbeterd6. De hier beschreven techniek is toepasbaar op alle plantensoorten en is een perfect hulpmiddel om toekomstige onderzoeksrichtingen te sturen die duurdere en complexere technieken met zich mee kunnen brengen.

In deze techniek worden specifieke antilichamen chemisch geconjugeerd aan fluorescerende kleurstoffen zoals FITC (fluoresceïne-isothiocyanaat), TRITC (tetramethylrhodamine-5-(en 6)-isothiocyanaat) of verschillende Alexa Fluorkleurstoffen. Immunofluorescentie biedt verschillende voordelen, waardoor een duidelijke en snelle subcellulaire lokalisatie van glycanen mogelijk is die direct kan worden waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop. Het is zeer specifiek en gevoelig, omdat de bereiding van het monster de natuurlijke structuur van het antigeen effectief kan beschermen, zelfs als het in lagere hoeveelheden aanwezig is. Het maakt de detectie van meerdere antigenen in hetzelfde monster mogelijk en het belangrijkste, biedt hoge kwaliteit en visueel mooie resultaten. Ondanks de grote kracht die wordt geboden door fluorescentie-immunolocalisatiestudies, worden ze vaak beschouwd als moeilijk uit te voeren en te implementeren, waarschijnlijk vanwege het ontbreken van gedetailleerde protocollen die de visualisatie van de verschillende stappen van de procedure mogelijk maken. Hier geven we enkele eenvoudige richtlijnen voor het uitvoeren van deze techniek en het verkrijgen van afbeeldingen van hoge kwaliteit.

Voor het protocol dat hier wordt gepresenteerd, moeten monsters eerst worden bevestigd en ingesloten met behulp van het meest geschikte fixatieve. Hoewel beschouwd als een tijdrovende en relatief vervelende techniek, is een goede fixatie en inbedding van het plantenmonster de sleutel om een succesvolle immunolocalisatietest te garanderen. Voor dit doel is chemische fixatie het meest gebruikelijk met behulp van crosslinking-fixatieven, zoals aldehyden. Cross-linking fixatieven vestigen chemische bindingen tussen moleculen van het weefsel, stabiliseren en verharden van het monster. Formaldehyde en glutaraldehyde zijn cross-linking fixatieven, en soms wordt een mix van beide fixatieven gebruikt7. Formaldehyde biedt een grote structurele conservering van weefsels en voor langere tijd, produceert kleine weefsel retracties en is compatibel met immunostaining. Glutaraldehyde is een sterker en stabiel fixatief dat meestal wordt gebruikt in combinatie met formaldehyde. Het gebruik van glutaraldehyde heeft enkele nadelen waarmee rekening moet worden gehouden, omdat het enkele vrije aldehydegroepen in het vaste weefsel introduceert, wat een aantal niet-specifieke etikettering kan genereren. Ook het kruisen tussen eiwitten en andere moleculen kan af en toe sommige doeleptopen ontoegankelijk maken voor de antilichamen. Om dit te voorkomen, moeten de hoeveelheid en duur van de fixatie zorgvuldig worden gedefinieerd.

Na fixatie worden monsters ingebed in de juiste hars om uit te harden voordat de secties worden verkregen. London Resin (LR-White) acrylhars is de hars bij uitstek voor immunolokalisatiestudies. In tegenstelling tot andere harsen is LR-White hydrofiel, waardoor de antilichamen hun antigenen kunnen bereiken, zonder dat er een behandeling nodig is om het te vergemakkelijken. LR-White heeft ook het voordeel dat het een lage autofluorescentie biedt, waardoor achtergrondgeluid tijdens immunofluorescentiebeeldvorming kan worden verkleind.

Er zijn veel kleuringstechnieken beschikbaar om verschillende componenten van de celwand te detecteren, zoals Alcaanse blauwe kleuring, toluidineblauwe kleuring of Periodieke acid-Schiff (PAS) kleuring. Geen van deze biedt de kracht van immunolocalisatieanalyses8. Deze aanpak geeft meer specificiteit in de detectie van glycanen en biedt uitgebreidere informatie over de samenstelling en structuur van de celwand.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Monstervoorbereiding: fixatie, uitdroging en LR-White inbedding

  1. Fixatie en uitdroging
    OPMERKING: Het fixatieproces is van cruciaal belang om het monster te behouden; door moleculen met elkaar te verbinden wordt het cellulaire metabolisme gestopt, waardoor de cellulaire integriteit wordt gewaarborgd en moleculaire diffusie wordt voorkomen. De fixatieve middelen en de gebruikte concentratie moeten daartoe worden aangepast, zodat de antigenen voldoende worden blootgesteld om met de antilichamen te interageren. Het volgende protocol combineert het milde fixatieve vermogen van paraformaldehyde, met het sterkere effect van glutaraldehyde. Hun verhoudingen werden geoptimaliseerd voor APP's en celwandcomponenten, maar het is geschikt voor andere eiwitten en celstructuren. Het daaropvolgende uitdrogingsproces bereidt de monsters voor op LR-White-inbedding. In dit experiment werden plantenweefsels van verschillende plantensoorten gebruikt. Quercus suber monsters werden verzameld van bomen gekweekt in het veld. Trithuria submersa monsters werden vriendelijk met ons gedeeld door Paula Rudall (Kew Gardens, Londen, VK).
    1. Zaai alle Arabidopsis planten direct op de grond en groei in een indoor groeifaciliteit met 60% relatieve luchtvochtigheid en een dag/nacht cyclus van 16 uur licht bij 21 °C en 8 uur duisternis bij 18 °C. Selecteer de te analyseren plantenweefsels en trim monsters om niet meer dan 16 mm2 groot te zijn.
    2. Breng het monster onmiddellijk over naar een glazen flacon die eerder is gevuld met voldoende koude fixatieve oplossing (2% formaldehyde (w/v), 2,5% glutaraldehyde (w/v), 25 mM PIPES pH 7 en 0,001% Tween-20 (v/v)) om de monsters volledig onder te dompelen (figuur 1A).
      LET OP: Formaldehyde en glutaraldehyde zijn beide fixatieve middelen die schadelijk kunnen zijn bij inademing en contact. Voer de fixatiestap uit op een rookkap en draag voldoende beschermende kleding en nitrilhandschoenen. Alle oplossingen vanaf deze stap, inclusief alcoholreeksen tot 70%, moeten worden opgeslagen voor latere ontsmetting door gespecialiseerd personeel.
    3. Nadat u alle monsters hebt verzameld, vernieuwt u het fixatief.
    4. Breng de flacons over in een vacuümkamer en breng langzaam vacuüm aan. Bij het bereiken van -60 kPa begint het drijvende materiaal naar de bodem van de flacon te zinken (figuur 1B).
    5. Houd onder een vacuüm van niet meer dan -80 kPa gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
    6. Laat het vacuüm langzaam los, sluit de glazen flacon af en plaats 's nachts op 4 °C.
    7. Gooi alle monsters weg die niet zijn gezonken tijdens de nachtelijke fixatie. Was de resterende monsters met 25 mM PBS pH 7 gedurende 10 minuten, gevolgd door een wasbeurt van 20 minuten in 25 mM PIPES buffer pH 7,2.
    8. Droog de monsters uit in een ethanolreeks (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90% en 3x 100% ethanol) gedurende elk 20 minuten. Breng de gedehydrateerde monsters onmiddellijk over naar gelabelde glazen flacons voor inbedding (figuur 1C).
      OPMERKING: Het uitdrogingsproces kan worden onderbroken bij de 70% ethanolstap.
  2. LR-Witte hars inbedding
    OPMERKING: LR-wit is een niet-hydrofobe acrylhars met een lage viscositeit, waardoor het ideaal is voor het doordringen van weefsels met veel dikke celwandenlagen. LR-White is ook verkrijgbaar in verschillende hardheidsgraden die compatibel zijn voor het snijden van de meeste plantenmonsters. Zorg ervoor dat de gebruikte hars al wordt geleverd met de juiste katalysator gemengd, of volg de instructies van de leverancier om de hars te bereiden. Het volgende inbeddingsproces is traag, maar de resultaten rechtvaardigen de middelen aanzienlijk.
    1. Doordrenken de monsters door te incuberen met de LR-Witte hars in een reeks halvemaanconcentratie van hars (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) in ethanol, waarbij in elke stap gedurende 24 uur bij 4 °C wordt geïncubeerd.
      LET OP: LR-Witte hars is een acrylhars met een lage toxiciteit; het kan echter irriterend zijn voor de huid door contact en inademing. Werken in een goed geventileerde ruimte of onder een rookkap met passende beschermende slijtage en nitrilhandschoenen wordt ten zeerste aanbevolen.
    2. Ververs de LR-witte hars en incubeer gedurende nog eens 12 uur bij 4 °C.
    3. Bereid de juiste maat insluitbare gelatinecapsules (maat 1 (0,5 ml) voor monsters tot 3 mm, 2 x 0,37 ml voor monsters tot 5 mm of 3 x 0,3 ml voor monsters tot 8 mm en papieren tags (figuur 1D).
      OPMERKING: Selecteer de capsulegrootte om iets groter te zijn dan het monster, zodat het monster volledig in de hars kan worden ingesloten. Vergeet ook niet om de tags te labelen met een potlood, omdat pen of bedrukte inkten de hars zullen besmetten, waardoor het monster wordt geruïneerd.
    4. Breng één druppel verse LR-witte hars aan op de bodem van elke capsule.
    5. Plaats een monster in elke gelatinecapsule en vul tot maximale capaciteit met verse hars. Plaats de capsuledop en druk zachtjes aan om een hermetische afdichting te vormen (figuur 1E).
    6. Polymeriseer de hars gedurende 24 tot 48 uur bij 58 °C, of tot ze volledig uitgehard zijn.
    7. Bewaar monsters op kamertemperatuur.
      OPMERKING: Postpolymerisatie LR-witte hars is inert.

2. Diavoorbereiding

OPMERKING: Glazen glijbanen moeten schoon zijn, vrij van stof, vet of andere verontreinigingen. Zelfs nieuwe glijbanen moeten worden gereinigd, omdat sommige leveranciers oliën en reinigingsmiddelen gebruiken om te voorkomen dat de dia's aan elkaar plakken. Elk vet of reinigingsmiddel zal de sectiehechting op de dia verstoren, zelfs als het met poly-L-lysine wordt behandeld. Pluis en stof zullen de waarnemingen van het monster beïnvloeden en het experiment zeer waarschijnlijk verpesten. Teflon gecoate dia's met reactieputten zijn perfect voor deze taak. Ze zijn betaalbaar, herbruikbaar en verminderen drastisch de hoeveelheid antilichaamoplossing die nodig is. Met de juiste reiniging kan fluorescerende immunolocalisatie van uitstekende kwaliteit worden uitgevoerd tegen een zeer betaalbare prijs.

  1. Dia wassen
    1. Plaats de glijbanen in een kleurrek en dek af met reinigingsoplossing (0,1% SDS (w/v), 1% azijnzuur (v/v), 10% ethanol (v/v)).
    2. Houd een milde agitatie gedurende 20 minuten.
    3. Breng de kleurrekken gedurende 10 minuten over in een ddH2O bad met milde agitatie. Herhaal dit 4 keer.
    4. Laat de rekken voorzichtig uitlekken voordat u kort in 100% ethanol dompelt en laat de glijbanen drogen in een stofvrije omgeving.
    5. Bewaren tot gebruik.
  2. Poly-L-lysine coating (optioneel)
    OPMERKING: Kleine secties plakken meestal heel goed om glazen dia's schoon te maken. Deze stap is alleen aan te bevelen voor grotere secties (>2 mm2). Grotere secties hebben de neiging om te vouwen en te rimpelen, en zijn niet aan te raden. Gebruik echter indien nodig reactieglijbanen met grotere gaten. Maak ze schoon zoals hierboven en ga als volgt te werk.
    1. Plaats schone glijbanen in een vierkante Petrischaal. Pipet 0,001% poly-L-lysineoplossing (w/v) om de gaten van de glijbanen te bedekken, zonder over te lopen.
    2. Laat de glijbanen 's nachts drogen bij 40 °C in gesloten Petrischaaltjes.
      OPMERKING: De gecoate glijbanen zijn klaar voor onmiddellijk gebruik en kunnen enkele maanden in een stofvrije omgeving bij kamertemperatuur worden bewaard.

3. Monster trimmen en snijden

  1. Voorbeeld trimmen
    1. Knip met een scherp scheermesje de LR-Witte blokken af onder een stereomicroscoop om een piramidevormige structuur te vormen waarbij de top loodrecht staat op het interessegebied van het monster (Aanvullende figuur 1A).
      OPMERKING: De ultra-microtome monsterhouder is een uitstekend hulpmiddel om het blok te beveiligen. Als het apparaat geen universele monsterhouder heeft, gebruik dan de houder die het meest geschikt is voor ronde blokken.
    2. Trim de piramidale structuur door fijne plakjes van de overtollige hars loodrecht op de grote as van de piramide te verwijderen.
    3. Ga verder totdat het monster is bereikt en het snijoppervlak vormt. Binnen het snijoppervlak moet het doelmonster idealiter in een trapeziumvorm worden ingesloten.
      OPMERKING: Het harsblok kan verder worden bijgesneden onder een spleethoek om het doorsnedeoppervlak te verkleinen met een scherp mes (figuur 1F).
  2. Halfdunne doorsnede
    OPMERKING: Er wordt een microtoma met glazen messen gebruikt. Het vermogen van het antilichaam om zich aan de epitoop te binden, zal het succes van de immunolabelingreactie conditioneren. Het hydrofiele karakter van de LR-Witte hars zorgt voor een goed contact van de antilichamen met de monstersecties. Dunnere secties zullen zwakkere Calcofluor-kleuring vertonen die zal worden gebruikt om de secties te lokaliseren en te helpen bij het beeldvormingsproces. Hetzelfde geldt voor andere vlekken die later kunnen worden aangebracht. Ook overmatige dikte heeft invloed op de kwaliteit van de beeldverwerving. Een goed compromis voor sectiedikte kan worden gevonden tussen 200 en 700 nm, afhankelijk van de weefselkenmerken. Monteer de blokken stevig op de monsterhouder van de ultramicrotome.
    1. Maak met een ultramicrotome secties met een dikte tussen 200 en 700 nm (figuur 1G).
    2. Controleer het sectiegebied door enkele secties over te brengen naar een ddH2O-druppel op een glazen dia. Plaats de glijbaan op een kookplaat van 50 °C totdat het water verdampt. Vlek die een druppel van 1% Toluidine Blue O (w/v) in 1% boorzuuroplossing (w/v) gedurende 30 s over de secties plaatst. Spoel en observeer onder de microscoop.
    3. Breng bij het vinden van de gewenste structuur een of twee secties over naar elke druppel ddH2O die eerder op elke put van een schone reactieschuif is geplaatst.
    4. Plaats elke glijbaan in een gesloten, schone vierkante petrischaal van 10 cm en laat deze drogen op 50 °C.
    5. Bewaar dia's in een schone archiefdoos tot ze worden gebruikt.

4. Immunolocalisatie

OPMERKING: De fluorescerende immunolocalisatieprocedure is gebaseerd op sequentiële gebruik van twee antilichamen. Het primaire antilichaam wordt verhoogd tegen een specifiek doelantigeen. Het secundaire antilichaam wordt specifiek tegen het primaire antilichaam verhoogd en voor fluorescerende technieken wordt geconjugeerd aan een fluorfore (FITC in dit specifieke protocol). Het primaire antilichaam zal worden gebruikt om het doelantigeen in het monster te detecteren en het secundaire antilichaam zal worden gebruikt om de locatie te markeren waar het primaire antilichaam dat op het monster is aangesloten na het afspoelen van het overtollige primaire antilichaam. Controles zijn een belangrijk onderdeel van deze test en moeten altijd worden uitgevoerd om de nauwkeurigheid van de waarnemingen te verzekeren. Een put op de dia moet worden gereserveerd voor gebruik als een negatieve controle, waarbij de primaire antilichaambehandeling wordt overgeslagen en daarom mag aan het einde van het experiment geen signaal worden waargenomen. Een positieve controle moet in het experiment worden opgenomen door een goed te behandelen met een antilichaam waarvan de etikettering al bekend en zeker is. De positieve controle wordt gebruikt om de effectiviteit en reactieomstandigheden van de secundaire antilichamenetikettering te bevestigen, terwijl de negatieve controle de secundaire antilichaamspecificatie test.

  1. Bereid een incubatiekamer voor door wat gedempte papieren handdoeken aan de onderkant van een pipetpuntendoos te plaatsen en deze te verpakken met tinfolie(aanvullende figuur 1B-1E). Plaats de dia's in de incubatiekamer.
  2. Pipetteer een druppel van 50 μL per 8 mm blokkeeroplossing (5% vetvrije droge melk (w/v) in 1 M PBS) en broed gedurende 10 minuten. Verwijder de blokkeringsoplossing en was alle putten twee keer met PBS gedurende 10 minuten.
  3. Bereid de primaire antilichaamoplossingen voor (zie aanvullende tabel 1),1:5 (v/v) antilichaam in blokkerende oplossing; maak een schatting van ongeveer 40 μL per put van 8 mm.
    OPMERKING: De concentratie van het antilichaam moet worden aangepast volgens het protocol van de fabrikant.
  4. Voer een laatste wasbeurt uit met ddH2O gedurende 5 minuten, laat de putten nooit volledig drogen.
  5. Pipetteer de primaire antilichaamoplossing voor de reactieputten. Pipet blokkerende oplossing voor de controleputten.
  6. Sluit de incubatiekamer en laat 2 uur staan bij kamertemperatuur gevolgd door een nacht bij 4 °C. Bereid de secundaire antilichaamoplossing voor, 1% in de blokkeringsoplossing (v/v) ongeveer 40 μL per put. Houd het bedekt met tinfolie.
  7. Was alle putten twee keer met PBS gedurende 10 minuten, gevolgd door 10 extra minuten met ddH2O. Zorg ervoor dat er geen spoor van de blokkerende oplossing of afzettingen zichtbaar is op de putten.
  8. Pipetteer de secundaire antilichaamoplossing voor alle putten. Bescherm de dia's vanaf nu tegen licht.
  9. Incubeer gedurende 3-4 uur in het donker bij kamertemperatuur.
  10. Was alle putten tweemaal gedurende 10 minuten met PBS gevolgd door nog een wasbeurt van 10 min met ddH2O.
  11. Breng een druppel calcofluor (1:10.000 (w/v) fluorescerend helderder 28 in PBS) aan op elke put. Breng zonder wassen een druppel montagemedium (zie Tabel met materialen)aan op elke put en plaats een afdeklip (figuur 1H).
  12. Observeer met een fluorescentiemicroscoop, uitgerust met 10x/0,45, 20x/0,75, 40x/0,95 en 100x/1,40 lens, gebruik UV (voor calcofluorbeits) en FITC-filters om respectievelijk celwand- en immunolocalisatie te detecteren (figuur 1I). Gebruik de volgende golflengten: excitatie/emissie (nm) 358/461 voor UV en 485/530 voor FITC.
  13. Voor een betere visualisatie van de resultaten overlappen beide afbeeldingen met ImageJ of iets dergelijks.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In een succesvol experiment zal het secundaire antilichaam specifiek de locatie van de specifieke epitoop in felgroen, op een consistente manier lokaliseren, waardoor de samenstelling van de celwand in een bepaald ontwikkelingsstadium van de cel, het weefsel of het orgaan kan worden gekarakteriseerd. Het LM6-antilichaam heeft bijvoorbeeld een hoge affiniteit voor 1,5-arabinan, een verbinding met type-I rhamnogalacturonan die overvloedig de celwand van de zich ontwikkelende Quercus-suber-ether

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De fluorescerende immunolocalisatiemethode in planten hier beschreven, hoewel naadloos eenvoudig, is gebaseerd op het succes van verschillende kleine stappen. De eerste is monstervoorbereiding en fixatie. Tijdens deze eerste stap wordt een mengsel van formaldehyde en glutaraldehyde gebruikt om de meerderheid van de celcomponenten te kruisen. De formaldehyde in de oplossing zorgt voor een milde en omkeerbare fixatie, terwijl de glutaraldehyde een sterke, meer permanente koppeling biedt; het evenwicht tussen de twee fixati...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

De auteurs ontvingen steun van het EU-project 690946 'SexSeed' (Sexual Plant Reproduction – Seed Formation) gefinancierd door H2020-MSCA-RISE-2015 en SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP ontving een subsidie van het MSCA-IF-2016-project van de Europese Unie (nr. 753328). MC ontving een subsidie van FCT PhD grant SFRH/BD/111781/2015.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
25% (w/v) GluteraldehydeAgar ScientificAGR1010aq. Oplossing, methanol vrij
8 wells glazen reactieschuifjesMarinfeldMARI1216750andere merken kunnen worden gebruikt
AzijnzuurSigma-AldrichA6283
Anti-Rat IgG (hele molecuul)-FITC antilichaam geproduceerd in GEETSigma-AldrichF6258
Dekglasjes, 24 mm x 50 mmMarinfeldMARI0100222Het dekglas moet alle putjes bedekken. Andere merken kunnen worden gebruikt 
ddH2Onana
Absoluut ethanolnana
Fluorescente ophelderder 28Sigma-AldrichF-6259
GelatinecapsulesAgar scientificAGG29211De capsulemaat moet passen bij de grootte van het monster.
Glazen flesjesnanaElke eenvoudige goedkope glazen flesjes die kunnen worden afgesloten, kunnen worden gebruikt. De flesjes kunnen na gebruik worden gereinigd met 96% ethanol om LR-White-residu te verwijderen en opnieuw worden gebruikt. 
LR-white medium grade, beddende harsAgar ScientificAGR1281LR-White is er in verschillende vormen; de medium grade biedt een voldoende snijondersteuning voor de meeste weefsels, terwijl voor hardere weefsels een hardere graad van LR-white kan worden aanbevolen. Gebruik indien mogelijk een hars die al is gemengd met de polimerisatie-activator (benzoylperoxide), zo niet, volg dan de instructies van de leverancier om de hars voor te bereiden.
Melkvrij magere melkpoederNestlénaelke melkvrije magere melk is voldoende
Ovennanagenerieke laboratoriumoven
Petrischaal, 10 cm x 10 cm vierkantnana
PIPESSigma AldrichP1851
Door ratten gegenereerd monoklonaal antilichaamPlant probesnaEr zijn verschillende antilichamen die celwandcomponenten herkennen
beschikbaar bij zowel het Complex Carbohydrate Research Center
(CCRC, Georgia University VS) en Plant Probes (Paul
Knox Cell Wall Lab, aan de Leeds University UK). Een korte lijst van
enkele veel gebruikte MABS en waar ze kunnen worden gekocht
wordt gepresenteerd in aanvullende tabel 1
Vlammesjesnanaregelmatige vlammesjes
SDSSigma-AldrichL6026
Toluidine Blauw-OAgar ScientificAGR1727
Tween 20Sigma-AldrichP9416
UltramicrotoomLeica MicrosystemsUC7
Staande epifluorescentiemicroscoop met UV- en FITC-fluorescentiefiltersLeica MycrosistemsDMLb
Vacuümkamernana
Vacuumpompnana
Vectashieldvecta LabsT-1000Andere anti-vervaging kan worden gebruikt. Controleer de compatibiliteit met FITC en de Fluorescerende ophelderder 28. (Opmerking: voor een niet-commerciële alternatief, (zie Jonhson et al 198218) Een anti-vervagingsmedium kan worden gemaakt door 25 mg/mL van 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octaan (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol te mengen tot 1xPBS. Pas de pH aan tot 8,6 met verdunde HCl.)

Referenties

  1. Keegstra, K. Plant Cell Walls. Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).
  2. Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
  3. Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
  4. Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
  5. Seifert, G., Roberts, K. The biology of arabinogalactan proteins. Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).
  6. Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
  7. Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505(2017).
  8. Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
  9. Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
  10. Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
  11. Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
  12. Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
  13. Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
  14. El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
  15. Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
  16. Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
  17. Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , Springer. Boston, MA. (2004).
  18. Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
  19. Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
  20. Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

PectinedetectieplantencelwandparaformaldehydefixatieLR White inbeddingultramicrotoom sectiefluorescentiemicroscopieCalcofluor White kleuringImageJ analyse

Gerelateerde artikelen