Snelle, naadloze generatie recombinante poxvirussen met behulp van Host Range en Visuele Selectie

Summary

Dit is een methode om "scarless" recombinant vaccinia virussen te genereren met behulp van host-range selectie en visuele identificatie van recombinante virussen.

Abstract

Vaccinia virus (VACV) was instrumenteel in de uitroeiing van variola virus (VARV), de veroorzaker van pokken, uit de natuur. Sinds het eerste gebruik als vaccin is VACV ontwikkeld als vector voor therapeutische vaccins en als oncolytisch virus. Deze toepassingen maken gebruik van VACV's gemakkelijk gemanipuleerde genoom en brede host bereik als een uitstekend platform om recombinante virussen te genereren met een verscheidenheid aan therapeutische toepassingen. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om recombinant VACV te genereren, waaronder markerselectiemethoden en tijdelijke dominante selectie. Hier presenteren we een verfijning van een selectiemethode voor het hostbereik in combinatie met visuele identificatie van recombinante virussen. Onze methode maakt gebruik van selectieve druk gegenereerd door de gastheer antivirale eiwit kinase R (PKR) in combinatie met een fluorescerend fusie-gen uitdrukken mCherry-tagged E3L, een van de twee VACV PKR antagonisten. De cassette, inclusief het gen van belang en de mCherry-E3L fusie wordt geflankeerd door sequenties afgeleid van het VACV genoom. Tussen het gen van belang en mCherry-E3L is een kleiner gebied dat identiek is aan de eerste ~ 150 nucleotiden van de 3 'arm, ter bevordering van homologe recombinatie en verlies van de mCherry-E3L gen na selectie. We tonen aan dat deze methode een efficiënte, naadloze generatie rVACV mogelijk maakt in verschillende celtypen zonder dat er medicijnselectie of uitgebreide screening op gemuteerde virussen nodig is.

Introduction

Vaccinia virus (VACV) was instrumenteel voor de eerste succesvolle uitroeiing van een menselijke ziekteverwekker, variola virus (VARV), uit de natuur. Sinds de uitroeiing van het variolavirus zijn poxvirussen, waaronder VACV, nog steeds nuttige therapeutische virussen voor zowel de menselijke als de diergeneeskunde. Zo is een vaccin tegen rabiës door VACV zeer effectief geweest bij het voorkomen van overdracht van sylvatische rabiës in Europa¹ en de Verenigde Staten². Meer recent hebben recombinante poxvirussen die een verscheidenheid aan anti-tumormoleculen uitdrukken (bijvoorbeeld single-chain antilichamen of menselijk....

Protocol

1. Het genereren van de recombinatievector

1. Ontwerp primers om de selectiecassette te genereren. Ontwerp elk individueel amplicon met overlappende sequenties met naburige versterkers en de vector om isothermale enzymatische assemblage van DNA-moleculen te vergemakkelijken, ook wel Gibson-assemblage genoemd, met behulp van een van de verschillende online primerontwerptools.
   OPMERKING: Dit protocol kan ook worden voltooid met behulp van traditionele beperking endonuclease-gebaseerde klonen methoden. Ontwerp in dat geval primers met de juiste beperkingssites in plaats van met overlappende sequenties.
2. Met behulp van de primers die in stap 1.1 zijn on....

Results

We gebruikten de procedure in figuur 1 om een VACV te genereren zonder zowel PKR-antagonisten E3L als K3L, door E3L te vervangen door EGFP in een virus dat al is verwijderd voor K3L (vP872). Figuur 2 toont rode fluorescerende plaques in PKR bevoegde RK13 cellen indicatief voor virale expressie van mCherry-E3L, evenals EGFP uitgedrukt in RK13 +E3L+K3L cellen die het verlies van E3L en ineenstorting van de mCherry-E3L selectie marker bevestigen.

Discussion

Hier presenteren we een variatie van een voorbijgaande marker selectie strategie ³² om recombinant vaccinia virussen te genereren zonder het behoud van vreemd DNA in de uiteindelijke recombinant virus. Onze strategie maakt gebruik van selectieve druk bemiddeld door de gastheer antivirale eiwit PKR in plaats van andere vormen van selectieve druk, zoals antibiotica. Het gebruik van gastheer antivirale genen elimineert de mogelijkheid van chemisch geïnduceerde fenotypische veranderingen in de cellen,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2X-Q5 Master Mix	NEB	M0492L	High-fidelity polymerase used in PCR
Ampicillin	ThermoFisher Scientific	11593027	Bacterial selective agent
Disposable Cell Scrapers	ThermoFisher Scientific	08-100-242	Cell scraper to harvest infected cells
EVOS FL Auto 2 Cell imaging system	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Fluorescent microscope
EVOS Light Cube, GFP	ThermoFisher	AMEP4651	GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP	ThermoFisher	AMEP4652	RFP Cube
GenJet	SignaGen Laboratories	SL100489	Transfection reagent
Luria Bertani (LB) Broth	Gibco	10855021	Bacterial growth medium
Monarch DNA gel extraction kit	NEB	T1020L	Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors
Monarch Plasmid Miniprep kit	NEB	T1010L	Miniprep kit ussed to purify plasmids
NanoDrop One	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W	Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration
NEBuilder Master Mix	NEB	E2621L	Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector
Q500 Sonicator	Qsonica	Q500-110	Sonicator for virus lysates
RK13 cells	ATCC	CCL-37	Rabbit kidney cells
VWR Multiwell Cell Culture plates	VWR	10062-892	Cell culture plates