Op flux gebaseerde test voor de identificatie van autofagiemodulatoren voor artrose

Samenvatting

Dit artikel beschrijft de monitoring van autofagieflux om nieuwe moleculen te identificeren door middel van celgebaseerde beeldvormingsscreening.

Samenvatting

Autofagie is een centraal mechanisme om de homeostase te reguleren. Veranderingen van autofagie dragen bij aan verouderingsgerelateerde ziekten. Fenotypische methoden om regulatoren van autofagie te identificeren, kunnen worden gebruikt voor de identificatie van nieuwe therapieën. Dit artikel beschrijft een celgebaseerde beeldvormingsscreeningsworkflow die is ontwikkeld om autofagische flux te monitoren met behulp van LC3 als reporter van autofagische flux (mCherry-EGFP-LC3B) in menselijke chondrocyten. Gegevensverzameling wordt uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde microscoop van het High Content Imaging Screening System. Er werd een op algoritmen gebaseerd geautomatiseerd beeldanalyseprotocol ontwikkeld en gevalideerd om moleculen te identificeren die autofagische flux activeren. Kritieke stappen, toelichtingen en verbeteringen ten opzichte van de huidige monitoringprotocollen voor autofagie worden gerapporteerd. Fysiologisch relevante fenotypische screeningbenaderingen om kenmerken van veroudering aan te pakken, kunnen effectievere strategieën voor het ontdekken van geneesmiddelen voor leeftijdsgebonden musculoskeletale aandoeningen mogelijk maken.

Inleiding

Veel chronische ziekten worden in verband gebracht met de kenmerken van veroudering, waaronder defecte autofagie¹. Artrose (OA) is de meest voorkomende gewrichtsaandoening en heeft een grote impact op het beperken van dagelijkse activiteiten bij de vergrijzende bevolking, maar er zijn nog geen preventieve maatregelen of ziektemodificerende behandelingen beschikbaar².

Gewrichtsveroudering en artrose worden geassocieerd met kenmerken die de progressie van kraakbeendegeneratie definiëren, waaronder defecte autofagie en senescentie ^3,4. Het richten op autofagie in musculoskeletale weefsels kan helpen bij het vinden van therapeutische innovaties voor reumatologische aandoeningen ^5,6. Farmacologische modulatie van autofagie is een veelbelovend, relevant mechanisme voor interventie in preklinische ziektemodellen⁷. Bij artrose is autofagie-activering gebruikt om gewrichtsdisfunctie te voorkomen⁸. Methoden om autofagie te monitoren op basis van robuuste, reproduceerbare protocollen die kwantitatieve analyse mogelijk maken, kunnen worden gebruikt om nieuwe middelen te identificeren en de farmacologische targeting van ziekterelevante kenmerken van veroudering te vergemakkelijken.

Autofagieflux weerspiegelt degradatieactiviteit en is een relevante meting om nieuwe moleculen te identificeren die autofagie⁹ activeren. Deze studie beschrijft een methode die is ontwikkeld om autofagische flux te bepalen door autofagische degradatieactiviteit te meten met behulp van een autofagie-reportercellijn in menselijke chondrocyten (TC28a2). mCherry-EGFP-LC3-transiënte expressie maakt gelijktijdige monitoring van autolysosoomvorming en -degradatie mogelijk door de verschillen in de pH-gevoeligheid tussen GFP- en mCherry LC3-signalen in de lysosomen van levende cellen te kwantificeren¹⁰.

Door deze door flowcytometrie gerapporteerde methode aan te passen aan een monitoringsysteem voor stabiele expressiebeeldvorming in levende chondrocyten kan de identificatie mogelijk worden van moleculen die autofagische flux activeren in de context van kraakbeenbiologie.

Protocol

1. Generatie van autofagie reporter cellijn van onsterfelijke menselijke chondrocyten

OPMERKING: Het genereren van een autofagie-reportercellijn door stabiele transfectie van pBABE-mCherry-GFP-LC3 door het vaststellen van een kwantitatieve uitlezing van flowcytometrie werd eerder beschreven¹¹. Twee cellijnen werden gebruikt in de retrovirale transfectie: HEK 293-T17 tijdens het cotransfectieproces en T/C28a2 in de infectiestap.

1. Het proces van de cotransfectie
   1. Bereid het groeimedium voor op HEK 293-T17-cellen: 500 ml Eagle's minimum essential medium (EMEM), 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (P/S). Bewaar het groeimedium voor elk gebruik bij 4 °C en verwarm tot 37 °C.
   2. Zaad 1 x 10⁶ HEK 293-T17 cellen per putje in 100 mm celkweekplaten, incubeer bij 37 °C en 5% CO₂, en zorg ervoor dat ze bij ~75% samenvloeiing zijn voordat ze met het cotransfectieproces beginnen.
   3. Verwijder het kweekmedium, spoel af met Hank's balanced salt solution (HBSS) en voeg 8 ml EMEM toe met 2% FBS en 1% P/S.
   4. Voeg in een conische buis 10 μg, 3 μg en 7 μg pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B, VSV toe. G- en pCL-Eco-plasmiden. Voeg vervolgens 200 μL 1x gereduceerd serummedium toe (Materiaalopgave). Voeg transfectiereagens (Lijst van Materialen) als niet-liposomaal mengsel van lipiden toe om een verhouding van 1:3 te hebben (1 μg DNA: 3 μg transfectiereagens; definitief volume = 60 μL).
      OPMERKING: In totaal wordt 20 μg mengsel bereid voor elke te transfecteren celplaat van 10 cm.
   5. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Breng de transfectiemix voorzichtig druppelsgewijs over naar HEK 293-T17 verpakkingscellen. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO₂ ten minste 48 uur alvorens door middel van fluorescentiemicroscopie te controleren op de expressie van groene en rode eiwitten.
      OPMERKING: Onder deze omstandigheden zou meer dan 75% van de cellen positief moeten zijn voor fluorescentie. Zorg ervoor dat de transfectie-efficiëntie hoog is (bijv. meer dan 75% van de cellen is positief). Gebruik plasmide-DNA van hoge kwaliteit (bijv. Overwegend supercoiled en vrij van genomisch DNA, RNA en eiwit; sterk geconcentreerd; vrij van endotoxinen en zouten) en hoogwaardige celculturen (bijv. homogeen, lage doorlaat, monolaag, getransfecteerd in de exponentiële groeifase, vrij van mycoplasma).
2. Bereid op dezelfde dag van cotransfectie T/C28a2-chondrocyten voor.
   1. Bereid T/C28a2 celgroeimedium: 500 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM), 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 1% P/S. Bewaar het groeimedium bij 4 °C en verwarm tot 37 °C voor elk gebruik.
   2. Zaai 2 x 10⁵ T/C28a2 chondrocyten in twee multiplaten met 6 putjes en incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C en 5% CO₂.
3. Retroviraal infectieproces
   1. Aspireerkweekmedium uit HEK 293-T17 retrovirale verpakkingscellen verkregen uit stap 1.1.5. Spoel 1x af met 4 ml HBSS en aspireer HBSS op.
   2. Voeg 2 ml trypsine toe en wacht 2 minuten bij 37 °C. Neutraliseer trypsine door 6 ml HEK 293-T17 kweekmedium toe te voegen en cellen en medium over te brengen in conische buisjes van 15 ml.
   3. Centrifugeer de cellen op 400 x g gedurende 5 min. Breng het bovenstaande over naar een steriel filter via een membraan van 0,45 μm.
   4. Zuig het C/C28a2 chondrocytenkweekmedium op uit de 6 putjes van multiplaten. Infecteer T/C28a2-cellen door 2 ml virale suspensie (stap 1.3.3) per putje toe te voegen aan multiplaten met 6 putjes. Gebruik één putje voor controle (d.w.z. niet-getransfecteerde cellen) en voeg 2 ml T/C28a2-celgroeimedium toe in plaats van virale suspensie.
   5. Incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C en 5% CO₂ .
4. Om het selectieproces uit te voeren, gebruikt u een antibioticaselectie op getransfecteerde cellen om niet-getransfecteerde cellen te elimineren en een homogene celpopulatie te verkrijgen.
   OPMERKING: De pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B retrovirale vector biedt antibioticaresistentie bij zoogdieren tegen puromycine, waardoor de selectie van een stabiele celcultuur na virale transfectie mogelijk is. Kill-curven voor een optimale puromycineconcentratie van T/C28a2-chondrocyten moeten van tevoren worden opgesteld om de juiste voorwaarden vast te stellen voor het selecteren van de celklonen die het transgen met hoge expressieniveaus dragen.
   1. Bereid T/C28a2-pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B groeimedium voor op de stabiele cellijn: 500 ml DMEM, 10% FCS, 1% P/S en 2,5 μL/ml puromycine. Bewaar medium bij 4 °C en warm voor elk gebruik tot 37 °C.
   2. Verander het medium. Voor elke 6 putjes multiplate, aspiraat kweekmedium, spoel 1x met 2 ml HBSS en zuig het op. Voeg 2 ml medium toe en incubeer bij 37 °C en 5% CO₂. Dit is het begin van het selectieproces.
   3. Vervang het medium elke 2 dagen en observeer dode cellen en puromycine-resistente celpopulaties. Vergelijk de resultaten met de niet-getransfecteerde controlecellen, die niet resistent zijn tegen puromycine en afsterven.
5. Om met klonale selectie te beginnen, moet u ervoor zorgen dat de monoklonale populaties groeiden. Voor elke multiplaat met 6 putjes:
   1. Voeg 200 μL medium per putje toe aan een multiplaat met 96 putjes.
      OPMERKING: Elke afzonderlijke cel die uit de multiplaat met 6 putjes wordt geselecteerd, wordt geplateerd in individuele putjes van de multiplaat met 96 putjes.
   2. Gebruik een microscoop om elke monoklonale populatie in de multiplaten met 6 putjes te identificeren. Kolonies gevormd uit afzonderlijke cellen kunnen worden waargenomen.
   3. Zuig kweekmedium op van 6 putjes, spoel 1x met 2 ml HBSS en aspireer HBSS.
   4. Voeg 10 μL trypsine toe aan elke monoklonale populatie om afzonderlijke cellen over te brengen naar elk putje van de 96 putjes multiplaten. Incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C en 5% CO₂ .
6. Vervang het medium na 48 uur door 100 μL vers medium per putje. Herhaal deze procedure totdat er kolonies worden gevormd als gevolg van expansie van afzonderlijke cellen.
7. Zodra een enkele cel goed is geëxpandeerd, plaatst u elke monoklonale populatie in individuele putjes van celkweekplaten met 24 putjes, 6 putjes en 100 mm.
8. Genereer een stabiele monoklonale cellijn met behulp van een sorteermethode voor één cel.
   1. Aanzuigen van kweekmedium van 100 mm celkweekplaten. Spoel 1x af met 8 ml HBSS en zuig het op.
   2. Voeg op elke plaat 2 ml trypsine toe en incubeer gedurende 2 minuten bij 37 °C. Neutraliseer trypsine door 8 ml kweekmedium toe te voegen.
   3. Centrifugeer de cellen bij 252 x g gedurende 5 minuten en gooi de supernatant weg. Voeg 4 ml HBSS toe aan elke celpellet, suspendeer deze voorzichtig opnieuw en breng deze over naar cytometriebuisjes.
   4. Injecteer elk celmonster in een flowcytometer (Table of Materials) met celsorteertechnologie en scheid cellen met hoge groene en rode fluorescentie.
   5. Breng de geselecteerde cellen over op conische buizen van 15 ml en centrifugeer de cellen op 252 x g gedurende 5 minuten. Voeg de celpellet toe aan een T-25-kolf met 9 ml stabiel cellijngroeimedium. Incubeer bij 37 °C en 5% CO₂.
      OPMERKING: Na het sorteren van de cellen moeten drie monoklonale populaties (tabel 1) worden verkregen.
9. Verwijder na 24 uur het medium en voeg 8 ml vers medium toe. Herhaal deze procedure elke 2 dagen totdat de cellen samenvloeien.
   OPMERKING: Om de autofagische flux te bestuderen, kunnen twee controles worden gebruikt: rapamycine als een signaalreferentie met een hoge autofagische flux en chloroquine als een signaalreferentie met een lage autofagische flux. Bereid een rapamycinestockoplossing van 10 mM in dimethylsulfoxide (DMSO) en een chloroquinestockoplossing van 30 mM in H₂O en bewaar bij -20 °C. Om de beste monoklonale populatie te selecteren door de expressie mCherry en GFP te testen, kunnen twee methoden worden gebruikt: flowcytometrie (stap 1.10) of fluorescerende beeldanalyse met een hoog gehalte (stap 1.11).
10. Flowcytometrie
    1. Zaai ten minste 24 uur vóór de behandeling 2,5 x 10⁵ cellen per putje van elke monoklonale populatie in platen met 12 putjes in 1 ml groeimedium met stabiele cellijnen en incubeer bij 37 °C en 5 % CO₂ .
    2. Verwijder op de dag van de behandeling het medium, voeg 1 ml groeimedium voor stabiele cellijnen toe, aangevuld met 2% FCS per putje. Voeg 10 μM rapamycine en 30 μM chloroquine toe aan het groeimedium van de stabiele cellijn met 2% FCS en incubeer gedurende 16 uur bij 37 °C en 5% CO₂.
    3. Verwijder media, spoel af met 1 ml HBSS per putje en zuig het op.
    4. Voeg in elk putje 500 μL trypsine toe, incubeer 1 min bij 37 °C en neutraliseer de reactie door 500 μL kweekmedium toe te voegen. Schraap cellen en breng ze over in conische buizen.
    5. Centrifugeer de cellen bij 252 x g gedurende 5 minuten en zuig de supernatant op. Spoel de celpellets af met 500 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 252 x g en gooi het bovenstaande weg.
    6. Voeg 500 μL PBS toe, transferer cellen naar cytometriebuisjes en injecteer elk monster in de cytometrieapparatuur. Verzamel voor elke voorwaarde 10.000 gebeurtenissen.
    7. Om de monoklonale populatie te selecteren door middel van flowcytometrie, gebruikt u een laser van 488 nm om EGFP te exciteren en een laser van 633 nm voor mCherry. Stel vervolgens een verhouding van mCherry- en EGFP-fluorescentie vast om de celpopulatie met hoge en lage autofagische flux te selecteren.
11. Analyse van fluorescerende beelden met een hoog gehalte
    1. Zaai 4 x 10³ cellen van elke monoklonale populatie per putje in 384 putplaten (zwarte wand/doorzichtige bodem) in groeimedium aangevuld met 10% FCS, 1% P/S en 2,5 μL/ml puromycine. Incubeer gedurende 24 uur voorafgaand aan de behandeling bij 37 °C en 5% CO₂ .
    2. Verwijder het medium en voeg 10 μM rapamycine en 30 μM chloroquine toe in 50 μL groeimedium stabiele cellijn aangevuld met 2% FCS per putje. Incubeer gedurende 16 uur bij 37 °C en 5% CO₂.
    3. Verwijder het medium, spoel af met 50 μL HBSS per putje en zuig het op. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten bij 37 °C. Verwijder PFA en spoel af met 50 μL HBSS per putje.
    4. Om de celkernen te identificeren, kleurt u met Hoechst 33342 (2,5 μg/ml) gedurende 10 minuten bij 37 °C. Zuig de kleurstof Hoechst 33342 aan, spoel af met 50 μL HBSS per putje en voeg 50 μL PBS per putje toe.
    5. Voer gegevensverzameling en analyse uit van autofagische flux verkregen door het HTS-platform, zoals beschreven in sectie 3.
       OPMERKING: De criteria voor het selecteren van de monoklonale populatie zijn gebaseerd op het feit of de autofagische flux toenam of afnam met respectievelijk rapamycine of chloroquine (Tabel 1). Klonen met hoge niveaus van mCherry- en GFP-expressie zijn geschikter voor nauwkeurige kwantificering van autofagieflux met een hoog gehalte aan fluorescerende beeldanalyse.

2. Beeldgebaseerde autofagische fluxtest in levende chondrocyten

OPMERKING: Nadat u een kloon hebt geselecteerd, start u de test om de autofagische flux te kwantificeren.

1. Gebruik een draagbare elektronische 384-kanaals pipet om 4 x 10³ cellen van de geselecteerde kloon (stap 1.11) per putje in 384 putjes (zwarte wand/doorzichtige bodem) te zaaien in 50 μL stabiel cellijngroeimedium aangevuld met 10% FCS, 1% P/S en 2,5 μL/ml puromycine per putje. Incubeer gedurende 24 uur voorafgaand aan de behandeling bij 37 °C en 5% CO₂ .
2. Maak op de dag van het experiment een intervalplaat voor voor het toevoegen van verbindingen.
   1. Voeg een volume van elke verbinding/regelaars en stabiel cellijngroeimedium toe aan de intervalplaat met behulp van akoestische vloeistofverwerkingstechnologie en een elektronische 384-kanaals pipet om een intervalconcentratie te krijgen.
      OPMERKING: De controles in deze test omvatten een groeimedium voor stabiele cellijnen aangevuld met 2% FCS, 30 μM chloroquine en 10 μM rapamycine. Intervalconcentraties zijn afhankelijk van de gewenste eindconcentratie. In deze test werden bijvoorbeeld chloroquine en rapamycine toegevoegd in 50 μL stabiel cellijngroeimedium per putje om een intervalconcentratie van respectievelijk 300 μM en 100 μM te verkrijgen.
   2. Met behulp van een microplaatwasserrobot zuigt u op geautomatiseerde wijze het medium van de celplaat op en voegt u 45 μL stabiel cellijngroeimedium toe, aangevuld met 2% FCS per putje.
   3. Breng vervolgens 5 μL per putje over van de intervalplaat naar de testplaat om een eindconcentratie te krijgen met behulp van een ander geautomatiseerd werkstation voor vloeistofverwerkers.
3. Incubeer gedurende 16 uur bij 37 °C en 5% CO₂ . Gebruik een microplaatwasserrobot om het medium op te zuigen.
4. Fixeer cellen met 50 μL 4% PFA per putje gedurende 10 minuten bij 37 °C. Wassen met 50 μL HBSS per putje.
5. Kleur de kernen gedurende 10 minuten bij 37 °C met Hoechst 33342 (2,5 μg/ml). Zuig Hoechst 33342 aan en spoel af met 50 μL HBSS per putje.
6. Voeg 50 μL PBS per putje toe. De plaat is nu klaar om te lezen, gegevens te verzamelen en vervolgens te analyseren.
   OPMERKING: Dit protocol wordt beschreven voor screening met hoge doorvoer (HTS). Als er echter weinig verbindingen worden gebruikt, kunnen deze handmatig worden toegevoegd, zonder automatische instrumenten. Minimale manipulatie van cellen en supernatans met behulp van gekalibreerde vloeistofbehandelingsinstrumenten en/of elektronische pipetten vergemakkelijken een succesvolle voorbereiding van celkweekmonolagen voor kwantificering van autofagieflux door fluorescerende beeldanalyse met een hoog gehalte.

3. Data-acquisitie en analyse van autofagische flux

1. Gebruik voor gegevensverzameling een high-content screeningsysteem (HCS) en een geautomatiseerde microscoop, die geautomatiseerde beeldacquisitie en -analyse door middel van een beeldverwerkingsalgoritme mogelijk maakt.
2. Om een acquisitieprotocol te ontwikkelen, selecteert u verschillende kanalen en belichtingstijden (Tabel 2) om de kernen en de vorming van autofagosomen en autolysosomen tijdens autofagische fluxgebeurtenissen te identificeren.
3. Verzamel voor elke put beelden van vier velden die het putoppervlak bedekken en in vier stapels vanaf 8 μm, gescheiden door een werkafstand van 0,2 μm. Leg de beelden vast met behulp van een 60x objectief voor gedetailleerde celbeeldvorming.
4. Analyseer de gegevens met behulp van de beeldanalysesoftware van de HCS-microscoop. Om een robuust analyseprotocolalgoritme voor autofagiefluxmonitoring te ontwikkelen, selecteert u de meest geschikte methode voor geautomatiseerde segmentatie van celbeelden en voor het specifiek detecteren van de spikkels die overeenkomen met LC3-activering. Voer de uiteindelijke analysereeks uit door methoden, celsegmentatiestappen en kwantificeringsinstructies toe te voegen, zoals hieronder beschreven:
   1. Klik op de bouwsteen Find Nuclei en kies het nucleaire kleurstofkanaal Hoechst 33342. Selecteer Methode en kies de uitvoerpopulatie Nuclei.
   2. Klik op de bouwsteen Cytoplasma zoeken en kies het cytoplasmatische kleurstofkanaal Fluoresceïne. Selecteer methode | Individuele drempel.
   3. Klik op de bouwsteen Cytoplasma zoeken (2) en kies de RFP voor het cytoplasmatische kleurstofkanaal. Selecteer methode | Individuele drempel.
   4. Klik op het blok Populatieopbouw en selecteer de Kernen van de onderzoekspopulatie. Selecteer de methode Gemeenschappelijke filters (Grensobjecten verwijderen) en kies de uitvoerpopulatie Kernen Binnen Grenzen.
   5. Klik op het bouwblok Plekken zoeken en kies het specifieke markeringskanaal Fluoresceïne. Selecteer de onderzoekspopulatie Kernen Binnen grenzen en selecteer het onderzoeksgebied Cytoplasma. Selecteer Methode en kies de uitvoerpopulatie Spots Within Borders.
   6. Klik op het bouwblok Plekken zoeken (2) en kies de specifieke RFP voor het markeringskanaal. Selecteer de onderzoekspopulatie Kernen Binnen grenzen en selecteer het onderzoeksgebied Cytoplasma (2). Selecteer Methode en kies de uitvoerpopulatie Vlekken (2) Binnen Grenzen.
   7. Klik op de bouwsteen Eigenschappen intensiteit berekenen en kies het specifieke markeringskanaal Fluoresceïne. Selecteer de onderzoekspopulatie Nuclei Inside Borders en selecteer de onderzoeksregio Spot. Selecteer Methode en kies de uitvoereigenschappen Intensiteit Spot Fluoresceïne Binnen Randen.
   8. Klik op het bouwblok Eigenschappen intensiteit berekenen en kies de specifieke RFP voor het markeringskanaal. Selecteer de onderzoekspopulatie Nuclei Inside Borders en selecteer de onderzoeksregio Spot (2). Selecteer Methode en kies de uitvoereigenschappen Intensity Spot (2) RFP Inside Borders.
   9. Klik op het bouwblok Resultaten definiëren , selecteer populatiekernen binnen grenzen, selecteer Aantal objecten van kernen (gemiddelde), selecteer Relatieve intensiteit Spots Fluoresceïne - gemiddelde per put, en selecteer Relatieve intensiteit Spots (2) - RFP - gemiddelde per put.
5. Om de autofagische flux te kwantificeren, gebruikt u dezelfde methode die eerder is beschreven voor flowcytometrie-analyse¹¹. Bepaal de mCherry/EGFP-verhouding van vlekken met relatieve intensiteit.
   OPMERKING: Cellen met een hogere flux zijn minder groen, wat de mCherry/EGFP-verhouding in de cel verhoogt. Het identificeren en nauwkeurig kwantificeren van een betekenisvol aantal van de relevante signalen die afkomstig zijn van de autofagiefluxgebeurtenissen in de cellen is erg belangrijk om statistisch significante verschillen vast te stellen.

Resultaten

Autofagische flux kan in cellen worden gecontroleerd door farmacologische modulatie of door celstressrespons. Inmortale menselijke chondrocyten (T/C28a2) werden gebruikt om een autofagie-reportercellijn te ontwikkelen met behulp van LC3 als fluorescerende reporter (mCherry-EGFP-LC3B) voor autofagie. Figuur 1 toont de schematische workflow van de screeningstest, beginnend met de ontwikkeling van de autofagie-reportercellijn in menselijke chondrocyten (mCherry...

Discussie

Defecte autofagie is een belangrijk kenmerk van verouderingsgerelateerde gewrichtsdegeneratie, maar er zijn nog geen preventieve of ziektemodificerende behandelingen gericht op autofagie beschikbaar voor kraakbeendegeneratie². Gezien de relevantie en klinische implicaties ervan, is autofagie een interessant doelwit geworden voor de ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddelen, hoewel methoden om veranderingen in dit belangrijke homeostasemechanisme direct te volg...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100 mm cell culture plate	Corning	430167	Cell culture plate
12-well multiplate	Corning	353043	Cell culture plate
15 mL Centrifuge conical tube	Falcon-Corning	352095	Centrifuge conical tube
24-well multiplate	Corning	351147	Cell culture plate
25 cm2 Cell Culture Flask	Falcon-Corning	353014	Cell culture flask
384-well multiplate Cell Carrier	Perkin Elmer	6007550	Cell culture plate
6-well multiplate	Corning	351146	Cell culture plate
96-well multiplate	Corning	353077	Cell culture plate
Acoustic liquid handling technology	Labcyte	−	https://www.labcyte.com
Chloroquine	Sigma-Aldrich	C6628	autophagic flux inhibitor
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D2650	Disolvent
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Lonza, Basel, Switzerland	BE-604F	T/C28a2 growth medium
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)	ATCC	30–2003	HEK 293-T17 growth medium
FACScalibur cytometer	Becton Dickinson, CA	−	https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	F9665	HEK 293-T17 serum
Fetal Calf Serum (FCS)	Gibco by Life Technologies, CA	26010–074	Serum
FuGene	Promega	E2691	A nonliposomal mixture of lipids as a plasmid delivery method to create autophagy reported cell line
Handheld electronic 384 channel pipette	Integra	−	https://www.integra-biosciences.com/united-states/en/electronic-pipettes/viaflo-96384#downloads
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	Buffer
HEK 293-T17	ATCC	CRL-11268	Kidney cell line. Cells were used to facilitate retroviral packaging
High Content Screening System	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/product/operetta-cls-system-hh16000000
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	62249	DNA staining
Image Analysis Software	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/product/harmony-4-9-office-license-hh17000010
Liquid Handler workstation	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/category/janus-liquid-handler-workstations
Microplate washer robot	Biotek	−	https://go.biotek.com/405tradein
Opti-MEM® (1x)	Thermo Fisher Scientific	11058	Transfection medium
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Fixer
pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B	Addgene, Cambridge, MA	22418	Plasmid
pCL-Eco	Addgene, Cambridge, MA	12371	Plasmid
Penicillin-Streptomycin (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	Antibiotic
Phosphate-buffered saline (PBS)	MP Biomedicals	2810305	Buffer
Puromycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P8833	Antibiotic
Rapamycin	Calbiochem, Germany	5053210	autophagic flux activator
Software CellQuestPro	Becton Dickinson	−	https://www.bdbiosciences.com/en-eu
Syringe filters 0.45 μm	Corning	CLS431220	Sterile filter
T/C28a2	−	−	human chondrocytes cell line
Trypsin	Gibco by Life Technologies, CA	15400054	Trypsin used with T/C28a2 cells
Trypsin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SM-2002-C	Trypsin used with HEK 293-T17 cells
VSV.G	Addgene, Cambridge, MA	14888	Plasmid