Methodenartikel

Een Lab-On-A-Chip Platform voor het stimuleren van Osteocyte Mechanotransductie en het analyseren van functionele resultaten van bone remodeling

7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61076

⸱

21 mei 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we protocollen voor het analyseren van botremodellering binnen een lab-on-a-chip platform. Een 3D-geprint mechanisch laadapparaat kan worden gekoppeld aan het platform om osteocyte mechanostransductie te induceren door de cellulaire matrix te vervormen. Het platform kan ook worden gebruikt om botremodellering functionele resultaten van osteoclasten en osteoblasten (resorptie / vorming) te kwantificeren.

Samenvatting

Bot remodelleren is een strak gereguleerd proces dat nodig is voor skeletgroei en reparatie, alsmede aan te passen aan veranderingen in de mechanische omgeving. Tijdens dit proces regelen mechanogevoelige osteocyten de tegengestelde reacties tussen de katabole osteoclasten en anabole osteoblasten. Om beter te begrijpen van de zeer ingewikkelde signaleringstrajecten die dit proces reguleren, heeft ons lab een fundamenteel lab-on-a-chip (LOC) platform ontwikkeld voor het analyseren van functionele uitkomsten (vorming en resorptie) van botremodelleren binnen een kleinschalig systeem. Aangezien botremodellering een langdurig proces is dat plaatsvindt in de orde van weken tot maanden, ontwikkelden we langetermijncelkweekprotocollen binnen het systeem. Osteoblasten en osteoclasten werden gekweekt op functionele activiteitsubstraten binnen de LOC en gedurende maximaal zeven weken onderhouden. Daarna werden chips gedemonteerd om de kwantificering van botvorming en resorptie mogelijk te maken. Daarnaast hebben we een 3D-geprint mechanisch laadapparaat ontworpen dat paren met het LOC-platform en kan worden gebruikt om osteocyte mechanotransductie te induceren door de cellulaire matrix te vervormen. We hebben celkweekprotocollen voor osteocyten, osteoblasten en osteoclasten binnen het LOC-platform geoptimaliseerd en hebben zorgen over steriliteit en cytotoxiciteit aangepakt. Hier presenteren we de protocollen voor het fabriceren en steriliseren van de LOC, het zaaien van cellen op functionele substraten, het opwekken van mechanische belasting en het demonteren van de LOC om eindpuntresultaten te kwantificeren. Wij geloven dat deze technieken de basis leggen voor het ontwikkelen van een echte orgaan-op-een-chip voor botremodellering.

Inleiding

Bot is een zeer dynamisch weefsel dat ingewikkelde coördinatie tussen de drie belangrijkste celtypes vereist: osteocyten, osteoblasten en osteoclasten. Meercellige interacties tussen deze cellen zijn verantwoordelijk voor het botverlies dat optreedt tijdens verlamming en langdurige immobiliteit en voor de botvorming die optreedt in reactie op groei en lichaamsbeweging. Osteocyten, de meest voorkomende botcel type, zijn zeer gevoelig voor mechanische stimuli toegepast op het bot. Mechanische stimulatie verandert osteocyte metabolische activiteit en leidt tot een toename van de belangrijkste signaalmoleculen1,2. Door dit proces, bekend als mechanotransductie, kunnen osteocyten de activiteiten van osteoblasten (botvormende cellen) en osteoclasten (botresortencellen) direct coördineren. Het handhaven van bothomeostase vereist een strakke regeling tussen botvorming en botresorptiepercentages; echter, verstoringen in dit proces kan leiden tot ziekte toestanden zoals osteoporose of osteopetrorose.

De complexiteit van de interacties tussen deze drie celtypen leent zich goed voor onderzoek met behulp van microfluidic en lab-on-a-chip (LOC) technologieën. Daartoe heeft ons lab onlangs een proof of concept van een LOC-platform opgezet voor het analyseren van botresorptie en vorming (functionele uitkomsten) in het botremodelleringsproces. Het platform kan worden gebruikt voor de studie van cellulaire interacties, veranderde laadomgevingen en onderzoekende drugsscreening. In de afgelopen jaren zijn verschillende microfluïdische apparaten ontwikkeld voor het onderzoeken van de moleculaire signaleringstrajecten die het remodelleren van botten reguleren; Veel van deze systemen kwantificeren echter de herinrichting door middel van indirecte merkers die wijzen op functionele activiteit3,4,5,6,7. Een voordeel van ons systeem is dat het kan worden gebruikt voor directe kwantificering van functionele resultaten. Bot remodelleren is een proces op lange termijn. Als zodanig vereist directe kwantificering van botresorptie en vorming een kweeksysteem dat gedurende ten minste enkele weken tot maanden8,9,10,11kan worden gehandhaafd . Zo hebben we bij de ontwikkeling van het LOC-platform langdurige kweekprotocollen opgesteld die nodig zijn voor vorming en resorptie en hebben we cellen in het systeem tot zeven weken11onderhouden. Daarnaast hebben we geschikte kweeksubstraten voor beide celtypen in het platform verwerkt; osteoclasten werden gekweekt direct op het bot, en osteoblasten, waarvan bekend is dat plastic aanhanger, werden gekweekt op polystyreen schijven. Verder hebben we kwesties met betrekking tot steriliteit, cytotoxiciteit op lange termijn en spaan van de chip voor remodelleren analyse11,12.

Het LOC-platform kan ook worden gebruikt om osteocyte mechanotransductie te induceren door matrixvervorming. Een 3D-geprint mechanisch laadapparaat werd ontwikkeld om te koppelen met de LOC en een statische uit vliegtuigdistentie toe te passen om de cellen13uit te rekken. Om deze mechanische belasting aan te kunnen, werd de diepte van de put binnen de LOC vergroot. Deze kleine schaal, eenvoudige mechanische laadinrichting kan gemakkelijk worden geproduceerd door laboratoria met beperkte technische ervaring, en we hebben eerder gedeeld tekeningen van de 3D-geprinte componenten13. In het huidige werk demonstreren we enkele van de nieuwe technieken die nodig zijn voor het succesvol gebruik van de LOC. Concreet demonstreren we chipfabricage, celzaaien op functionele substraten, mechanische belasting en spaanvan de chip voor het verbouwen van kwantificering. Wij geloven dat de uitleg van deze technieken profiteren van een visueel formaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van het chipmasker

LET OP: Stappen 1.1 - 1.3 hoeven slechts eenmaal te worden uitgevoerd bij de eerste ontvangst van het chipmasker. Ze zorgen ervoor dat het masker niet buigt tijdens het gebruik. Het ontwerp van de microfluïdische maskers werd eerder beschreven11,14. Maskers werden ontworpen in-house en commercieel vervaardigd met behulp van hoge resolutie stereolithografie (Figuur 1A).

  1. Bedek het bovenoppervlak van het masker met plastic bekleding om dit oppervlak te beschermen tegen lijm. Zet het chipmasker vast op een acrylvel van even grote grootte met behulp van spuitlijm. Klem de stukken 's nachts aan elkaar zodat de lijm volledig kan genezen. Nadat de lijm droog is, verwijdert u de plastic bekleding van de bovenkant van het masker.
  2. Bevestig de onderkant van de acrylplaat aan een 3D-geprinte nivelleringsdoos(Aanvullende figuur 1, Aanvullende Bestanden 1-4)met behulp van dubbelzijdige tape. Druk stevig om een strakke band te garanderen.
  3. Sluit eventuele kleine openingen in de buurt van de afneembare wand van de nivelleringdoos af met een waterdichte kit. Laat de kit 24 uur lang uitharden.
  4. Reinig het oppervlak van het masker met 70% ethanol (EtOH). Plaats de nivelleringdoos met het gewenste spaanmasker in de oven. Gebruik een digitale protractor om ervoor te zorgen dat de bovenkant van het masker vlak is. Pas indien nodig de nivelleringsschroeven aan.

2. PDMS fabricage

OPMERKING: Een ondiep-goed (1 mm) chip ontwerp wordt gebruikt voor functionele activiteit (vorming en resorptie) testen, en een diep-put (10 mm) chip ontwerp wordt gebruikt voor mechanische belasting studies. De bodem van de diepe put wordt gevormd door het bevestigen van een apart dun PDMS membraan(figuur 1B).

  1. Deksellaag (Laag 1)
    1. Combineer 63 g PDMS prepolymeer en 6,3 g uithardingsmiddel (10:1 verhouding) in een plastic beker. Meng grondig met een wegwerpcelspatel en ontgas in een vacuümdroogdroogcan gedurende 30 min.
    2. Giet langzaam mengsel in de voorbereide nivellering doos. Laat de PDMS 30 min zitten en bak dan 18 uur bij 45 °C.
    3. Maak de randen van de PDMS los met een taps toelopende laboratoriumspatel en verwijder de polymeerplaat uit de nivelleringsdoos.
    4. Snijd afzonderlijke deksels op maat (70 mm x 34 mm) met behulp van een scalpel en een 3D-geprinte sjabloon.
    5. Punch toegangsgaten door elk deksel met een biopsie punch (1 mm diameter).
    6. Maak de deksels schoon met verpakkingstape.
      LET OP: Als de deksels niet onmiddellijk worden gebruikt, wikkel ze dan elk in verpakkingstape en sla ze op bij kamertemperatuur (RT).
  2. Put- en microkanaallaag (Laag 2)
    1. Combineer het PDMS prepolymeer en uithardingsmiddel (10:1 verhouding) in een plastic beker. Het ondiepe ontwerp vereist 43 g prepolymeer en 4,3 g uithardingsmiddel, en het diep-put ontwerp vereist 227 g prepolymeer en 22,7 g uithardingsmiddel. Meng het polymeer krachtig en ontgas gedurende 30 min.
      OPMERKING: Hierbij wordt uitgegaan van een maskermeting van 152,4 mm x 152,4 mm.
    2. Giet langzaam mengsel over de juiste pre-genivelleerd masker. Laat de PDMS 30 min zitten en bak dan 18 uur bij 45 °C.
    3. Maak de randen van de PDMS los met een taps toelopende laboratoriumspatel en pel het polymeer voorzichtig van het masker af. Gebruik een scalpel en 3D-geprinte sjabloon om afzonderlijke chips uit te snijden.
      OPMERKING: Voor laadstudies is het belangrijk dat de spaanafmetingen (70 x 34 mm) nauwkeurig zijn en dat de put zich in het midden van de chip bevindt.
    4. Oppervlak reinig de PDMS met verpakkingstape.
      OPMERKING: Als de chips niet onmiddellijk worden gebruikt, wikkel elke chip in verpakkingstape en bewaar bij RT.
  3. Dun PDMS-membraan (laag 3)
    LET OP: Deze laag wordt alleen gebruikt voor het diep-goed ontwerp.
    1. Voeg 12,7 g PDMS prepolymeer en 1,3 g uithardingsmiddel (10:1 verhouding) toe aan een plastic beker. Meng krachtig en ontgas gedurende 30 min.
    2. Giet polymeer langzaam in de geprepareerde nivelleringdoos en schraap de plastic beker grondig om zoveel mogelijk PDMS te verwijderen.
    3. Gebruik celspatel om PDMS over het hele oppervlak te verspreiden.
      OPMERKING: Als het polymeer niet handmatig wordt verspreid, is de oppervlaktespanning voldoende om te voorkomen dat het polymeer een uniform blad vormt.
    4. Laat de PDMS 30 min zitten en bak dan 18 uur bij 45 °C.
    5. Maak de randen van de PDMS los met een taps toelopende spatel en verwijder het PDMS-vel voorzichtig uit de nivelleringsdoos. Snijd individuele membranen die overeenkomen met de afmetingen van laag 2.
    6. Meet de membraandikte in het midden van het membraan met remklauwen. Verwijder membranen die zich buiten de gewenste dikte bevinden (0,5 mm ± 0,1 mm).
    7. Zorgvuldig reinigen membranen met verpakkingstape en plaats op een stuk paraffine film.
      LET OP: Als de membranen niet onmiddellijk worden gebruikt, bedek dan de bovenkant van het membraan met verpakkingstape en bewaar bij RT.

3. Functionele activiteitssubstraten

OPMERKING: Polystyreen schijven en bot wafels moeten worden bevestigd aan de bodem van putten die zullen worden gebruikt voor osteoblast en osteoclast culturen, respectievelijk.

  1. Polystyreenschijven (figuur 1C)
    1. Plaats plakband op de achterkant van een weefselcultuur behandeld polystyreen coverslip. Snijd cirkelvormige schijven uit het uitglijder met behulp van een geslepen kurkboor (5,4 mm diameter). Dompel de schijven in 70% EtOH en laat 's nachts.
    2. Schrob voorzichtig het bovenoppervlak van de schijf met een katoenen tater applicator gedrenkt in 70% EtOH. Zorg ervoor dat de buitenrand van de schijf grondig wordt gereinigd.
    3. Met behulp van twee paar tangen, houd de schijf en verwijder de plakband backing. Plaats de schijf behandeld kant naar beneden en reinig de achterkant met een katoenen tip applicator.
    4. Dompel het houten uiteinde van een katoenpunt applicator in een ontgast mengsel van ongezouten PDMS en plaats een kleine hoeveelheid van het polymeer op de bodem van de gewenste put.
      LET OP: Ongezouten PDMS kunnen worden opgeslagen bij -20 °C.
    5. Plaats de polystyreenschijf, behandeld zijwaarts, in de put en druk voorzichtig met een wattenstaafje op de schijf. Zorg ervoor dat er geen niet-uitgeharde PDMS in contact komt met de behandelde kant van de schijf.
      OPMERKING: Als PDMS in contact komt met het behandelde oppervlak van de schijf, verwijdert u de schijf uit de put en herhaalt u de stappen 3.1.4 en 3.1.5 met een nieuwe schijf.
    6. Laat de chip 30 min op een vlakke ondergrond zitten en bak vervolgens 4 uur lang bij 65 °C.
  2. Botwafels
    1. Gebruik tangen om een botwafer (6 mm diameter, 0,4 mm dik) op de bodem van een schaal van 100 mm te plaatsen. Houd de wafer stabiel met de tangen en zachtjes ets en een 'X' op de achterkant van de wafer met een scalpel.
      OPMERKING: Tijdens het beeldvormingsproces wordt de 'X' gebruikt om onderscheid te maken tussen de achterkant van de wafer en het oppervlak waarop cellen zijn gezaaid.
    2. Gebruik het houten uiteinde van een katoenen applicator om een kleine hoeveelheid ongezouten PDMS toe te voegen aan de bodem van de gewenste put. Plaats de botwafer, gemarkeerd e-kant naar beneden, in de put en gebruik een katoenen applicator om de wafer naar beneden te drukken.
    3. Laat de chip 30 min op een vlakke ondergrond zitten en bak vervolgens 4 uur lang bij 65 °C.

4. Spaanmontage en sterilisatie

  1. Activeer de oppervlakken van laag 1 en laag 2 met een plasmareiniger voor 30 s met behulp van een gemiddelde radiofrequentie (RF) energie-instelling (gelijk aan ongeveer 10,2 W).
  2. Lijn de toegangsgaten in laag 1 uit met de microkanalen in laag 2 en druk de twee lagen stevig tegen elkaar.
  3. Herhaal stap 4.1 met laag 2 en laag 3 voor het diep-put ontwerp stap 4.1. Gebruik tijdens de plasmabehandeling dubbelzijdige tape om de paraffinefilm van laag 3 aan een vlak oppervlak te bevestigen.
  4. Gebruik een scalpel om overtollig materiaal uit het PDMS-membraan af te snijden. Pel het vel paraffinefolie voorzichtig weg van de onderkant van de chip
  5. Bak de chip op 65 °C gedurende 10 min om de hechtingssterkte tussen de PDMS-lagen te verhogen.
  6. Plaats schuine doseertips (18 meter, 0,5 in, 90°) in de toegangsgaten in het deksel. Zet de doseertips vast aan het deksel met een epoxy van twee delen. Gebruik een micropipettip om de epoxy rond elke doseertip aan te brengen.
  7. Nadat de epoxy volledig is uitgehard, oppervlak schoon de chip met 70% EtOH en plaats in een biosafety kast. Voer alle volgende stappen uit binnen de bioveiligheidskast.
  8. Sluit een 5 mL spuit aan op de doseertips met steriele siliconen buizen (1/32'' ID, ~10 cm lang) en vul de gehele chip met 70% EtOH voor ten minste 30 s. Voor het ondiepe-goed ontwerp, beheer alle vloeistoffen met een spuitpomp ingesteld op een debiet van 4 mL/ h. Voor het diep-goed ontwerp, dient u alle vloeistoffen toe te dienen door de spuit langzaam met de hand uit te delen.
  9. Haal de EtOH uit de chip en steriliseer de chip met UV-licht 's nachts.
  10. Was de chip 3 keer met dH2O. Vul de chip met dH2O, haal de slang uit de doseertips en incubeer gedurende ten minste 48 uur bij 37 °C.

5. Montage van mechanische laadinrichting

OPMERKING: De ontwerp- en fabricageprocessen voor het 3D-geprinte mechanische laadapparaat (figuur 2A-C) zijn eerder beschreven en alle ontwerpbestanden voor gedrukte onderdelen zijn eerder geleverd13.

  1. Autoclave alle onderdelen van de laadinrichting gedurende 30 min bij 121 °C.
    OPMERKING: Om kromtrekken van geprinte onderdelen te voorkomen, wikkelt u elk stuk afzonderlijk in folie en plaatst u tijdens het autoclavingproces op een hard vlak oppervlak. Metalen hardware kan aan elkaar worden gewikkeld. Voltooi alle volgende stappen binnen een bioveiligheidskast.
  2. Plaats een compressieveer rond de as van de platen en plaats de platen in het centrale gat aan de onderkant van de basis (Figuur 2D).
  3. Bevestig het draaiblok aan de onderkant van de basis met behulp van vier zelftappende schroeven.
  4. Plaats een tweede compressieveer rond de centrale schroef. Steek de schroef in het zeshoekige gat in de onderkant van de wijzerplaat en schroef de montage in het schroefdraadgat in het midden van het wijzerplaatblok.
  5. Schroef vier man-vrouw standoffs in de bodem van de basis.
  6. Verwijder de speling van het apparaat door de wijzerplaat tegen de klok in te draaien totdat de bovenkant van de platen onder de bovenkant van de basis ligt. Draai vervolgens langzaam de wijzerplaat met de klok mee totdat de bovenkant van de platen gelijk is met de bovenkant van de basis.

6. Experimenten

OPMERKING: Protocollen voor experimenten met functionele activiteiten werden eerder verstrekt11,12.

  1. Loading studies (Figuur 3)
    1. Gebruik na stap 4.9 een 5 mL spuit om dH2O uit de deep-well chip te verwijderen. Bestrijk de bodem van de put met 200 μL van 0,15 mg/mL type I collageen (CTI) in 0,02 M azijnzuur gedurende 1 uur.
    2. Spoel de chip drie keer af met Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing met calcium en magnesium (DPBS++).
    3. Plaats de chip in de chiphouder en het zaad met MLO-Y4-osteocyten met een dichtheid van 2 x 104 cellen/mL in minimaal essentieel alfamedium (MEMα) aangevuld met 5% kalfsserum, 5% foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine.
    4. Haal de slang uit de doseertips en plaats de chip in een diepe kweekschaal (150 mm x 25 mm). Incubeercellen bij 37 °C en 5% CO2 voor 72 uur.
    5. Bevestig steriele buizen aan het geven van tips en gebruik een 5 mL spuit om gebruikte cultuur medium te verwijderen uit de chip. Langzaam afzien in verse cultuur medium om de chip te vullen.
    6. Plaats de chiphouder in de rechthoekige beginset op de bovenkant van de basis van het laadapparaat. Voer de slang door de sleuven op het deksel van het laadapparaat en zet het deksel op de bodem met vier pankopschroeven en hexmoeren.
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat het deksel vlak blijft, moet u eerst twee schroeven bevestigen die diagonaal van elkaar zijn geplaatst voordat u de resterende twee schroeven vastzet.
    7. Breng belasting aan op de cellen door de wijzerplaat met de klok mee te draaien totdat de gewenste platenverplaatsing is bereikt.
      LET OP: Het apparaat is zo ontworpen dat één draaiing van de wijzerplaat gelijk staat aan een verplaatsing van 1 mm. Het stamveld dat op de bovenkant van het PDMS-membraan werd gegenereerd, werd eerder gemodelleerd als functie van platenverplaatsing met behulp van eindige elementenanalyse (FEA)13.
    8. Plaats het laadapparaat in een lege P1000 micropipettipbox. Incubeer de cellen met de toegepaste belasting gedurende 15 min.
      OPMERKING: De hier gebruikte laadtijd dient als voorbeeld. Er kunnen alternatieve laadtijden worden gebruikt.
    9. Verwijder na incubatie de belasting uit de cellen door de wijzerplaat tegen de klok in te draaien totdat de platen terugkeren naar de oorspronkelijke startpositie. Haal het deksel van het apparaat en plaats de chiphouder in de diepwaterende kweekplaat. Incubeer de cellen voor een herstelperiode van 90 min na het laden.
      OPMERKING: Nogmaals, de hier gebruikte herstelperiode dient als voorbeeld. Er kunnen alternatieve hersteltijden worden gebruikt. Voor lange termijn studies, voercellen om de 72 uur.
    10. Gebruik een 5 mL spuit om het geconditioneerde medium uit de chip te verwijderen.
      LET OP: Dit medium kan worden opgeslagen en opgeslagen bij -80 °C.
    11. Verwijder de chip van de chiphouder en gebruik een taps toelopende spatel om de binding tussen het PDMS-deksel en de putlaag te verbreken.
      OPMERKING: Cellulaire tests kunnen nu worden uitgevoerd volgens elk protocol dat is ingesteld voor een celkweekplaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De ondiepe-goed configuratie kan worden gebruikt voor het analyseren van functionele activiteit van osteoblasten en osteoclasten. Botvorming via osteoblasten en resorptie via osteoclasten vereist kweektijden in de orde van enkele weken tot maanden. Botvorming van MC3T3-E1 pre-osteoblasten werd gekwantificeerd met alizarine rood en von Kossa vlekken11,15. Op dag 49 was de gemiddelde oppervlakte gekleurd met alizarin rood 10,7% ± 2,...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel beschrijft de fundamenten voor het fabriceren van een bot remodelleren LOC platform voor het kweken van osteocyten, osteoclasten, en osteoblasten. Door de diepte en grootte van de put in de chip te veranderen, werden meerdere configuraties ontwikkeld voor het stimuleren van osteocyten met mechanische belasting en het kwantificeren van functionele resultaten van botremodelleren(figuur 1B).

Tijdens de spaanmontage was het optimaliseren v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation in het kader van Grant Nos. (CBET 1060990 en EBMS 1700299). Ook is dit materiaal gebaseerd op werk ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program onder Grant No. (2018250692). Alle adviezen, bevindingen, conclusies, of aanbevelingen uitgedrukt in dit materiaal zijn die van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de National Science Foundation weerspiegelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Acrylic sheetOptix--3.175 mm dik
Angled dispensing tipsJensen GlobalJG18-0.5X-90Verwijder plastic connector voor gebruik
Biopsy punchRobbins InstrumentsRBP-101 mm diameter
Bone wafersBoneslices.com0.4 mm dikRunde corticale bot
Bovine calf serumHycloneSH30072
CalipersGlobal IndustrialT9F534164
Cell spatulaTPP99010
Chip maskProtoLabsOp maat ontworpenPrint materiaal: Accura SL 5530
Cork borerFisher Scientific07-865-10B
Cotton tipped applicatorPuritan806-WCL
Culture dish (100 mm)Corning430591Steriele, niet-weefsel gekweekte behandeling
Culture dish (150 mm)Corning430597Steriele, niet-weefsel gekweekte behandeling
Double sided tape3M CompanyScotch 237
Fetal bovine serumHycloneSH30910
ForcepsFisher Scientific22-327379
Leveling boxOp maat gemaakt--3D geprint
Masking tape3M CompanyScoth 2600
MC3T3-E1 preosteoblastsATCCCRL-2593Subclone 4
Mechanical loading deviceOp maat gemaakt--3D geprint
Minimum essential alpha mediumGibco12571-063
MLO-Y4 osteocytes----Cadeau van Dr. Lynda Bonewald
Packaging tapeDuck Brand--Standaard verpakkingstape
Paraffin filmBemis ParafilmPM999
Penicillin/streptomycinInvitrogenp4333
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-001Uitgebreide plasma cleaner
Polydimethylsiloxane kitDow CorningSylgard 184
Polystyrene coverslipsNunc Thermanox174942Steriele, weefsel gekweekte behandeling
OvenQuincy Lab12-180
RAW264.7 preosteoclastsATCCTIB-71
ScalpelBD Medical372611
Silicone tubingSaint-Gobain TygonABW00001ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm)
SolidWorks softwareDassault Systèmes--Gebruikt om 3D geprinte modellen te genereren en FEA uit te voeren
Spray adhesiveLoctite2323879Multi-purpose lijm
Syringe (5 ml)BD Medical309646Steriele
Syringe pumpHarvard Apparatus70-2213Pomp 11 Pico Plus
Tapered laboratory spatulaFisher Scientific21-401-10
Two-part expoxyLoctite13953915 minuten snel set
Type I collagenCorning354236Rattenstaart collageen
Vacuum desiccatorBel-ArtF42010-0000
Waterproof sealantGorilla8090001100% siliconen afdichting

Referenties

  1. Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
  2. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  3. Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
  4. Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
  5. Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528(2018).
  6. Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
  7. Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966(2014).
  8. Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299(2019).
  9. Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
  10. Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
  11. George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
  12. Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , In review (2019).
  13. Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
  14. George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
  15. George, E. L. Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , University of Akron. (2019).
  16. York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
  17. Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
  18. Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
  19. Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
  20. Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
  21. Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
  22. Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
  23. Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
  24. Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
  25. Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Analyse van botremodelleringPDMS membraanlaagmechanisch belastingsapparaatlangdurige celkweekkwantificering van botvormingbeoordeling van botresorptieosteoblast osteoclast cocultuurstatische out of plane distensie

Gerelateerde artikelen