Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems

7.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61062

⸱

5 mei 2020

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, ETH Zürich, 2Climate Change Cluster, University of Technology Sydney, 3School of Oceanography, University of Washington

In dit artikel

Samenvatting

Hier gepresenteerd is het protocol voor een in situ chemotaxis test, een recent ontwikkeld microfluïdisch apparaat dat studies van microbiële gedrag direct in de omgeving mogelijk maakt.

Samenvatting

Microbiële gedragingen, zoals beweeglijkheid en chemotaxi's (het vermogen van een cel om de beweging te veranderen in reactie op een chemische gradiënt), zijn wijdverspreid over de bacteriële en archaeale domeinen. Chemotaxis kan resulteren in aanzienlijke voordelen voor het verkrijgen van hulpbronnen in heterogene omgevingen. Het speelt ook een cruciale rol in symbiotische interacties, ziekte, en mondiale processen, zoals biogeochemische fietsen. De huidige technieken beperken het chemotaxis-onderzoek echter tot het laboratorium en zijn niet gemakkelijk toepasbaar in het veld. Hier gepresenteerd is een stap-voor-stap protocol voor de inzet van de in situ chemotaxis test (ISCA), een apparaat dat robuuste ondervraging van microbiële chemotaxi's direct in de natuurlijke omgeving mogelijk maakt. De ISCA is een microfluïdisch apparaat bestaande uit een 20 put array, waarin chemische stoffen van belang kunnen worden geladen. Eenmaal ingezet in waterige omgevingen verspreiden chemicaliën zich uit de putten, waardoor concentratiegradiënten ontstaan die microben voelen en erop reageren door via chemotaxi's in de putten te zwemmen. De putinhoud kan vervolgens worden bemonsterd en gebruikt om (1) de sterkte van de chemotactische reacties op specifieke verbindingen te kwantificeren door middel van stroomcytometrie, (2) isolaat en cultuur responsieve micro-organismen, en (3) karakteriseren de identiteit en genomische potentieel van de reagerende populaties door middel van moleculaire technieken. De ISCA is een flexibel platform dat kan worden ingezet in elk systeem met een waterige fase, inclusief mariene, zoetwater- en bodemomgevingen.

Inleiding

Diverse micro-organismen gebruiken beweeglijkheid en chemotaxi's om fragmentarische voedingsomgevingen te benutten, hosts te vinden of schadelijke aandoeningen te vermijden1,,2,,3. Deze microbiële gedragingen kunnen op hun beurt de tarieven van chemische transformatiebeïnvloeden 4 en symbiotische partnerschappen bevorderen in terrestrische, zoetwater- en mariene ecosystemen2,5.

Chemotaxis is uitgebreid onderzocht onder laboratoriumomstandigheden voor de afgelopen 60 jaar6. De eerste kwantitatieve methode om chemotaxi's te bestuderen, de capillaire test, omvat een capillaire buis gevuld met een vermeende chemoattractant ondergedompeld in een suspensie van bacteriën6. Diffusie van de chemische stof uit de buis creëert een chemische gradiënt, en chemotactische bacteriën reageren op dit gradiënt door te migreren naar de buis7. Sinds de ontwikkeling van de capillaire test, die vandaag de dag nog steeds veel wordt gebruikt, zijn er veel andere technieken ontwikkeld om chemotaxi's te bestuderen onder steeds gecontroleerdere fysische/chemische omstandigheden, waarbij de meest recente waarbij microfluidics8,9,10betrokken zijn .

Microfluidics, samen met high-speed video microscopie, maakt het bijhouden van het gedrag van enkele cellen in reactie op zorgvuldig gecontroleerde gradiënten. Hoewel deze technieken ons begrip van chemotaxi's enorm hebben verbeterd, zijn ze beperkt tot laboratoriumgebruik en vertalen ze zich niet gemakkelijk naar veldinzet in milieusystemen. Als gevolg daarvan is het vermogen van natuurlijke gemeenschappen van bacteriën om chemotaxi's te gebruiken binnen natuurlijke ecosystemen niet onderzocht; dus, het huidige begrip van het potentiële ecologische belang van chemotaxis is bevooroordeeld in de richting van kunstmatige laboratoriumomstandigheden en een beperkt aantal laboratorium-gekweekte bacteriële isolaten. De recent ontwikkelde ISCA overwint deze beperkingen11.

De ISCA bouwt voort op het algemene principe van de capillaire test; het maakt echter gebruik van moderne microfabricagetechnieken om een zeer gerepliceerd, gemakkelijk inzetbaar experimenteel platform te leveren voor de kwantificering van chemotaxi's naar verbindingen van belang in de natuurlijke omgeving. Het maakt ook identificatie en karakterisering van chemotactische micro-organismen door directe isolatie of moleculaire technieken. Terwijl het eerste werkende apparaat zelf vervaardigd en gebouwd van glas en PDMS11was, is de nieuwste spuitgegoten versie samengesteld uit polycarbonaat, met behulp van een sterk gestandaardiseerde fabricageprocedure (voor interesse in de nieuwste versie van het apparaat, kunnen de overeenkomstige auteurs gecontacteerd worden).

De ISCA is credit card-sized en bestaat uit 20 putten verdeeld in een 5 x 4 put array, elk gekoppeld aan de externe aquatische omgeving door een kleine haven (800 μm in diameter; Figuur 1). Putatieve chemoattractants geladen in de putten verspreiden zich in de omgeving via de haven, en chemotactische microben reageren door te zwemmen via de haven in de put. Aangezien veel factoren de uitkomst van een ISCA-experiment in de natuurlijke omgeving kunnen beïnvloeden, zal dit stapsgewijze protocol nieuwe gebruikers helpen potentiële obstakels te overwinnen en effectieve implementaties te vergemakkelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

We raden u aan sectie 1 uit te voeren voorafgaand aan veldexperimenten om de resultaten te optimaliseren.

1. Laboratoriumoptimalisatie

LET OP: De volumes beschreven in de optimalisatieprocedure zijn voldoende voor een enkele ISCA (samengesteld uit 20 putten).

  1. Bereiding van de chemische stof van belang
    OPMERKING: De optimale concentratie voor elke chemoattractant moet vaak worden bepaald onder laboratoriumomstandigheden voorafgaand aan veldinzet. Het chemische concentratieveld zal afnemen in omvang met een afstand tot de bron (ISCA goed), wat betekent dat de concentratie ervaren door micro-organismen in het milieu lager zal zijn dan die aanwezig zijn in het apparaat. De optimale concentratie in de ISCA hangt af van de diffusiesnelheid van de chemoattractant. Als de concentratie in de put te laag is (dicht bij de detectielimiet van de microben), worden er geen positieve chemotaxi's waargenomen. Omgekeerd, als de concentratie in de put te hoog is, zal de concentratie ook hoog zijn in de directe omgeving en zal microbiële accumulatie optreden boven de ISCA-putten in plaats van binnen. Daarom moeten verdunningsreeksen voor elke verbinding in laboratoriumomstandigheden worden uitgevoerd om de optimale concentratie voor veldinzet te bepalen. Idealiter moet ook een concentratiebereik in het veld worden getest om laboratoriumresultaten te bevestigen.
    1. Bereid 2,5 L van een geschikt medium met de juiste zoutconcentratie (bijvoorbeeld fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS] of kunstmatig zeewater). Filter het medium met een 0,2 μm filter met behulp van een peristaltische of vacuümpomp en autoclave.
    2. Bereid een 10 mM-oplossing van chemoattractant voor in 1 mL van het steriele medium. Filter de chemoattractante oplossing met een spuitfilter van 0,2 μm om deeltjes en potentiële verontreinigingen te verwijderen.
      OPMERKING: Idealiter mogen er geen andere organische verbindingen dan de chemoattractant aanwezig zijn in de uiteindelijke oplossing.
  2. Concentratiebereik door verdunningsreeks
    1. Verdun de gefilterde chemoattractant stock oplossing in serie, variërend (bijvoorbeeld) van 10 mM tot 100 μM.
      LET OP: Per geteste concentratie is minimaal 0,7 mL nodig.
  3. Het laden van de ISCA
    1. Vul een 1 mL spuit met de gefilterde chemoattractant en sluit deze aan op een 27 G spuit. Houd de ISCA met de poort naar boven gericht, langzaam injecteren van de stof totdat een kleine druppel verschijnt op de top van de haven.
      OPMERKING: 1) Elke verdunning of stof moet worden geïnjecteerd met een aparte spuit en naald om kruisbesmetting te voorkomen. 2) Deze kleine druppel is belangrijk omdat het ervoor zorgt dat er geen luchtbel is gevangen in de haven, die het vermogen van microben om te migreren via de haven zou kunnen schaden. 3) Het wordt aanbevolen om een hele rij per stof of concentratie (vijf putten) te vullen om een voldoende minimaal volume te leveren voor verdere analyses. 4) Een rij per ISCA moet fungeren als negatieve controle en moet worden gevuld met het gefilterde medium waarin de microben worden opgehangen. Deze behandeling is verantwoordelijk voor het effect van willekeurige beweeglijkheid door microben in de ISCA-putten en moet worden gebruikt om de behandelingen met een chemoattractant te normaliseren.
  4. Inzet in het laboratorium
    1. 's Nachts, incubeer een 5 mL cultuur verrijkt met 1% mariene bouillon (voor mariene bacteriën) of 1% lysogeny bouillon (LB, voor zoet water bacteriën).
      OPMERKING: Motile bacteriële isolaten of natuurlijke bacteriële gemeenschappen kunnen worden gebruikt voor laboratoriuminzet.
    2. Broed de cultuur voor 12 uur bij kamertemperatuur (RT) en 180 rpm. Zorg er na 12 uur voor dat de microbiële gemeenschappen motile zijn door directe observatie onder een microscoop.
    3. Draai de cultuur op 1.500 x g gedurende 10 minuten en resuspend 1/100 in 150 mL van geschikt medium (bijvoorbeeld gefilterd zeewater, gefilterd zoet water).
    4. Plaats twee kleine stukjes dubbelzijdige plakband op het vlakke oppervlak van een lade met een capaciteit van 200 mL (de deksels van 1 mL tipboxen hebben hiervoor de ideale afmetingen en kunnen gemakkelijk automatisch worden geautoclaveerd). Plaats een ISCA op de top, ervoor te zorgen dat het stevig hecht aan de tape. Vul de implementatielade langzaam met de bacteriële oplossing met behulp van een serologische pipet van 50 mL.
      OPMERKING: Vul de lade totdat de ISCA onder ongeveer 1-2 cm vloeistof is ondergedompeld. Als u meerdere trays gebruikt, gebruikt u hetzelfde volume voor iedereen.
    5. Laat de ISCA 1 uur incubeer om bacteriële chemotaxi's toe te staan. Na 1 uur, verwijder het medium zeer voorzichtig met een 50 mL serologische pipet om turbulente stroom te minimaliseren.
    6. Haal de ISCA uit de implementatielade zonder het bovenste oppervlak aan te raken. Gebruik een pipet en wegwerpruitenwissers om de resterende vloeistof op het ISCA-oppervlak te verwijderen.
      OPMERKING: Het is belangrijk om te voorkomen dat het aanraken van de poorten tijdens dit proces, als de resulterende veranderingen in de druk kan verwijderen of bacteriën toe te voegen uit de buitenomgeving in de put en daardoor bias de bacteriële dichtheid en samenstelling in de put.
  5. Ophalen van de monsters
    1. Houd de ISCA met de poort naar beneden gericht, haal het volume van de putten met behulp van een steriele 27 G spuit naald bevestigd aan een 1 mL spuit.
      OPMERKING: Elke rij (indien met dezelfde stof) kan worden samengevoegd tot een werkmonster van ongeveer 550 μL. Dit monster kan vervolgens in verschillende buizen worden gesalteerd, afhankelijk van de vereiste downstreamtoepassingen.
    2. Bepaal het aantal bacteriën aangetrokken tot elke chemoattractant concentratie door het analyseren van de monsters met flow cytometrie12. Kies de concentratie chemoattractant die chemotaxi's maximaliseert voor latere veldinzet.

2. Voorbereiding op veldinzet

OPMERKING: De voorbereiding van materiaal en de constructie van de stroomdempingsbehuizing (punt 2) moet vóór de implementatie worden uitgevoerd.

  1. Bereiding van materialen
    1. Bereid alle in tabel 1genoemde materialen voor .
      LET OP: Voor één ISCA zijn materiële hoeveelheden beschikbaar.
  2. Bouw en voorbereiding van de stroomdempingsbehuizing
    OPMERKING: De stroomdempingsbehuizing minimaliseert ongewenste turbulenties die anders de vestiging van chemische gradiënten die afkomstig zijn van de ISCA, verhindert.
    1. Snijd de stukken voor de inzetbehuizing met een lasersnijder van een 3 mm acrylplaat.
      OPMERKING: Het bestand voor de stukken is te vinden via de volgende link: .
    2. Monteer de lasergesneden stukken zoals aangetoond in figuur 2 met behulp van acryllijm.
      LET OP: Monteer de stukken met zorg. Gaten of verkeerde uitlijning kunnen lekken veroorzaken bij implementatie, wat direct van invloed is op de kwaliteit van de gegevens.
    3. Laat de geassembleerde behuizing 's nachts drogen.
    4. Was de behuizing met gedeïsized water.
    5. Identificeer mogelijke lekkage door gedeïsized water in de behuizing te gieten. Fix eventuele lekkende gewrichten door het toevoegen van meer acryl lijm, herhaal dan stappen 2.2.3–2.2.5.
    6. Snijd de schroefdraden in het acrylstuk dat zal worden gebruikt om de ISCA te beveiligen. Dit kan worden bereikt met behulp van een kraan met een diameter en toonhoogte die overeenkomen met de montageschroeven.
      1. Breng eerst de kraan in een tapsleutel aan en bevestig vervolgens het acrylstuk dat in een benchtop vice moet worden getapt. Voor de beste resultaten, zorg ervoor dat de acryl stuk is zo vlak mogelijk. Zorg ervoor dat de kraan loodrecht op het acrylstuk staat en begin met het draaien van de kraansleutel (met de klok mee), waarbij u lichtdruk op de kraan uitoefent.
      2. Na een aantal volledige omwentelingen in het acrylstuk, draait u de rotatie van de kraan (tegen de klok in) om voor een kwart van een rotatie om acryl uit de kraan te halen. Herhaal het proces totdat de gehele diepte van het acrylstuk is aangetikt.
      3. Ten slotte, verwijder de kraan (draaien tegen de klok in) en test de draden met behulp van een schroef.

3. Procedure ter plaatse

  1. Waterfiltratie
    1. Verzamel water van de veldsite wanneer het experiment klaar is om te beginnen. Filter 5 mL water per ISCA door een spuitfilter van 0,2 μm (met een spuit van 50 mL) in een kegelvormige centrifugebuis van 50 mL.
      OPMERKING: Ongeveer 3 mL gefilterd water is nodig om alle putten van een ISCA te vullen; het wordt echter aanbevolen om 1) filter 5 mL per apparaat om rekening te houden met verliezen tijdens het viervoudige filtratieproces, en 2) aliquots van de filtraten te behouden als negatieve controles voor zowel stroomcytometrie als moleculaire procedures.
    2. Filtreer het filtraat twee keer door een 0,2 μm hydrofiele GP filtercartridge (beide keren met dezelfde) met een nieuwe spuit van 50 mL in een nieuwe kegelvormige centrifugebuis van 50 mL. Filtreer het filtraat door een 0,02 μm spuitfilter (met een nieuwe spuit van 50 mL) in een nieuwe 50 mL conische buis.
      OPMERKING: Deze viervoudige filtratie moet bijna alle micro-organismen en deeltjes uit het water verwijderen. Houd het uiteindelijke filtraat uit de buurt van elke warmtebron tot gebruik. Dit water zal worden gebruikt om alle chemische stoffen die in de ISCA worden gebruikt, opnieuw op te zetten en moet op dezelfde temperatuur worden gehouden als het water op de inzetplaats. Convectieve stromen veroorzaakt door temperatuurverschillen tussen de ISCA-putten en de buitenomgeving kunnen anders optreden.
    3. Gebruik aliquots van het filtraat om alle chemoattractants van belang (meestal droog) opnieuw op te geven aan de gewenste concentraties in 15 mL conische centrifugebuizen.
    4. Filtreer de geresuspended chemoattractants door een spuitfilter van 0,2 μm met een spuit van 10 mL in steriele conische centrifugebuizen van 15 mL om ongewenste deeltjes of wateroplosbare verbindingen te verwijderen (bij gebruik van extracten).
      LET OP: Filter voorzichtig om te voorkomen dat deeltjes door het filter gaan. Het is belangrijk om de chemoattractants in het ultragefilterde water van de veldsite opnieuw op te stellen en ze niet op te nemen in andere oplossingen. Het gebruik van water van de veldplaats is noodzakelijk om (1) dezelfde zoutconcentratie in de putten te verkrijgen als die in het bulkmilieuwater om dichtheidsgestuurde stroming te voorkomen, en (2) garanderen dat de achtergrondvoedingsniveaus binnen en buiten de put gelijk zijn.
  2. ISCA-vulling
    1. Voer punt 1.3 uit om de ISCA te vullen.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om één rij (vijf putten) per stof te vullen (d.w.z. drie verschillende stoffen per ISCA en één ultragefilterde zeewatercontrole).
  3. Implementatie in het veld
    1. Schroef de ISCA (figuur 3A) aan stuk 9 van de behuizing(figuur 2K en figuur 3B).
      OPMERKING: De hierboven beschreven stroomdempingsbehuizing kan twee ISCA's naast elkaar of één ISCA in het midden bevatten.
    2. Sluit de behuizing(figuur 3C)en sluit deze af met plakband(figuur 3D).
      LET OP: Rimpels moeten worden vermeden om een perfecte afdichting te garanderen. Verzegel eerst alle zijden en verzegel vervolgens (in een tweede stap) de zijgaten, die worden gebruikt om water uit de behuizing af te voeren aan het einde van de bemonstering. Sluit de boven- en onderkant niet af. Plaats de ISCA niet ondersteboven, omdat dichtheidsgestuurde stroom kan optreden in putten die chemoattractants bevatten, wat het aantal cellen in de putten zal beïnvloeden.
    3. Omdat de behuizing tijdens de inzet stabiel moet blijven, wordt aanbevolen deze met behulp van bungee-koorden aan door de mens gemaakte structuren (bijvoorbeeld ponton, ladder) te bevestigen.
      OPMERKING: De behuizing kan worden bevestigd aan een inzetarm (hier, een aangepaste klem met een loodrecht platform) met behulp van bungee koorden voor onderdompeling in het water. Als alternatief kan de behuizing worden gevuld en beveiligd met een klein gewicht op ondiepe substraten. Als de implementaties zijn bedoeld in de pelagische oceaan, kan de behuizing worden bevestigd aan een net met een boei aan de ene kant en duikgewicht aan de andere kant.
    4. Dompel de behuizing volledig onder om te beginnen met vullen. Houd tijdens het vullen de behuizing stevig vast om overmatige waterbewegingen binnen te voorkomen. Zodra het niveau van het water de bovenkant van de behuizing bereikt, zorg ervoor dat er geen lucht in zit.
      OPMERKING: In het geval dat sommige luchtbellen zijn gevangen, kantel de behuizing voorzichtig met de vent gat naar boven gericht, waardoor de bellen te ontsnappen.
    5. Eenmaal volledig vol, verzegelen de onderste en bovenste gaten met twee stekkers, die kunnen worden gemaakt van silicium of rubber of door het afdichten van de uiteinden van 20 μL pipet tips (Figuur 4).
      LET OP: Deze stap voorkomt doorstroming in de behuizing tijdens de bemonstering.
    6. Laat de ISCA 1-3 uur voor bemonstering.
      OPMERKING: De ideale inzettijd wordt voornamelijk bepaald door de temperatuur van het water en de verdubbelingstijd van de bacteriële gemeenschap. Wanneer de watertemperatuur boven de 20 °C ligt, wordt afgeraden om de ISCA langer dan 1 uur in te zetten, omdat celdeling kan optreden in de putten die chemoattractants bevatten na 1,5-2,0 uur. Optimale implementatietijd kan echter voorafgaand aan het ISCA-experiment worden getest door natuurlijke gemeenschappen te wijzigen met de geladen chemicaliën en het aantal cellen door de tijd te kwantificeren.
    7. Haal de behuizing uit het water. Plaats het over een container waardoor het water uit de behuizing kan worden afgevoerd.
    8. Verwijder het bovenste deel van de plakband heel voorzichtig uit de voorste gaten.
      LET OP: De stroming van het water dat de behuizing verlaat, moet een druipende snelheid hebben. Ga één gat tegelijk te werk, van de bovenkant van de behuizing naar de bodem. Het duurt ongeveer 10-15 minuten om de behuizing volledig af te voeren.
    9. Zodra de waterlijn onder de bovenkant van de ISCA passeert, verwijdert u de onderste stekker en voert u de rest van het water af.
    10. Terwijl de ISCA's nog steeds aan de behuizing zijn bevestigd, moet u het water dat op de ISCA is vastzit voorzichtig verwijderen met een pipet van 1 mL.
    11. Verwijder de ISCA zonder het bovenste oppervlak aan te raken en gebruik een wegwerpdoek om de resterende vloeistof op het oppervlak te verwijderen.
      OPMERKING: Het is belangrijk om de poorten niet aan te raken tijdens dit proces, omdat de resulterende veranderingen in druk bulkbacteriën kunnen verwijderen of toevoegen aan de put en bias van de bacteriële tellingen.
    12. Haal de monsters uit de ISCA op door stap 1.5.1 te herhalen.

4. Downstreamtoepassingen

OPMERKING: Volumes worden gegeven op basis van een monster van 550 μL (één rij van een ISCA).

  1. Fix 100 μL van put inhoud met glutaraldehyde (2% laatste concentratie) voor flow cytometrie om chemotaxi's te kwantificeren aan elke attractant.
    OPMERKING: Bewaar op ijs (of bij 4 °C) en analyseer de monsters op dezelfde dag. Als alternatief kunnen monsters na fixatie in vloeibare stikstof worden ingevroren als analyse op dezelfde dag niet haalbaar is. Flow cytometrie is de aanbevolen methode om het aantal cellen in de ISCA-putten te kwantificeren, omdat het eenvoudig, snel en nauwkeurig is12.
  2. Snap bevries 300 μL putgehalte in vloeibare stikstof voor latere DNA-extractie en -analyse11.
    LET OP: Bewaar de monsters op -80 °C tot de analyse.
  3. Voeg 90 μL putinhoud toe aan 10 μL TE-glycerolbuffer en vries de monsters voor eencellige genomics13uit.
  4. Verspreid 10-20 μL op agarplaten met het gewenste medium voor bacteriële isolatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deze sectie presenteert laboratoriumresultaten met behulp van de ISCA om de chemotactische respons van mariene microben te testen op een concentratiebereik van glutamine, een aminozuur waarvan bekend is dat het bodembacteriën aantrekt14. De concentratie glutamine die de sterkste chemotactische respons in de laboratoriumtests opduwde, werd gebruikt om een chemotaxistest uit te voeren in het mariene milieu.

Om de laboratoriumtests uit te voeren, werden zeewatergemeenschap...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Op de schaal van aquatische micro-organismen is het milieu verre van homogeen en wordt het vaak gekenmerkt door fysische/chemische gradiënten die microbiële gemeenschappenstructureren 1,15. De capaciteit van motile micro-organismen om gedrag te gebruiken (d.w.z. chemotaxis) vergemakkelijkt het foerageren binnen deze heterogene micro-omgevingen1. Het direct in het milieu bestuderen van chemotaxi's heeft het potentieel om belangrijke intersp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd mede gefinancierd door het Gordon and Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative, via subsidie GBMF3801 aan J.R.S. en R.S., en een Investigator Award (GBMF3783) aan R.S., evenals een Australian Research Council Fellowship (DE160100636) aan J.B.R., een prijs van de Simons Foundation aan B.S.L. (594111), en een subsidie van de Simons Foundation (542395) aan R.S. als onderdeel van de Principles of Microbial Ecosystems (PriME) Collaborative.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Acrylic glueEvonik1133Acrifix 1S 0116
Acrylic sheetMcMaster-Carr8505K725Of een andere bedrijf
Adhesive tapeScotch3M 810Scotch Magic tape
AutoclaveSystecD-200Of een andere bedrijf
Benchtop centrifugeFisher Scientific75002451Of een andere bedrijf
Bungee cordParacord Planet667569184000Of een andere bedrijf
Centrifuge tube - 2 mLSigma AldrichBR780546-500EAEppendorf tube
Conical centrifuge tube - 15 mLFisher Scientific11507411Falcon tube
Conical centrifuge tube - 50 mLFisher Scientific10788561Falcon tube
Deployment armIrwin1964719Of een andere bedrijf
Deployment enclosure plugFisher Scientific21-236-4Zie alternatieven in manuscript
Disposable wipersKimtech - Fisher Scientific06-666Kimwipes
Flow cytometerBeckmanC09756CYTOFlex
Glutaraldehyde 25%Sigma AldrichG5882Of een andere bedrijf
Green fluorescent dyeSigma AldrichS9430SYBR Green I - 1:10.000 eindverdunning
Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µmMerckC3235Sterivex filter
In Situ Chemotaxis Assay (ISCA)--Neem contact op met de corresponderende auteurs
Laser cutterEpilog LaserFusion pro 32Of een andere bedrijf
Luria Bertani BrothSigma AldrichL3022Of een andere bedrijf
Marine Broth 2216VWR90004-006Difco
Nylon slotted flat head screwsMcMaster-Carr92929A243M 2 × 4 × 8 mm
Pipette setFisher Scientific05-403-151Of een andere bedrijf
Pipette tips - 1 mLFisher Scientific21-236-2AOf een andere bedrijf
Pipette tips - 20 µLFisher Scientific21-236-4Of een andere bedrijf
Pipette tips - 200 µLFisher Scientific21-236-1Of een andere bedrijf
Sea saltSigma AldrichS9883Voor kunstmatig zeewater
Serological pipette - 50 mLSigma AldrichSIAL1490-100EAOf een andere bedrijf
Syringe filter - 0.02 µmWhatmanWHA68091002Anatop filter
Syringe filter - 0.2 µmFisher Scientific10695211Of een andere bedrijf
Syringe needle 27GHenke Sass Wolf47100040200,4 × 12 mm
Syringes - 1 mLCodau329650Insulin Luer U-100
Syringes - 10 mLBD303134Of een andere bedrijf
Syringes - 50 mLBD15899152Of een andere bedrijf
Tube rack - 15 mLThomas Scientific1159V80Of een andere bedrijf
Tube rack - 50 mLThomas Scientific1159V80Of een andere bedrijf
Uncoated High-Speed Steel General Purpose TapMcMaster-Carr8305A77Of een andere bedrijf
Vacuum filter - 0.2 µmMerckSCGPS05RESteritop filter
```

Referenties

  1. Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
  2. Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
  3. Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
  4. Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
  5. Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
  6. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
  7. Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
  8. Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. Microfluidics for bacterial chemotaxis. Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).
  9. Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821(2014).
  10. Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
  11. Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
  12. Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
  13. Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
  14. Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
  15. Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Microbiële chemotaxisflowcytometrie-analysechemoattractantconcentratiebacterieel cultuurmediumprotocol voor veldinzetmicrofluidisch device-arraykwantificering van de chemotactische responssteriele oplossingfiltratiebemonstering van aquatische ecosystemen
In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.