Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Dubbel in utero-elektroporatie om tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te targeten

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61046

⸱

14 juni 2020

 ,  ,  , 
1Estructura de Recerca Interdisciplinar en Biotecnología y Biomedicina (ERI BIOTECMED), Departamento de Biología Celular, Biología Funcional y Antropología Física, Universidad de Valencia

In dit artikel

Samenvatting

Dubbel in utero elektroporatie maakt het richten van celpopulaties die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden. Deze techniek is nuttig om interacties tussen die celpopulaties te visualiseren met behulp van fluorescerende eiwitten in normale omstandigheden, maar ook na functionele experimenten om genen van belang te verstoren.

Samenvatting

In utero elektroporatie is een in vivo DNA-overdracht techniek op grote schaal gebruikt om de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan zoogdier corticogenese te bestuderen. Deze procedure maakt gebruik van de hersenventrikels om de introductie van DNA van belang mogelijk te maken en maakt gebruik van een paar elektroden om de ingang van het genetisch materiaal in de cellen langs de ventrikel, de neurale stamcellen, te leiden. Deze methode stelt onderzoekers in staat om de gewenste cellen te labelen en/of de expressie van genen van belang in die cellen te manipuleren. Het heeft meerdere toepassingen, waaronder tests gericht op neuronale migratie, lineage tracing, en axonale pathfinding. Een belangrijk kenmerk van deze methode is de temporele en regionale controle, waardoor het omzeilen van mogelijke problemen in verband met embryonale dodelijkheid of het ontbreken van specifieke CRE-bestuurdersmuizen mogelijk is. Een ander relevant aspect van deze techniek is dat het helpt om de economische en temporele beperkingen die het genereren van nieuwe muislijnen te betrekken aanzienlijk verminderen, die bijzonder belangrijk worden in de studie van interacties tussen celtypen die afkomstig zijn uit verre gebieden van de hersenen op verschillende ontwikkelingsleeftijden. Hier beschrijven we een dubbele elektroporatiestrategie die het mogelijk maakt om celpopulaties te targeten die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden zijn. Met deze aanpak kunnen we verschillende subtypes van cellen op verschillende locaties labelen met geselecteerde fluorescerende eiwitten om ze te visualiseren, en/of we kunnen genen van belang manipuleren die door deze verschillende cellen op de juiste tijdstippen worden uitgedrukt. Deze strategie verbetert het potentieel van in utero elektroporatie en biedt een krachtig hulpmiddel om het gedrag van tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te bestuderen die migreren om nauwe contacten te leggen, evenals lange-afstandsinteracties door middel van axonale projecties, waardoor de temporele en economische kosten worden verminderd.

Inleiding

De hersenschors is een zeer complexe en ingewikkeld georganiseerde structuur. Om een dergelijke mate van organisatie te bereiken, corticale projectie neuronen gaan door middel van complexe ontwikkelingsprocessen die hun temporele generatie vereisen, migratie naar hun eindbestemming in de corticale plaat, en de oprichting van korte- en lange afstand verbindingen1,2. Lange tijd was de klassieke manier om corticogenese te bestuderen gebaseerd op het gebruik van knock-out- of knock-in murinemodellen van genen van belang. Deze strategie, en met name het gebruik van voorwaardelijke knock-outmuizen, is echter tijdrovend en duur en levert soms extra problemen op met betrekking tot het bestaan van genetische redundantie of het ontbreken van specifieke CRE-drivers, onder andere kwesties. Een van de benaderingen die ontstond om te proberen deze problemen aan te pakken en die tegenwoordig op grote schaal wordt gebruikt om corticale ontwikkeling te bestuderen is in utero elektroporatie3,4. In utero elektroporatie is een techniek die wordt gebruikt voor somatische transgenese, waardoor in vivo targeting van neurale stamcellen en hun nakomelingen. Deze methode kan worden gebruikt om cellen te labelen door de expressie van fluorescerende eiwitten5,6, voor genmanipulatie in vivo (d.w.z. winst of verlies van functietesten)7,8,9, voor het isoleren van elektrogevormde cortices in vitro en culturing cellen8,10. Bovendien, in utero elektroporatie maakt tijdelijke en regionale controle van het beoogde gebied. Deze techniek heeft tal van toepassingen en is op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van neuronale migratie, stamceldeling, neuronale connectiviteit, en andere onderwerpen8,9,11,12.

Het huidige manuscript beschrijft het gebruik van een in utero elektroporatie variant, dubbel genoemd in utero elektroporatie, om de interacties van cellen in de hersenschors met verschillende temporele en ruimtelijke oorsprong te analyseren. Deze studies zijn uiterst complex om te voltooien bij het gebruik van murine modellen, omdat ze het gecombineerde gebruik van verschillende transgene lijnen vereisen. Enkele van de toepassingen van het protocol beschreven in dit document omvatten de studie van nauwe interacties tussen naburige cellen, evenals interacties tussen verre cellen door middel van lange afstand projecties. De methode vereist het uitvoeren van twee onafhankelijke in utero elektroporatie operaties, tijdelijk gescheiden en ruimtelijk, op dezelfde embryo's om verschillende cel populaties van belang te richten. Het voordeel van deze aanpak is de mogelijkheid van het manipuleren van de genfunctie in een of beide soorten neuronen met behulp van wilde type dieren. Bovendien kunnen deze functionele experimenten worden gecombineerd met de expressie van cytoplasmatische of membraangelabelde fluorescerende eiwitten om de fijne morfologie van gerichte cellen, inclusief dendrieten en axonen, te visualiseren en mogelijke verschillen in cellulaire interacties te analyseren in vergelijking met een controle (d.w.z. cellen die alleen zijn gelabeld met het fluorescerende eiwit).

Het hier afgebakende protocol is gericht op de studie van cellulaire interacties binnen de neocortex, maar deze strategie kan ook worden gebruikt om interacties met extracortical gebieden te onderzoeken die kunnen worden gericht met behulp van utero-elektroporatie, zoals het subpallium of de thalamus13,14, of celcelinteracties in andere structuren, zoals het cerebellum15. Targeting van verschillende gebieden is gebaseerd op de oriëntatie van de elektroden en op de ventrikel waar het DNA wordt geïnjecteerd (laterale, derde of vierde). Met de hier beschreven strategie kunnen we een aanzienlijk aantal cellen labelen, wat handig is om algemene veranderingen in connectiviteit/innervatie in functionele experimenten te evalueren. Niettemin, om fijne veranderingen in connectiviteit te bestuderen, kan men gewijzigde versies van in utero elektroporatie gebruiken om sparser het etiketteren te krijgen en enige cellen16te identificeren. Samengevat, dubbel in utero elektroporatie is een veelzijdige methode die het mogelijk maakt gericht tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties en het bestuderen van hun interacties in detail, hetzij in controleomstandigheden of in combinatie met functionele experimenten, aanzienlijk verminderen van tijdelijke en economische kosten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De hierin beschreven procedure is goedgekeurd door de ethische commissie belast met experimenten, het dierenwelzijn van de Universidad de Valencia en de Conselleria de Agricultura, Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Transición Ecológica of the Comunidad Valenciana, and adheres to the guidelines of the International Council for Laboratory Animal Science (ICLAS) reviewed in the Real Decreto 53/2013 of the Spanish legislation as in the Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council.

OPMERKING: Dit protocol omvat twee verschillende doeleinden: 1) de eerste studie, aangeduid als "strategie A", maakt de analyse van de interacties tussen Cajal-Retzius cellen (CR-cellen) en early-born corticale projectie neuronen binnen dezelfde hersenhald; 2) de tweede studie, "strategie B", wordt uitgevoerd om de innervatie van de bovenste laag callosale projectieneuronen aan de contralaterale kant van de neocortex te onderzoeken.

1. Voorbereiding van de prechirurgie

  1. DNA-voorbereiding
    1. Transformeer chemisch of elektrocompetent E. coli DH5α cellen met de plasmiden van belang, plaat ze op LB agar platen met het juiste antibioticum, en incubeer ze 's nachts bij 37 °C.
      OPMERKING: Alle plasmiden die hier worden gebruikt bevatten de algemene promotor voor kip β-actin (CAG) die de expressie van een fluorescerend-reporter eiwit (CAG-mCherry en CAG-EGFP voor strategie A en CAG-BFP en CAG-nEGFP-2A-mtdTomato voor strategie B) aandrijft. Ze bevatten allemaal weerstand tegen ampicilline (AMP).
    2. Kies individuele kolonies uit elke plasmidetransformatie en start een starter vloeibare cultuur in 2 mL Luria bouillon + ampicillin (LB+AMP) in bacteriële kweekbuizen tijdens 3−4 h bij 37 °C met krachtig schudden (200 rpm). Daarna, stel een grotere bacteriële cultuur in een 500 mL Erlenmeyer kolf toe te voegen 200 mL van LB + AMP en 1 mL van de starter cultuur. Incubeer 's nachts bij 37 °C in de orbitale shaker bij 200 rpm.
    3. Gebruik een endotoxine-vrije maxi-prep kit (Tabel van materialen) volgens de instructies van de fabrikant om zuiver en geconcentreerd plasmide DNA te verkrijgen uit de vloeibare culturen. Resuspend het DNA in ~50−100 μL endotoxinevrije Tris-EDTA buffer (TE) om concentraties van ten minste 5 μg/μL te verkrijgen.
    4. Bereid voor elke operatie een oplossing voor met een eindvolume van 10 μL met 1 μL snelle groene kleurstof, plasmide DNA-oplossing van belang voor een uiteindelijke concentratie van 1 μg/μL voor elke plasmide en endotoxinevrije TE-buffer. Meng bijvoorbeeld 1 μL snelle groene kleurstof, 2 μL van een 5 μg/μL plasmide DNA-oplossing en 7 μL TE-buffer.
  2. Het trekken van Pipette
    1. Trek borosilicaatglazen haarvaten (1/0,58 mm buiten/binnendiameter) in een verticale micropipettrekker tot de punt een lengte van 1−1,5 cm bereikt en snijd deze met behulp van ontledende tangen onder een hoek van ongeveer 30° onder een ontleden toepassingsgebied.
  3. Chirurgie kamer setup
    1. Leg alle apparatuur op de operatietafel (d.w.z. pincet, schaar, tang, micropipetten, naald en naaldhouder). Zet het verwarmingskussen aan en bedek het met een steriel chirurgisch absorberend kussen. Zorg ervoor dat het reservoir in de machine voor inademing anesthesie is gevuld met isofluraan, de zuurstoftank voldoende zuurstof bevat en het systeem goed functioneert.
      OPMERKING: De operatiekamer en het resistente materiaal moeten zo steriel mogelijk worden gehouden (d.w.z. al het materiaal moet vóór de operatie worden geautolaveerd en oppervlakken moeten worden ontsmet met 70% ethanol). Platina elektroden moeten eerst zorgvuldig worden ontsmet met kiemdodende zeep en ten tweede met 70% ethanol voorafgaand aan de operatie.
    2. Bereid 100 mL van 0,9% (w/v) steriele zoutoplossing met penicilline-streptomycine 1:100 en vul een petrischaaltje van 10 cm. Leg de plaat bovenop het verwarmde pad om de oplossing op te warmen.
    3. Vul een spuit van 1 mL met 150 μL pijnstillende oplossing (bijvoorbeeld 0,1 mg/kg buprenorfine).
    4. Laad de getrokken pipet met 5 μL van de uiteindelijke plasmide DNA-oplossing bereid in stap 1.1.4. Sluit de capillaire aan op een mondgestuurde aspiratorbuis.

2. Eerste in utero elektroporatie chirurgie

  1. Plaats een E11.5 (strategie A) of E13.5 (strategie B) C57BL/6 zwangere muis in een gesloten inductiekamer met 2,5% (v/v) isoflurane op 0,8 L/min en wacht tot deze verdoofd is. Breng de muis naar het verwarmingskussen en zet zijn neus in een masker voor constante levering van isoflurane. Controleer op de afwezigheid van een pedaalreflex als indicator van de juiste anesthesie.
    OPMERKING: Embryonic leeftijd wordt bepaald op basis van de dag waarop de vaginale plug wordt waargenomen (E0.5).
  2. Injecteer het zwangere vrouwtje met de pijnstillende oplossing (0,1 mg/kg buprenorfine) onderhuids. Om te voorkomen dat de ogen drogen tijdens de procedure, breng een druppel oogzalf in elk oog met behulp van een wattenstaafje.
  3. Scheer de muis buikstreek met een elektrisch scheerapparaat en was het 2x met 70% (v/ v) ethanol doekjes, een keer met jodium doekjes, en een laatste keer met een ethanol doekje.
  4. Gebruik een schaar om een 30 mm lange incisie te maken door de huid in de rechterkant van het dier en zorgvuldig scheiden van de aangrenzende huid van de spier met een stompe spatel. Maak daarna een tweede incisie in de buikwand.
  5. Bedek de buik met een stuk gevouwen tissuepapier dat eerder is ontsmet met 70% ethanol met een 40 mm lange spleet in het midden. Trek de baarmoeder voorzichtig uit de buikholte met ringkrachten.
    LET OP: De baarmoeder moet nat worden gehouden met de warme zoutoplossing die tijdens stap 1.3.2 tijdens de hele procedure wordt bereid.
  6. Laad de getrokken pipetten voor met de DNA-oplossing bereid in stap 1.1.4. Injecteer ~0,5 μL van de DNA-oplossing per embryo in de laterale ventrikel van het geselecteerde halfrond met behulp van de mondgestuurde aspiratorbuis totdat de snelle groene kleurstof merkbaar is in de ventrikel.
  7. Plaats de platinae elektroden van het type Tang lateraal rond het hoofd van het geïnjecteerde embryo (zoals te zien is in figuur 1A en figuur 2A). Oriënteer de elektroden om het gewenste hersengebied te targeten. Richt de positieve pool naar de mediale wand om de corticale zoom (strategie A) te elektroporen of naar de laterale cortex (strategie B) om cellen die in dat gebied worden gegenereerd te labelen.
    OPMERKING: In alle gevallen moeten het hart en de placenta worden vermeden om de embryonale overleving te garanderen.
  8. Pas de specifieke volgorde van elektrische pulsen aan met een vierkante golfeletroporator volgens de indicaties in tabel 1 (strategie A E11.5 embryo's: vier pulsen van 25 V en 40 ms, gescheiden door intervallen van 950 ms; strategie B E13.5 embryo's: vijf pulsen van 35 V en 60 ms, met intervallen van 950 ms).
  9. Plaats de baarmoeder voorzichtig terug in de buikholte met tangen, vul deze met warme zoutoplossing en sluit de buikwand met een naald 6-0 hechting. Sluit je aan bij de twee zijden van de initiële incisie gemaakt in de huid, hetzij met behulp van een naald 6-0 hechting of hechting clips.
  10. Houd het dier op het verwarmingskussen en houd het in de gaten tot het herstel van de anesthesie. Zorg voor een extra dosis analgesie (150 μL)   in een hydrogeloplossing die in de thuiskooi is geplaatst.
  11. 24 uur na de operatie, een extra dosis analgesie (150 μL) toedienen. Blijf dagelijks controleren door visuele inspectie voor mogelijke pijn en nood. Observeer het gedrag van het dier, test zijn normale achterpootreflexen en inspecteer de hechting op mogelijke tekenen van schade als gevolg van het likken of krabben van de wond.

3. Tweede in utero elektroporatie

  1. Twee dagen na de eerste operatie herhaalt u stap 2.1−2.3. Hoewel het herstel van zwangere vrouwen na de operatie zeer goed is, controleer dan of ze normaal gedrag vertonen en geen tekenen van pijn of angst vertonen voordat ze de tweede operatie uitvoeren (E13.5 embryo's voor strategie A en E15.5 voor strategie B).
  2. Maak een 30 mm lange incisie door de huid zoals in stap 2.4 en een tweede incisie aan de buikwand, dit keer in de linkerkant van het dier. Stel de baarmoeder zorgvuldig bloot bovenop een gedesinfecteerd weefsel zoals beschreven in stap 2.5.
    LET OP: Zorg ervoor dat u zich niet bemoeit met de incisie die eerder aan de andere kant is gemaakt.
  3. Injecteer ongeveer 0,5 μL per embryo van de DNA-oplossing in de laterale hersenventaarde van de hemisfeer die eerder geëlektrpoleerd werd in het geval van strategie A en in de laterale hersenventaarde van de contralaterale hemisfeer voor strategie B.
    OPMERKING: Gebruik alleen embryo's met een normale ontwikkeling en geen tekenen van reabsorptie.
  4. Plaats de elektroden rond het hoofd van het embryo zoals beschreven in stap 2.7, het sturen van de positieve elektrode naar de laterale cortex en de juiste pulsen toepassen volgens de indicaties in tabel 1 (strategie A E13.5 embryo's: vijf pulsen van 35 V en 60 ms gescheiden door 950 ms intervallen; strategie B E15.5 embryo's: vijf pulsen van 50 V en 80 ms gescheiden door 950 ms intervallen).
  5. Ga verder en rond de operatie af zoals beschreven in stap 2.8−2.10.

4. Weefseloogst en -sectie

  1. Strategie A
    1. Vier dagen na de tweede elektroporatie (E17.5) voert cervicale dislocatie van het zwangere vrouwtje uit en plaatst u deze in een supinepositie.
    2. Maak met behulp van een schaar een ventrale incisie om de baarmoederhoorns te extraheren en leg ze met tangen in een petrischaal gevuld met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs.
      LET OP: De lage temperatuur maakt de verdoving van de embryo's mogelijk.
    3. Met behulp van een pincet, haal de embryo's uit de vruchtzak en breng ze met tangen naar een nieuwe PBS-gevulde Petri schotel onder een ontleden toepassingsgebied. Houd het hoofd van de embryo's voorzichtig vast met tangen en voer hersendissectie met een pincet om eerst de huid boven het hoofd en vervolgens de schedel te verwijderen. Gebruik een spatel te trekken uit de blootgestelde hersenen.
    4. Verzamel de hersenen met een lepel en deponeer ze in een 48 put plaat gevuld met de fixatieve oplossing (4% [w / v] paraformaldehyde [PFA] in 1x PBS). Test onmiddellijk op de succesvolle uitkomst van beide elektroporaties door de hersenen te onderzoeken met behulp van bijvoorbeeld een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop.
    5. Fixeer de embryonale hersenen 's nachts bij 4 °C in een orbitale shaker. Was met 1x PBS om sporen van PFA te elimineren. Breng ze vervolgens over naar PBS met schimmeldodende conserveringsmiddelen (1x PBS-0,05% (w/v) natriumadium).
      LET OP: PFA en natrium azide zijn cytotoxische verbindingen die speciale voorzorgsmaatregelen vereisen tijdens het gebruik ervan.
    6. Sluit de gefixeerde hersenen in 4% (w / v) laag smeltpunt agarose in 1x PBS en wacht ~ 10 min totdat het stolt. Plak ze aan de vibratome weefsel houder met behulp van cyanoacrylaat lijm met de reuklampen naar boven gericht om coronale secties te verkrijgen.
    7. Start het vibratome en selecteer de gewenste parameters: 100 μm breedte, 0,60 μm/s snelheid en 0,60 mm amplitude.
    8. Zet de hersenen in de vibratomecontainer vast, vul deze met 1x PBS-oplossing en begin met het verzamelen van coronale seriële secties met behulp van een borstel in een 48 putplaat gevuld met 1x PBS-0,05% (w/v) natriumachode om een volledige weergave van de hersenen te hebben (bijvoorbeeld ongeveer zeven secties per put en zes putten per embryo).
    9. Monteer de gewenste secties in microscoopglazen dia's met behulp van een fijne borstel. Bedek ze met glazen hesjes. Voor langdurige opslag toe te voegen montage medium, die fotobleaching en fotooxidatie voorkomt. Observeer de dia's onder een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop om de werkzaamheid van elektroporatie te beoordelen.
  2. Strategie B
    1. Laat de pups die eerder geëlektrooeerd waren op E13.5 en E15.5 geboren worden en wacht tot P15 om transcardiale perfusie uit te voeren met dezelfde fixatieve oplossing die in stap 4.1.4 wordt gebruikt.
    2. Vlak voor perfusie, intraperitoneally toedienen van een dosis van 75/1 mg/kg ketamine/medetomidine. Wanneer de pedaalreflex verloren gaat, bevestigt u de muis in een supinepositie en maakt u een ventrale incisie na de middenlijn met behulp van een schaar om zowel de ribbenkast als het middenrif bloot te leggen.
    3. Snijd het middenrif en open de ribbenkast om toegang te krijgen tot het hart. Houd de ribbenkast vast met een hemostat en maak een incisie in het rechteratrium met een fijne schaar.
    4. Penetreer de linker ventrikel met een naald verbonden met een flexibele buis met een peristaltische perfusiepomp. Start transcardiale perfusie, het leveren van ten minste 25 mL van 4% PFA bij een constante flux van 5,5 mL /min (totale tijd ~ 5 min).
    5. Ontleed de hersenen van geperfuseerde dieren. Verwijder eerst de huid over het hoofd met een schaar en tang. Begin met het snijden van de schedel met behulp van een schaar en zorgvuldig trek delen van de schedel botten totdat ze volledig zijn verwijderd. Ten slotte, extract de hersenen met behulp van een spatel.
    6. Breng de hersenen naar een 24 put plaat en bevestig ze met 4% PFA 's nachts op 4 °C op een orbitale shaker. Stop fixatie door PFA te vervangen door 0,05% (w/v) natriumaproide in PBS.
      LET OP: Zoals aangegeven in stap 4.1.5 is het raadzaam om een tussenwas uit te voeren met 1x PBS.
    7. Herhaal stap 4.1.6−4.1.9, het veranderen van de vibratome parameters voor postnatale hersenen (40 μm breedte, 1,20 μm/s snelheid en 0,5 mm amplitude).
      OPMERKING: Immunohistochemie of immunofluorescentie kan worden uitgevoerd om specifieke celmarkers te detecteren of het signaal van fluorescerende eiwitten die bij elektroporatie worden gebruikt, te verbeteren.

5. Confocale fluorescentie beeldvorming en analyse

  1. Zet de confocale microscoop aan, plaats de microscoopdia's met de gemonteerde hersensecties op de microscoopdia's en selecteer de kanalen waarop fluorescentiebeelden worden genomen (d.w.z. 420−460 nm voor BFP, 490−540 nm voor GFP en 570-620 nm voor mCherry en tdTomato).
  2. Voer voorbeeldscans uit om kaartafbeeldingen van elke hersensectie op twee verschillende golflengten te verkrijgen voor een algemeen beeld van de dubbele elektroporatieoutput. Als u klaar bent, selecteert u de 10x-lens en de multi-area-Z-stack-timelapse-observatiemodus. Dit zal het mogelijk maken de programmering van de automatische verwerving van fluorescentie beelden op verschillende XYZ lokalisaties binnen hersensecties.
  3. Stel in elk van de gekozen gebieden (XY) de juiste beeldvormingsparameters in (d.w.z. laserintensiteit, fotomultipliergevoeligheid en een minimale resolutie van 1.024 x 1.024), evenals de diepte van het scannen (Z) volgens de vlakken van het monster waar fluorescentie zichtbaar is.
  4. Verkrijg afbeeldingen met een lage vergroting (10x) van alle gekozen regio's en exporteer ze van OIF naar TIFF-formaat met behulp van de software voor microscoopviewer.
  5. Verander in de 60x lens, herhaal stap 5.3 en leg beelden met een hoge vergroting vast om de celcelinteracties op een meer gedetailleerde manier te observeren. Exporteer ze zoals aangegeven in stap 5.4.
  6. Open de verworven beelden met alle beeldvormingssoftware (bijvoorbeeld Fiji) voor verdere analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Interacties tussen naburige cellen zijn ontstaan op distale plaatsen en op verschillende tijdstippen: Cajal-Retzius cellen (CR-cellen) en vroege migrerende corticale projectie neuronen (strategie A)

De interactie van CR-cellen en vroege corticale projectieneuronen werd eerder beschreven als noodzakelijk om somale translocatie via nectin en cadherine adhesiemoleculen te reguleren met behulp van een dubbele elektroporatiestrategie8. CR-cellen zijn afkomst...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De studie van celcelinteracties in vivo in regio's met een hoge cellulaire dichtheid zoals de hersenschors is een complexe taak. Traditionele benaderingen, waaronder het gebruik van antilichamen om neurites te etiketteren, zijn niet geschikt vanwege het ontbreken van specifieke markers voor verschillende celpopulaties. Het gebruik van transgene murinemodellen, waarbij een bepaald celtype een fluorescerend eiwit uitdrukt, is nuttig om de neuronale processen te visualiseren, maar dit hangt af van de beschikbaarheid van der...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Cristina Andrés Carbonell en leden van de Animal Care-faciliteit van de Universidad de Valencia voor technische bijstand. We willen ook Isabel Fariñas en Sacramento R. Ferrón bedanken voor reagentia en het delen van hun apparatuur met ons. I.M.W wordt gefinancierd door een Garantía Juvenil contract uit de Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D wordt gefinancierd door de Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz heeft een Ramón y Cajal Grant (RYC-2015-19058) van het Spaanse Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICINN). Dit werk werd gefinancierd RYC-2015-19058 en SAF2017-82880-R (MICINN).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ampicillin natriumzoutSigma-AldrichA9518-25G
AspiratiebuisSigma-AldrichA5177-5EA
Baby-mixter hemostaat (perfusie)Fine Science Tools (FST)13013-14
Borosilikatiet glas capillairWPI1B100-6
Buprenorfine (BUPREX 0,3 mg/ml)Rb Pharmaceuticals Limited921425
CAG-BFP plasmidVriendelijk verstrekt door U.Müller Lab
CAG-EGFP plasmidVriendelijk verstrekt door U.Müller Lab
CAG-mCherry plasmidVriendelijk verstrekt door U.Müller Lab
CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmidVriendelijk verstrekt door U.Müller Lab
Confocale microscoopOlympusFV10i
WattenstaafjesBFHCVDF
CyanoacrylaatlijmB. Braun Surgical1050044
DissectiemicroscoopZeissstemi 305
Dumont Pincet #5 Fijn PincetFine Science Tools (FST)11254-20
ECM830 Square Wave ElectroporatorBTX45-0052
Elektrisch ScheerapparaatOster76998
Endotoxin-vrije TE bufferQIAGEN1018499
Ethanol doekjesBFHCVDF
Extra Fijn Graefe PincetFine Science Tools (FST)11150-10
OogzalfAlcon682542.6
Fast Green kleurstofSigma-AldrichF7252-5G
Fijne SchaarFine Science Tools (FST)14069-09
Fluorescentie LEDsCoolLEDpE-300-W
Genopure Plasmid Maxi KitRoche3143422001
Halsted-Mosquito Hemostaat (naad)Fine Science Tools (FST)91308-12
VerwarmingskussenUFESAAL5514
Omgekeerde epifluorescentiemicroscoopNikonEclipse TE2000-S
Jodium doekjesLorsoul
Isofluoraan verdamperFlow-MeterA15B5001
IsofluraanKarizoo586259
Ketamine (Anastemine)Fatro Ibérica SL583889-2
Kimtech precisiedoekjesKimberly-Clark7252
LB (Lennox) Agar GENLabkemAGLB-00P-500
LB (Lennox) bouillon GENLabkemLBBR-00P-500
Laag smeltpunt agaroseFisher ScientificBP165-25
Medetomidine (Sedator)Dechra573749.2
Microscoop dekvlakkenMenel-Gläser15747592
MicroscoopglazenLabboxSLIB-F10-050
MontagemediumElectron Microscopy Sciences17984-25
Mutiwell platen (24)SPL Life Sciences32024
Mutiwell platen (48)SPL Life Sciences32048
NaCl (voor zoutoplossing)Fisher Scientific10112640
Naald 25 G (BD Microlance 3)Becton, Dickinson and Company300600
Orbitale incubator S150Stuart Scientific5133
P Selecta IncubatorJ. P. Selecta, s.a.0485472
ParaformaldehydePanReac AppliedChemA3813
Penicilline-StreptomycineSigma -AldrichP4333
Peristaltiek perfusiepompCole-ParmerEW-07522-30
Platinum Tweezertrode, 5 mm DiameterBtx45-0489
Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, doos van 100AgnThos203-1000
Reflex Skin Closure System - Clip Toepasser, 7mmAgnThos204-1000
Ring PincetFine Science Tools (FST)11103-09
NatriumazietPanReac AppliedChem122712-1608
Chirurgische absorberende pad (sterieel)HK SurgicalPD-M
Naad (Surgicryl PGA 6-0)SMI Suture MaterialsBYD11071512
Spuit 1ml (BD plastipak)Becton, Dickinson and Company303172
Weefselkweekschaal 100 x 20 mmFalcon353003
Verticale Micropipet PullerSutter Instrument CoP-30
Verticale microscoopNikonEclipse Ni
VibratomeLeicaVT1200S

Referenties

  1. Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102(2017).
  2. Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
  7. Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
  8. Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
  9. Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
  10. Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
  11. Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
  12. Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
  13. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
  14. Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
  15. Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
  16. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139(2017).
  17. Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
  18. Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
  19. Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
  20. Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
  21. Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
  22. Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
  23. Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
  24. Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
  25. Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
  26. Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
  27. Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36(2017).
  28. DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29(2011).
  29. Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Dubbele elektroporatieneurale stamcellencorticogenese-studieneuronale migratielineage tracingaxonale padvindingembryonale herseninjectieelektroporatie-elektrodenfluorescent eiwitlabeling
Dubbel in utero-elektroporatie om tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te targeten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.