Methodenartikel

Ex vivo myelinisatie en remyelinisatie in cerebellaire plakculturen als kwantitatief model voor ontwikkelings- en ziekterelevante manipulaties

5.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61044

⸱

12 juni 2020

 , 
1Department of Neuroscience, Genentech Inc.

In dit artikel

Samenvatting

Gepresenteerd wordt een protocol voor een ex vivo kwantitatief model van demyelinisatie en remyelinisatie met behulp van cerebellaire plakculturen van muizen. Deze methode is een nauwkeurige samenvatting van een in vivo model met zijn volledige aanvulling van CZS-celtypen in intact weefsel, met behoud van de chemische, genetische en ecologische bruikbaarheid van een in vitro systeem.

Samenvatting

Het bestuderen van myelinisatie in vitro en in vivo brengt tal van uitdagingen met zich mee. De differentiatie van oligodendrocyt-precursorcellen (OPC's) in vitro is weliswaar schaalbaar, maar vat axonale myelinisatie niet samen. OPC-neuroncoculturen en OPC-vezelculturen maken het onderzoek van in vitro myelinisatie mogelijk, maar ze missen extra celtypen die in vivo aanwezig zijn, zoals astrocyten en microglia. In vivo muismodellen zijn echter minder vatbaar voor chemische, omgevings- en genetische manipulatie en zijn veel arbeidsintensiever. Hier beschrijven we een ex vivo muis cerebellaire plakcultuur (CSC) kwantitatief systeem dat nuttig is voor: 1) het bestuderen van ontwikkelingsmyelinisatie, 2) het modelleren van demyelinisatie en remyelinisatie, en 3) het uitvoeren van translationeel onderzoek. Sagittale secties van het cerebellum en de achterhersenen worden geïsoleerd van postnatale dag (P) 0-2 muizen, waarna ze ex vivo gedurende 12 dagen myeliniseren. Gedurende deze periode kunnen plakjes op verschillende manieren worden gemanipuleerd, waaronder het toevoegen van verbindingen om te testen op een effect op ontwikkelingsmyelinisatie. Bovendien kan weefsel worden gefixeerd voor elektronenmicroscopie om de ultrastructuur en verdichting van myeline te beoordelen. Om de ziekte te modelleren, kan CSC worden onderworpen aan acute hypoxie om hypomyelinisatie te induceren. Demyelinisatie in deze explantaten kan ook worden geïnduceerd door lysolecithine, waardoor factoren kunnen worden geïdentificeerd die remyelinisatie bevorderen. Afgezien van chemische en omgevingsmodificaties, kan CSC worden geïsoleerd uit transgene muizen en reageren op genetische manipulatie geïnduceerd met Ad-Cre adenovirussen en tamoxifen. Cerebellaire plakculturen zijn dus een snel, reproduceerbaar en kwantificeerbaar model voor het recapituleren van myelinisatie.

Inleiding

Myelinisatie van axonen maakt de snelle voortplanting van actiepotentialen mogelijk, een mechanisme dat bekend staat als saltatoire geleiding1. Het belang van myeline wordt onderstreept door demyeliniserende ziekten, zoals multiple sclerose (MS), die een breed scala aan slopende manifestaties omvatten, waaronder verlies van gezichtsvermogen, cognitieve problemen en verlamming. Er is geen remedie voor MS en de huidige therapieën richten zich op het beperken van ziekteprogressie door zich te richten op perifere immuuncellen. Invaliditeit bij MS en aanverwante ziekten wordt vermoedelijk veroorzaakt door een falen van remyelinisatie en progressieve neurodegeneratie. In het bijzonder worden demyelinisatie, atrofie en axonaal verlies waargenomen bij progressieve MS 2,3. Het bevorderen van remyelinisatie is dus een veelbelovende strategie die parallel aan de huidige behandelingen kan worden uitgevoerd en extra therapeutische voordelen kan opleveren.

In het centrale zenuwstelsel (CZS) wordt myelinisatie uitgevoerd door gespecialiseerde gliacellen die bekend staan als oligodendrocyten. Oligodendrocyt-voorlopercellen (OPC's) differentiëren tot volwassen, myeliniserende oligodendrocyten door middel van een reeks sterk georkestreerde stappen, waaronder de groei van processen die in contact komen met axonen, toename van de morfologische complexiteit, uitbreiding van het myelinemembraan en ten slotte myelineschedeverdichting4. De interactie tussen oligodendrocyten en neuronen is dus zeer intiem. Wederzijdse interacties tussen neuronen en oligodendrocyten zijn ook vereist voor de gezondheid en het onderhoud van het CZS2. Axonale activiteit speelt een rol bij het stimuleren van myelinisatie en gliale neurotrofe factoren ondersteunen de integriteit van neuronen. Het belang van glia-glia overspraak in het CZS wordt ook steeds meer erkend 5,6,7,8. Astrocytische factoren kunnen bijvoorbeeld van invloed zijn op de differentiatie van OPC's en het onderhoud van witte stofkanalen. Microglia spelen ook een rol bij het moduleren van OPC-differentiatie en bij het opruimen van myelineresten, een belangrijke stap van het remyelinisatieproces. Het identificeren van celautonome factoren en het begrijpen van de invloed van andere CZS-celtypen op demyelinisatie en remyelinisatie zal van onschatbare waarde zijn voor het ontwikkelen van therapieën voor demyeliniserende en dysmyeliniserende ziekten.

Hier beschrijven we een ex vivo systeem met behulp van cerebellaire plakculturen (CSC) van muizen dat de manipulatie en kwantificering van intact CZS-weefsel mogelijk maakt. Het gebruik van CSC maakt het mogelijk om myelinisatie, of remyelinisatie na de inductie van demyelinisatie door lysolecithine 9,10, te meten met behulp van methoden die traditioneel worden gebruikt met in vivo onderzoeken, zoals immunokleuring en elektronenmicroscopie 11,12,13. Lysolecithine is een membraanverstorende chemische stof die resulteert in een snel verlies van myeline en oligodendrocyten. Een mogelijk voorbehoud om op te merken is dat lysolecithine ook kan leiden tot de vermindering van andere celtypen in de buurt van het laesiegebied. In tegenstelling tot in vivo experimenten kunnen sagittale plakjes van het cerebellum echter gemakkelijk worden gemanipuleerd via de toevoeging van verbindingen, of genetisch worden gewijzigd met behulp van Ad-Cre adenovirussen. De methode maakt ook manipulatie mogelijk van geïsoleerd weefsel van transgene muizen of muizen die zijn blootgesteld aan milieubeledigingen zoals hypoxie 11,12,13,14. Het CSC-model maakt dus de studie van ontwikkelingsmyelinisatie, modellering van ziekten en identificatie van factoren die myelinisatie bevorderen of remmen, mogelijk, terwijl de bijdragen van verschillende CZS-celtypen aan de functie van oligodendrocyten worden geïntegreerd.

Protocol

Alle dierstudies zijn geautoriseerd en goedgekeurd door het Genentech Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Voorbereiding van media en benodigdheden voor dissectie (~30-45 min)

  1. Bereid een steriel filter voor op het kweekmedium (SCM) en het dissectiemedium (DM) zoals beschreven in tabel 1. Bewaren bij 4 °C. Als er factoren worden getest voor de myelinisatietest, voeg deze dan vlak voor gebruik toe aan de SCM.
  2. Pipetteer 1 ml SCM in elk putje van de plaat met 6 putjes.
  3. Plaats met een steriele tang een organotypisch inzetstuk in elk putje en zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder het membraan vast komen te zitten. Verwarm de plaat met media op 37 °C in een incubator met 7,5% CO2 .

2. Voorbereiding van het dissectiegebied (~5-10 min)

  1. Voer procedures uit in een steriele laminaire afzuigkap of op het werkblad met adequate aseptische technieken voor alle stappen van de procedure. Veeg alle gebieden schoon met 70% ethanol.
  2. Plaats een nieuw mes en een siliconen snijtafel op de tissuehakmolen. Pipetteer ~300 μL steriel water of 70% ethanol onder de snijfase om ervoor te zorgen dat het op zijn plaats blijft.
  3. Gebruik een wattenstaafje om het mes van de tissuehakker en de snijfase voorzichtig af te vegen met 70% ethanol. Droog af voordat u de tissuehakmolen gebruikt.
  4. Spuit alle dissectiegereedschappen in met 70% ethanol en droog ze af voor de dissectie.
  5. Bereid twee petrischaaltjes van 10 cm voor: één met 15-20 ml DM, één met 10 ml SCM. Bewaar op ijs. Bewaar alle media en petrischalen op ijs als je ze niet ontleedt.

3. Dissectie van de cerebellaire plakcultuur (~15-20 min per pup)

  1. Plaats het petrischaaltje met DM op een snijmicroscoop.
  2. Euthanaseer een muizenpup, postnatale dag P0-2, door snelle onthoofding met een scherpe schaar.
  3. Plaats de kop in het petrischaaltje met DM onder de ontleedmicroscoop om het bloed te klaren.
  4. Knip met een fijne schaar één keer aan elke zijrand aan de basis van de schedel.
  5. Met het hoofd ondersteboven in DM geplaatst, drukt u stevig op de onderkant van de schedel met behulp van een #5/45 tang, waardoor de onbeschadigde achterhersenen door het gat in de schedel worden gedwongen.
  6. Snijd onder de ontleedmicroscoop overtollig weefsel weg met behulp van twee #11 scalpels. Zorg ervoor dat het cerebellum aan het onderliggende stuk achterhersenen blijft zitten. Zie figuur 1A voor een gedetailleerd diagram.
  7. Breng met behulp van de spatel het cerebellum over naar de snijfase van de weefselhakker met het weefsel dat rust op het rostrale oppervlak van de achterhersenen en het caudale gezicht van de achterhersenen naar de onderzoeker gericht. Zorg ervoor dat het mediale vlak van de hersenen precies evenwijdig is aan het mes van de weefselhakker.
  8. Verwijder met behulp van de P200-pipet overtollig medium rond het weefsel en zorg ervoor dat het nog vochtig is, maar niet drijft of omgeven door vloeistof.
  9. Verwissel het petrischaaltje met DM onder de snijmicroscoop door het petrischaaltje met SCM.
  10. Snijd de tissue in plakjes van 350 μm dik met behulp van de tissuehakmolen.
    OPMERKING: De messnelheid (bijv. ongeveer één snede per seconde) en de kracht moeten worden geoptimaliseerd om optimale snijomstandigheden te garanderen. In zeldzame gevallen komt het weefsel vast te zitten aan het mes. Om het verlies van weefselsecties tot een minimum te beperken, houdt u de duim op de aan/uit-knop om de weefselhakmolen indien nodig snel uit te schakelen.
  11. Pipetter voorzichtig 100 μL SCM onder het weefsel, zodat de plakjes drijven. Breng het gesneden weefsel met behulp van de spatel over op de petrischaal met SCM onder een snijmicroscoop.
  12. Gebruik een wattenstaafje om het mes van de tissuehakker en de snijfase voorzichtig af te vegen met 70% ethanol.
  13. Scheid de plakjes met behulp van de scalpels (stompe kant) voorzichtig onder de snijmicroscoop. Breng met een scalpel en spatel de plakjes over naar het membraan in de plaat met 6 putjes met SCM.
    OPMERKING: De meest mediale secties hebben vaak de beste myelinisatie en weefselintegriteit. Gemiddeld kunnen 4-6 plakjes worden ontleed uit één muizenbrein.
  14. Incubeer de plakjes in SCM bij 37 °C in 7,5% CO2.

4. Veranderingen in cultuur en media (~15–30 min)

  1. Vervang de SCM om de dag.
  2. Pipetteer 1 ml vers medium in elk putje van een nieuwe plaat met 6 putjes en verwarm in een broedmachine. Breng met een steriele tang de membranen over op de nieuwe plaat en zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder zitten. Plaats de platen terug in de broedmachine.

5. Standaard myelinisatie en remyelinisatie

  1. Standaard myelinisatieprotocol (Figuur 1B).
    1. Cultuurplakken ontleed in sectie 3 van 0-12 dagen in vitro (DIV). Als het effect van een factor op myelinisatie wordt getest, voeg deze dan toe aan het medium op het moment van kweken (0 DIV) en vul deze aan bij elke mediawissel.
    2. Fix op 12 DIV (stap 7.1), een tijdpunt geoptimaliseerd voor onvolledige myelinisatie 11,12,13. Dit maakt het mogelijk om eventuele versterkende of blokkerende effecten op myelinisatie te detecteren als gevolg van de factor die aan het medium wordt toegevoegd. Een representatief positief resultaat met de toevoeging van 100 ng/ml activine A wordt weergegeven in figuur 2.
  2. Remyelinisatieprotocol (Figuur 1C)
    1. Volg het standaard myelinisatieprotocol beschreven in paragraaf 5.1 zonder aanvullende factoren tot 14 DIV, het tijdstip waarop de plakjes volledig gemyeliniseerd zijn 11,12,13.
    2. Bereid lysolecithinebouillon (125 mg/ml) zoals beschreven in tabel 1. Pipetteer 1 ml 0,5% lysolecithine in SCM in elk putje van een nieuwe plaat met 6 putjes en verwarm in een incubator.
    3. Breng de membranen over naar een lysolecithineplaat en plaats ze een nacht in een broedmachine gedurende 16-18 uur.
    4. Maak de volgende dag nieuwe borden klaar met verse SCM en voeg indien nodig eventuele factoren toe die worden getest op remyelinisatie-effecten. Warme borden in een couveuse.
    5. Tik voor het wisselen van media voorzichtig op het membraan aan de zijkant van het putje om ervoor te zorgen dat al het lysolecithinemedium is verwijderd. Vul de factor(en) die worden getest aan bij elke mediawissel (hoofdstuk 4).
    6. Repareer plakjes op 28 DIV (stap 7.1), een tijdpunt dat is geoptimaliseerd voor onvolledige remyelinisatie. Dit maakt het mogelijk om versterking of blokkering van remyelinisatie te detecteren als gevolg van de factor die aan het medium wordt toegevoegd. Een representatief positief resultaat met de toevoeging van 0,1 μM XAV939 wordt weergegeven in figuur 3.

6. Variaties op het myelinisatie- en remyelinisatieprotocol

  1. Protocol voor hypoxie-geïnduceerde hypomyelinisatie (Figuur 1D)11,13.
    OPMERKING: Dit wordt gepresenteerd als een variatie op het standaard myelinisatieprotocol dat wordt gepresenteerd in paragraaf 5.1.
    1. Plak plakjes in SCM zonder factoren.
    2. Breng de plakplaten over naar een hypoxische incubator (2% FiO2) gedurende 24 uur tussen 2-3 DIV.
    3. Bereid de volgende dag nieuwe borden voor met verse SCM en voeg indien nodig alle factoren toe die worden getest op myelinisatiepotentieel. Warme borden in een couveuse.
    4. Na de kweek in hypoxie wordt het medium verwisseld (rubriek 4) en wordt de cultuur teruggezet in een standaard kweekbroedmachine (37 °C, 7,5% CO2). Vul alle factoren die worden getest aan bij elke volgende mediawissel (sectie 4).
    5. Fixeer op 12 DIV (stap 7.1).
  2. Protocol voor genetische manipulatie (Figuur 1E)13
    1. Isoleer weefsel van transgene muizen voor dissectie zoals in sectie 3.
    2. Met induceerbare transgene muizenlijnen kan tamoxifen (100 nM, een dosis die geen myelinisatie of OPC-differentiatie induceert) of een Ad-Cre adenovirus aan SCM worden toegevoegd tijdens mediaveranderingen bij 1 DIV en 3 DIV.
    3. Na de genetische manipulatie met tamoxifen of Ad-Cre adenovirus moet de mediawisseling om de dag worden voortgezet, zoals in rubriek 4 (met toevoeging van factoren indien nodig).
      OPMERKINGEN: Alle plakjes van één muis passen op één membraan, waardoor genotypering na dissectie mogelijk is, waardoor het eenvoudig wordt om experimenten met transgene muizen uit te voeren.

7. Weefselverwerking en -analyse

  1. Fixeer plakjes door het membraan voorzichtig onder te dompelen in 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT).
  2. Spoel voorzichtig af door het onder te dompelen in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Dompel vervolgens onder in PBS in een plaat met 6 putjes.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Vaste plakjes kunnen in PBS bij 4 °C maximaal een maand worden bewaard. Als u de plakjes niet bewaart, spoel dan 2x 5 minuten in PBS voordat u verder gaat.
  3. Gebruik een scalpel om het membraan uit de ring te snijden en ga verder met kleuren in een plaat met 6 putjes. Zorg ervoor dat de plakjes naar boven wijzen (met de membraanzijde naar beneden) om ze te kleuren en vervolgens op de dia's te monteren.
  4. Blokkeer gedurende 1 uur bij RT in blokoplossing (3% door warmte geïnactiveerd paardenserum, 2% runderserumalbumine en 0,25% Triton-X 100 verdund in PBS).
    OPMERKING: Als antigeenverzameling nodig is voor antilichaamkleuring (bijv. CC1/Olig2), kan dit worden gedaan in glazen petrischalen.
  5. Wikkel de platen in paraffinefilm en incubeer een nacht bij 4 °C in primair antilichaam verdund in blokkeeroplossing.
  6. Was 3x in blokkerende oplossing: 1) kort spoelen, 2) 15 minuten wassen en 3) 1 uur wassen. Vul voor een korte spoeling een klein petrischaaltje met oplossing en dompel het membraan voorzichtig onder met een tang voordat u het overbrengt naar de verse oplossing. Voor langere wasbeurten (d.w.z. 15 minuten en 1 uur), dompel het membraan onder in oplossing in een plaat met 6 putjes en plaats het op een zachte wip.
  7. Incubeer afgedekt van licht gedurende 2 uur bij RT in secundaire antilichamen verdund 1:500 in PBS.
  8. Was 3x in PBS: 1) kort spoelen, 2) 15 minuten wassen en 3) 1 uur wassen.
  9. Als DAPI-kleuring nodig is, dompel deze dan 7 minuten onder in 1:1.000 DAPI-oplossing bij RT. Spoel kort af en was vervolgens 15 minuten in PBS.
  10. Spoel af in dubbel gedestilleerd water.
  11. Monteer de membranen op een dia met de plakjes naar boven (met de membraanzijde naar beneden).
    OPMERKING: Gemonteerde plakjes kunnen bij 4 °C worden bewaard. Beeldvorming op een confocale microscoop kan het beste binnen 1 week worden gedaan, voordat het membraan ondoorzichtig en moeilijk in beeld te brengen wordt.
  12. Afbeelding segmenteert met behulp van confocale microscopie en kwantificeert zoals eerder beschreven 11,12,13.

Resultaten

Cerebellaire plakculturen afgeleid van P0-2-muizen (Figuur 1A) werden gebruikt om myelinisatie te bestuderen en de effecten van de toevoeging van verschillende factoren van 0-12 DIV te beoordelen (Figuur 1B). Om remyelinisatie te bestuderen, werden plakculturen bij 14 DIV eerst gedemyeliniseerd met lysolecithine en lieten ze nog 14 extra dagen remyeliniseren in cultuur met de geteste factoren (Figuur 1C), waarna remyelinisatie werd gekwantificeerd. Het effect van hypoxie op myelinisatie werd ook bestudeerd door plakculturen gedurende 24 uur in een 2% FiO2 hypoxische incubator te plaatsen, van 2-3 DIV (Figuur 1D). Ten slotte werden plakculturen afgeleid van transgene muizen gebruikt om het effect van genknock-outs op myelinisatie te bestuderen. In dit systeem werd Cre-recombinatie geïnduceerd door de toevoeging van tamoxifen of Ad-Cre adenovirus bij 1 DIV en 3 DIV, en plakculturen gefixeerd voor analyse bij 12 DIV (Figuur 1E). Na fixatie van weefsels werd kwantificering van demyelinisatie en remyelinisatie uitgevoerd door middel van immunokleuring (Figuur 2, Figuur 3) en elektronenmicroscopie 11,12,13.

De getoonde representatieve gegevens (Figuur 2, Figuur 3) illustreren het dynamische bereik van myelinisatie en remyelinisatie in plakculturen. De myelinisatie-index werd gekwantificeerd door de verhouding van Caspr, een paranodale marker die een indirecte uitlezing is van compacte myeline, tot neurofilamenteiwit H (NFH), dat axonen kleurt. Deze myelinisatie-index is gevalideerd om de vorming van compacte myeline weer te geven door middel van elektronenmicroscopie en natriumkanaalkleuring12. Door lysolecithine geïnduceerde demyelinisatie 9,10 leidde tot volledige verdwijning van Caspr-positieve paranodes (myelinisatie-index = 0, figuur 3A) en verlies van compacte myeline, die werd hersteld tijdens remyelinisatie11,12.

Om een positief resultaat op myelinisatie aan te tonen, werden plakjes gekweekt met Activine A volgens de tijdlijn in Figuur 1B. Activine A activeert activinereceptoren op oligodendrocyten en stimuleert oligodendrocytendifferentiatie en myelineverdichting15. De representatieve gegevens tonen aan dat het behandelen van plakjes met 100 ng/ml activine A tijdens myelinisatie resulteerde in een hogere myelinisatie-index (figuren 2A,B). In overeenstemming hiermee versnelde de behandeling met activine A de OPC-differentiatie, zoals gekwantificeerd door de verhouding van CC1-positieve rijpe oligodendrocyten tot Olig2+ oligodendrocytlijncellen11,13 (Figuren 2C,D).

Van een kleine molecuulremmer van Tankyrase, XAV939, is aangetoond dat het myelinisatie en remyelinisatie bevordert door stabilisatie van Axin2-spiegels in oligodendrocyten11. Na behandeling met lysolecithine werd demyelinisatie gevisualiseerd en gekwantificeerd in plakculturen door gefragmenteerde myeline-basiseiwit (MBP)-kleuring en gebrek aan Caspr-positieve paranodes (Figuur 3A). Behandeling met 0,1 μM XAV939 tijdens remyelinisatie (15-28 DIV) verhoogde de myelinisatie-index significant in vergelijking met voertuigcontroles, zoals gekwantificeerd door de verhouding tussen Caspr en NFH-kleuring (Figuren 3B, C). Het plakcultuurmodel kan dus worden gebruikt om effecten op OPC-differentiatie, myelinisatie en remyelinisatie in intact weefsel te onderzoeken en te kwantificeren.

figure-results-1
Figuur 1: Schema van cerebellaire plakculturen met de belangrijkste stappen in het dissectieproces en tijdlijnen voor verschillende plakcultuurprotocollen. (A) Afbeelding van stappen om slice-culturen te genereren: dissectie van de hersenen van P0-2 muizenpups, het trimmen van de hersenen (zoals afgebeeld), het snijden van de hersenen met een weefselhakker om sagittale plakjes van 350 μm te genereren, het plaatsen van plakjes op organotypische kweekinzetstukken in een schaal met 6 putjes, en incuberen bij 37 °C en 7,5% CO2. * geeft cerebellum aan. (B) Tijdlijn voor myeliniserende plakculturen. Plakculturen werden gedurende 12 dagen geïncubeerd voordat ze werden gefixeerd voor analyse. (C) Tijdlijn voor remyeliniserende slice-culturen. De plakjes werden behandeld met lysolecithine bij 14 DIV gedurende 16-18 uur om volledige demyelinisatie te induceren en lieten remyeliniseren tot 28 DIV voordat ze werden gefixeerd voor analyse. (D) Tijdlijn voor myelinisatie na hypoxische belediging. Plakjes werden gedurende 24 uur blootgesteld aan een acute hypoxische belediging tussen 2-3 DIV, wat hypomyelinisatie veroorzaakte. (E) Tijdlijn voor CSC van genetisch gemodificeerde muizen. Tamoxifen (Tam, 100nM) of Ad-Cre-virus werd toegevoegd bij 1 DIV en 3 DIV om genetische modificatie te induceren, en plakjes werden geanalyseerd bij 12 DIV. Tijdlijndiagrammen aangepast van eerdere publicaties11,13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve gegevens waaruit blijkt dat activine A myelinisatie en OPC-differentiatie bevordert. (A) Toename van myelinisatie (MBP) en paranodes (Caspr) met 100 ng/ml Activine A-behandeling, aangetoond door immunokleuring van plakculturen. (B) Kwantificering van de myelinisatie-index (verhouding van het gebied dat is gekleurd voor Caspr+-paranodes en het gebied dat is gekleurd voor NFH+-axonen). (C) Kwantificering van OPC-differentiatie (verhouding van CC1+ oligodendrocyten tot Olig2+ oligodendrocyten afstammingscellen). (D) Representatieve beelden van CC1/Olig2-kleuring. De getoonde waarden zijn gemiddelde + standaarddeviatie. P < 0,0001; ongepaarde T-toets. Schaalbalken: A = 25 μm, D = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Representatieve gegevens waaruit blijkt dat XAV939 remyelinisatie bevordert. (A) Afbeeldingen van demyelinisatie door gefragmenteerde MBP-kleuring en afwezigheid van Caspr-paranodes in plakculturen behandeld met lysolecithine. (B) Toename van remyelinisatie (MBP) en paranodes (Caspr) met 0,1 μM XAV939-behandeling na lysolecithine-geïnduceerde demyelinisatie aangetoond door immunokleuring van plakculturen. (C) Kwantificering van de myelinisatie-index (verhouding van het gebied dat is gekleurd voor Caspr+-paranodes en het gebied dat is gekleurd voor NFH+-axonen). De getoonde waarden zijn gemiddelde + standaarddeviatie. P < 0,0001; ongepaarde T-toets. Schaalbalken = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Segment cultuur media (SCM)
VolumeReagens
100 mlMinimum Essential Media (MEM), HEPES, geen glutamine
50 mlDoor warmte geïnactiveerd paardenserum
50 mlEarle's uitgebalanceerde zoutoplossing
2 mlPenicilline-streptomycine 10.000 E/ml
2 mlGlutaMAX supplement
2888 μL45% glucose-oplossing
1 mlFungizone
Steriel filtreer door een filter van 0,22 μm en bewaar maximaal 2 weken in de koelkast van 4 °C.
Dissectie media (DM)
VolumeReagens
100 mlMEM, HEPES, met Earle's zouten
1 mlPenicilline-streptomycine 10.000 E/ml
Steriel filtreer door een filter van 0,22 μm en bewaar maximaal 2 maanden in de koelkast van 4 °C.
Lysolecithine voorraad (125 mg/ml)
AantalReagens
100 mgLysolecithine
0,8 mlSteriel PBS
Los 100 mg lysolecithine op in 0,8 ml steriel PBS. Bewaar 80 μL aliquots stockoplossing bij -20 °C.
Voor gebruik 80 μL aliquot ontdooien en oplossen in 20 ml SCM (0,5% lysolecithine in SCM), opgewarmd in 37 °C, 7,5% CO2 incubator. Indien nodig, vortex om lysolecithine op te lossen in SCM.

Tabel 1: Lijst met componenten en protocol voor het maken van plakkweekmedium (SCM), dissectiemedium (DM) en lysolecithine-oplossing.

Discussie

Dit protocol beschrijft een organotypisch cerebellair plakcultuurmodel dat in vivo cellulaire samenstelling recapituleert met de eenvoud van een in vitro model. Dit protocol zou verder kunnen worden ontwikkeld om een meer representatief model van menselijke pathologieën te worden. CSC kan mogelijk worden ontwikkeld als modellen voor ziektespecifieke verwondingen, zoals door kracht geïnduceerde weefselbeschadiging, schade veroorzaakt door myeline-specifieke antilichamen of oligodendrocytenbeschadiging bij MS met de toevoeging van perifere immuuncellen. Dit protocol kan ook worden geoptimaliseerd voor weefsel dat is ontleed uit andere delen van de hersenen en het ruggenmerg16,17. Hoewel dit protocol zich richt op de histologische kwantificering van myelinisatie, vertegenwoordigt CSC een handig model voor het onderzoeken van verschillende experimentele eindpunten. Deze culturen kunnen worden gebruikt om verschillende celtypen te karakteriseren via single-cell RNA-sequencing, de ultrastructuur van axonen en myelineschedes te beoordelen via elektronenmicroscopie en OPC-dynamiek te bestuderen door time-lapse-beeldvorming uit te voeren. Immunokleuring kan ook worden omzeild met het gebruik van transgene muisreporterlijnen18,19. Ten slotte kunnen verschillende leeftijden van muizenpups, tijd in kweek of dikte van secties worden gebruikt om CSC aan te passen om verschillende ziektemechanismen te modelleren 10,17,18,19,20,23.

Plakculturen zijn ideaal voor het testen en kwantificeren van factoren die van invloed zijn op myelinisatie en remyelinisatie, maar zijn beperkt in hun weergave van het CZS in bepaalde contexten. Afgeleid van P 0-2-hersenen, komt CSC uit hersenen die vroeg in ontwikkeling zijn en beperkte overeenkomsten vertonen met een ouder wordend of neurodegeneratief brein. Gezien een toenemend bewustzijn van het belang van myeline bij aandoeningen van het CZS, zoals de ziekte van Alzheimer21 en schizofrenie22, zijn modellen voor volwassenen of veroudering nodig voor het kwantificeren en karakteriseren van myelinisatie. Er zijn andere protocollen gepubliceerd die weefsel van oudere knaagdieren isoleren, hoewel nog steeds tijdens de ontwikkelingsstadia 10,18,19,23. Bovendien kunnen er intrinsieke en extrinsieke verschillen zijn in oligodendrocyten en OPC's in het cerebellum in vergelijking met het ruggenmerg en andere witte stofbanen in de hersenen. CSC zijn ook minder geschikt dan celgebaseerde in vitro systemen voor grootschalige CRISPR of kleine molecuul screenings. Door het eerste doorsnijden van weefsel is er ook een activering van aangeboren immuuncellen in de hersenen (d.w.z. microglia en astrocyten), een belangrijk voorbehoud bij het systeem24. Ten slotte spelen perifere immuuncellen een grote rol bij MS-pathologie25; CSC zijn verstoken van perifere cellen, tenzij deze cellen exogeen worden toegevoegd, en zijn dus geen ideaal model van het inflammatoire CZS-milieu.

Het dissectiegedeelte van dit protocol is misschien wel het meest kritische. Dissectiestappen moeten met de grootste zorg worden uitgevoerd, om het weefsel en de onderliggende structuur niet te beschadigen. Een goede uitlijning van de hersenen langs het mes van de weefselhakker zorgt voor minimale schade aan het weefsel en de cellen. Daarnaast is een zorgvuldige dissectie en scheiding van plakjes, evenals hun overdracht naar de membranen voor cultuur, belangrijk. De tijdschema's die in dit protocol worden beschreven, zijn geoptimaliseerd voor het beschreven onderzoek, maar moeten mogelijk worden aangepast voor optimale resultaten in verschillende onderzoeken. Dit protocol is nuttig voor diegenen die ontwikkelingsmyelinisatie en myelineherstel willen bestuderen.

Merk op dat er geen remedie is voor MS. Hoewel de huidige therapieën behoorlijk effectief zijn in het dempen van het adaptieve immuunsysteem, kan geen enkele huidige therapie de progressie stoppen. Aangenomen wordt dat een falen van remyelinisatie en daaropvolgende neurodegeneratie ten grondslag ligt aan de progressie van MS2. De aanwezigheid van OPC's in chronische MS-laesies suggereert dat het falen van myelineherstel te wijten kan zijn aan een stopzetting van de OPC-differentiatie. Het gebruik van CSC opent een weg naar ontdekking voor myelinehersteltherapieën die kunnen helpen de progressie van MS om te keren en de functie te herstellen. Myelinehersteltherapie kan ook helpen bij het herstel bij patiënten met een dwarslaesie, waarbij demyeliniseerde kanalen de locomotorische functie remmen26. Daarom ligt het belang van CSC in de geschiktheid ervan voor het identificeren van factoren die de demyelinisatie en remyelinisatie van zoogdieren op een relatief hoge doorvoer beïnvloeden in vergelijking met in vivo diermodellen. Hoewel veel studies primaire OPC's hebben gebruikt voor het screenen van verbindingen die de differentiatie beïnvloeden, vereist het genereren en isoleren van primaire OPC's moeizame en sequentiële immunopanning27. Bovendien recapituleren celgebaseerde assays niet de diversiteit en interactie van celtypen die in vivo aanwezig zijn. Het genereren van CSC uit muizenpups is een snel en kosteneffectief model voor het bestuderen van myelinisatie en remyelinisatie waarvoor geen dure apparatuur of verbruiksartikelen nodig zijn. Cerebellaire plakculturen vormen dus een kwantitatief model van onschatbare waarde voor het recapituleren van myelinisatie ex vivo en maken het ontdekken van geneesmiddelen en fundamenteel wetenschappelijk onderzoek mogelijk.

Openbaarmakingen

De auteurs zijn werknemers van Genentech, Inc., een lid van de Roche Group.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Yun-An Shen, Roxanne Kyauk en Chris Bohlen bedanken voor constructieve opmerkingen en input op dit artikel. Daarnaast erkennen de auteurs de bijdragen van Charles ffrench-Constant, Andrew Jarjour, Veronique Miron en David Rowitch in de vroege ontwikkeling van verwante methodologie die eerder is gepubliceerd 11,12,13.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#5/45 ForcepsFine Science Tools11251-35Dissectie-instrumenten
32% ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences50-980-495Fixeermiddel voor kleuring
45% glucose oplossingSigmaG8769Slice culture media component
6-well tissue culture platesCorning3516Plates voor culturen
Alexa Fluor Goat anti-chicken 647Thermo Fisher ScientificA21449Secundaire kleuring antilichaam
Alexa Fluor Goat anti-mouse 647Thermo Fisher ScientificA21236Secundaire kleuring antilichaam
Alexa Fluor Goat anti-rabbit 555Thermo Fisher ScientificA11006Secundaire kleuring antilichaam
Alexa Fluor Goat anti-rat 488Thermo Fisher ScientificA21428Secundaire kleuring antilichaam
Blades, Double-edge, PTFE coated Stainless steelTed Pella121-6Snijbladen
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA9418Blokkingsoplossing component
Chicken anti-NFH antibodyEncor BiotechCPCA-NF-HKleurantilichaam
Confocal MicroscopeZeissLSM780Confocal voor beeldvorming
Corning 250 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 µm poreCorning431096Voor media voorbereiding
Earl's balanced salt solutionSigmaE2888Slice culture media component
Feather chirurgisch mesFeather2976#11Dissectie-instrumenten
FungizoneThermo Fisher Scientific15290-18Dissectie media component
GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific35050-061Slice culture media component
Heat-inactivated horse serumThermo Fisher Scientific26050-88Slice culture media component
LysolecithinSigmaL4129
Lysophosphatidylcholine uit eigeelSigmaL4129Om demyelinisatie te induceren
McIlwain Tissue ChopperTed Pella10180Weefsel chopper
MEM, Hepes, geen glutamineThermo Fisher Scientific12360-038Slice culture media component
MEM, Hepes, met Earle's zoutenSigmaM7278Dissectie media component
Metalen spatelFisher Scientific470149-442Dissectie-instrumenten - buig de platte punt onder een hoek voor gebruik
Millicell Culture Plate Insert 30mm Organotypic PTFEFisherPICM0RG50Cultuur insert
Mouse anti-CC1 antibodyMilliporeOP80-100UGKleurantilichaam
Noyes veerscharenFine Science Tools15012-12Dissectie-instrumenten
PBS pH 7.4Gibco10010023Voor verdunning van fixeermiddel
Penicilline-streptomycine 10.000U/mLThermo Fisher Scientific15140-122Slice culture media component
Rabbit anti-Caspr antibodyAbcamab34151Kleurantilichaam
Rabbit anti-Olig2 antibodyMilliporeAB9610Kleurantilichaam
Rat anti-MBP antibodySerotecMCA409SKleurantilichaam
Scalpel handvat #3Fine Science Tools10003-12Dissectie-instrumenten
Siliconen rubber schuimbladMSC Industrial Direct Co31939176Snijbasis
Stereo MicroscopeOlympus Life SciencesSZ61Microscoop voor dissecties
Student chirurgische schaarFine Science Tools91401-12Dissectie-instrumenten

Referenties

  1. Purves, D., Augustine, G. J., Fitzpatrick, D. Increased Conduction Velocity as a Result of Myelination. Neuroscience 2nd edition. , Sunderland (MA): Sinauer Associates. (2001).
  2. Dutta, R., Trapp, B. D. Mechanisms of neuronal dysfunction and degeneration in multiple sclerosis. Progress in Neurobiology. 93 (1), 1-12 (2011).
  3. Trapp, B. D., Nave, K. A. Multiple sclerosis: an immune or neurodegenerative disorder? Annual Review of Neuroscience. 31, 247-269 (2008).
  4. Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 37-53 (2010).
  5. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71(2016).
  6. Nave, K. A., Werner, H. B. Myelination of the nervous system: mechanisms and functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).
  7. Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin – from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
  8. Molina-Gonzalez, I., Miron, V. E. Astrocytes in myelination and remyelination. Neuroscience Letters. 713, 134532(2019).
  9. Keough, M. B., Jensen, S. K., Yong, V. W. Experimental demyelination and remyelination of murine spinal cord by focal injection of lysolecithin. Journal of Visualized Experiments. (97), e52679(2015).
  10. Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).
  11. Fancy, S. P., et al. Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination. Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).
  12. Yuen, T. J., et al. Identification of endothelin-2 as an inflammatory factor that promotes CNS remyelination. Brain. 136, 1035-1047 (2013).
  13. Yuen, T. J., et al. Oligodendrocyte-encoded HIF function couples postnatal myelination and white matter angiogenesis. Cell. 158 (2), 383-396 (2014).
  14. Stokes, C. E., Murphy, D., Paton, J. F., Kasparov, S. Dynamics of a transgene expression in acute rat brain slices transfected with adenoviral vectors. Experimental Physiology. 88, 459-466 (2003).
  15. Dillenburg, A., et al. Activin receptors regulate the oligodendrocyte lineage in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (6), 887-906 (2018).
  16. Dean, J. M., et al. An organotypic slice culture model of chronic white matter injury with maturation arrest of oligodendrocyte progenitors. Molecular Neurodegeneration. 6, 46(2011).
  17. Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research. Experimental Neurology. 230 (1), 138-148 (2011).
  18. Hill, R. A., Medved, J., Patel, K. D., Nishiyama, A. Organotypic slice cultures to study oligodendrocyte dynamics and myelination. Journal of Visualized Experiments. (90), e51835(2014).
  19. Sherafat, A., Hill, R. A., Nishiyama, A. Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Proliferation, Fate, and Myelination. Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1791, 145-156 (2018).
  20. Croft, C. L., Noble, W. Preparation of organotypic brain slice cultures for the study of Alzheimer's disease. F1000Research. 7, 592(2018).
  21. Nasrabady, S. E., Rizvi, B., Goldman, J. E., Brickman, A. M. White matter changes in Alzheimer's disease: a focus on myelin and oligodendrocytes. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 22(2019).
  22. Flynn, S. W., et al. Abnormalities of myelination in schizophrenia detected in vivo with MRI, and post-mortem with analysis of oligodendrocyte proteins. Molecular Psychiatry. 38, 811-820 (2003).
  23. Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments. (145), e59163(2019).
  24. Gerlach, J., Donkels, C., Münzner, G., Haas, C. A. Persistent Gliosis Interferes with Neurogenesis in Organotypic Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 131(2016).
  25. Reich, D. S., Lucchinette, C. F., Calabresi, P. A. Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 378 (2), 169-180 (2018).
  26. Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Locomotor deficits induced by experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination. Brain. 120, 27-37 (1997).
  27. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. , 854-868 (2013).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Cerebellaire slice-cultuuroligodendrocyten-precursorcellenontwikkelingsmyelinisatiedemyelinisatie remyelinisatieelektronenmicroscopieacute hypoxielysolecithinebehandelingtransgene muizenAd-Cre adenovirus

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.