Methodenartikel

Voorbereiding van acute menselijke hippocampal slices voor elektrofysiologische opnames

9.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/61085

⸱

7 mei 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology with Experimental Neurology, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 3Department of Neurosurgery, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Het gepresenteerde protocol beschrijft het transport en de voorbereiding van resected menselijk hippocampal weefsel met het uiteindelijke doel om vitale hersenenplakjes te gebruiken als een preklinische evaluatie tool voor potentiële anti-epileptica.

Samenvatting

Epilepsie treft ongeveer 1% van de wereldbevolking en leidt tot een ernstige afname van de kwaliteit van leven als gevolg van aanhoudende aanvallen en een hoog risico op plotselinge dood. Ondanks een overvloed aan beschikbare behandelingsopties is ongeveer 30% van de patiënten resistent tegen geneesmiddelen. Verschillende nieuwe therapieën zijn ontwikkeld met behulp van diermodellen, hoewel de snelheid van resistente patiënten ongewijzigd blijft. Een van de waarschijnlijke redenen is het gebrek aan vertaling tussen knaagdiermodellen en mensen, zoals een zwakke weergave van menselijke farmaceutie in diermodellen. Resected menselijk hersenweefsel als een preklinische evaluatie tool heeft het voordeel om deze translationele kloof te overbruggen. Hier beschreven is een methode voor een hoge kwaliteit voorbereiding van menselijke hippocampal hersenen plakjes en de daaropvolgende stabiele inductie van epileptiforme activiteit. Het protocol beschrijft de inductie van burst activiteit tijdens het aanbrengen van 8 mM KCl en 4-aminopyridine. Deze activiteit is gevoelig voor gevestigde AED lacosamide of nieuwe anti-epileptica kandidaten, zoals dimethylethanolamine (DMEA). Bovendien beschrijft de methode inductie van epileptische aanvallen-achtige gebeurtenissen in CA1 van menselijke hippocampale hersenen slices door vermindering van extracellulaire Mg2 + en de toepassing van biculline, een GABAA receptor blocker. De experimentele opstelling kan worden gebruikt om potentiële anti-epipileptische stoffen te screenen op hun effecten op epileptiforme activiteit. Bovendien kunnen mechanismen van actie die voor specifieke verbindingen worden gepostuleerd, worden gevalideerd met behulp van deze benadering in menselijk weefsel (bijvoorbeeld met behulp van patch-clamp-opnames). Tot slot zal het onderzoek naar vitale menselijke hersenweefsel ex vivo (hier, resected hippocampus van patiënten die lijden aan temporale kwab epilepsie) de huidige kennis van fysiologische en pathologische mechanismen in de menselijke hersenen verbeteren.

Inleiding

Epilepsie is een van de meest voorkomende neurologische aandoeningen, die 1% van de wereldbevolking treffen, en wordt geassocieerd met verhoogde morbiditeit en mortaliteit1,2. Helaas is een derde van de patiënten die lijden aan epilepsie resistent, ondanks een overvloed aan beschikbare behandelingsopties, waaronder meer dan 20 goedgekeurde anti-epileptica (AED's)3. Het niet vertalen van resultaten uit preklinisch dieronderzoek naar klinische studies is een van de redenen waarom veelbelovende behandelingsstrategieën bij veel patiënten niet effectief zijn4. Onlangs is aangetoond dat neuropeptide Y (NPY) en galanine anti-epileptische effecten hebben in diermodellen; hoewel, wanneer getest in gereseceerde menselijke hersenweefsel, alleen NPY was effectief5.

Het grootste deel van de bestaande kennis over elementaire neurologische mechanismen en ziektetherapie benaderingen komen voort uit diermodellen en celkweek experimenten. Hoewel informatief, deze modellen vertegenwoordigen slechts enkele aspecten van complexe menselijke ziekten en de volwassen menselijke hersenen netwerk. Als alternatief, menselijk hersenweefsel heeft het potentieel om de translationele kloof te overbruggen, maar is zelden beschikbaar voor functionele studies. Bijvoorbeeld, post mortem hersenweefsel is een waardevol instrument in het onderzoeken van eiwitexpressie, hersenmorfologie, of anatomische verbindingen, hoewel neuronale activiteit vaak wordt aangetast is dit weefsel6,7,8,,9,,10,11.

In tegenstelling, levende resected menselijk hersenweefsel is onderzocht met betrekking tot preklinische drug evaluatie, fundamentele neuronale functies en genexpressie patronen12,13,14,15,16,17. Een groot voordeel van menselijke hersenen plakjes in vergelijking met knaagdier plakjes is de lange levensvatbaarheid van neuronale weefsel na resectie en voorbereiding. Vergeleken met knaagdier hersenen plakjes, die meestal kan worden geregistreerd voor maximaal 8 uur na de voorbereiding, menselijke hersenen plakjes tonen stabiele neuronale activiteit voor maximaal 72 uur, waardoor grondig onderzoek van deze zeldzame en waardevolle monsters12,18.

Verschillende studies hebben de eigenschappen van epileptiforme activiteit onderzocht op verschillende gebieden van resected corticale en hippocampale menselijk weefsel en gebruikten verschillende methoden voor inductie van epileptiforme activiteit. In knaagdiersegmenten kan epileptiforme activiteit worden veroorzaakt door verschillende methoden: elektrische stimulatie van DG-hilarcellen, toename van extracellulaire K+ (8-12 mM KCl), het blokkeren van GABAA-receptoren door biculculline (BIC), het blokkeren van kaliumkanalen door 4-aminopyridine (4-AP), en het verwijderen of verminderen van Mg2+ in extracellulaire oplossing19. Het inductie van epileptiforme activiteit in menselijk weefsel vereist echter de combinatie van ten minste twee van de bovengenoemde methoden20,21,22.

Hier gepresenteerd is een methode voor de voorbereiding van menselijke hippocampal hersenen plakjes, die levensvatbaar zijn voor maximaal 20 uur en tonen inductie van epileptiforme activiteit op toepassing van hoge K+ (8 mM) en 4-AP of lage Mg2 + en BIC.

Protocol

Patiënten moeten voorafgaand aan de operatie geïnformeerde schriftelijke toestemming geven en voorafgaand aan het experiment moeten noodzakelijke ethische afspraken zijn. Wat de representatieve resultaten betreft, werden alle studies met menselijke deelnemers beoordeeld en goedgekeurd door Charité-Universitätsmedizin, Berlijn (EA2/111/14).

1. Voorbereiding van 10x-oplossingen

OPMERKING: Vanwege problemen bij het plannen van de toegang tot menselijk hersenweefsel, is het raadzaam om 10x-oplossingen voor te bereiden zoals hier beschreven. Als alternatief kunnen de uiteindelijke 1x-oplossingen vers worden bereid door afzonderlijke stoffen in de uiteindelijke concentratie toe te voegen aan dubbelgedestilleerd water (ddH2O).

  1. Voor individuele 10x-oplossingen voegt u stoffen toe aan ddH2O volgens tabel 1 en roer tot deze is opgelost.
  2. Gebruik 10x oplossingen tot 1 maand na de voorbereiding (tot 1 jaar voor bevroren 10x choline aCSF).
  3. Bereid voor 10x choline aCSF 50 mL aliquots van 10x 1.1 choline aCSF(tabel 1)en vries bij -20 °C of -80 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: Voeg geen glucose en CaCl2 tot 10x 1.1 choline aCSF toe om besmetting met bacteriën en neerslag van calciumcarbonaat te voorkomen.
  4. 10x oplossing 2 kan worden gebruikt voor alle 1x eindoplossingen, terwijl 10x oplossingen 1.1–1.4 worden aangepast en dienovereenkomstig genoemd (Tabel 1).

2. Voorbereiding van 1x definitieve oplossingen

LET OP: De uiteindelijke 1x-oplossingen moeten op de dag voor gebruik zo snel mogelijk worden bereid. Alle definitieve oplossingen moeten worden gecarbogenated met 5% CO2 en 95% O2 met behulp van een glazen gasdispersieer om oplossingen te verrijken met zuurstof, en de pH aan te passen aan 7,4 (max = 7,4 ± 0,2).

  1. Choline aCSF voor transport en voorbereiding
    1. Ontdooi voor de laatste 500 mL-oplossing een 50 mL aliquot van de 10x oplossing 1.1 aliquot voor choline aCSF in 37 °C waterbad.
    2. Voeg de ontdooide 50 mL aliquot van de 10x oplossing 1.1 en 50 mL 10x oplossing 2 toe aan ongeveer 300 mL ddH2O.
    3. Voeg de laatste glucoseconcentraties en CaCl2 toe en roer tot ze zijn opgelost(tabel 1, oplossing 1.1).
    4. Voeg ddH2O toe aan een eindvolume van 500 mL en meet de osmolariteit (300 mOsm ± 10 mOsm).
    5. Gebruik optioneel een filter om de oplossing te steriliseren (zie discussie over langdurige levensvatbaarheid van de slice onder steriele omstandigheden).
    6. Vul een aparte fles met ongeveer 100 mL 1x choline aCSF voor transport van de operatiekamer naar het laboratorium.
    7. Optioneel: afhankelijk van de transporttijd van de operatiekamer naar het laboratorium, u overwegen gasdichte flessendoppen te gebruiken om een stabiele pH van aCSF te garanderen tijdens langere transportperiodes.
    8. Bewaar de uiteindelijke oplossing op 4-8°C tot verder gebruik.
    9. Op de dag van de werking, chill 1x choline aCSF op ijs en carbogenate voor ten minste 10-15 min met behulp van een glazen gasdispersieer aangesloten op carbogen gas (5% CO2, 95% O2).
      OPMERKING: Overweeg om een gasfles toegankelijk te houden voor de operatiekamer in het geval van langere wachttijden, waarvoor de transportoplossing opnieuw moet worden geïrbatied. We hebben echter hippocampal weefsel vervoerd zonder re-carbogenation voor lange en korte transporttijden (15 min vs. 60 min) en hebben geen verschillen in inductie van epileptiforme activiteit waargenomen.
  2. aCSF voor opslag en opname
    1. Voeg voor een laatste 2 L-oplossing 200 mL 10x oplossing 1.2 (aCSF) en 200 mL 10x oplossing 2 en glucose(tabel 1)toe aan ~1500 mL ddH2O.
      OPMERKING: De volumes van de uiteindelijke oplossingen zijn afhankelijk van toegepaste experimenten en het type kamer dat wordt gebruikt voor het opslaan en registreren.
    2. Voeg ddH2O toe aan een eindvolume van 2 L en meet de osmolariteit (300 mOsm ±10 mOsm).
    3. Verwarm de oplossing voor 35 °C en carbogenate gedurende ten minste 10-15 minuten voor gebruik.
  3. HighK++4-AP aCSF voor inductie van burst-activiteit
    1. Voeg voor een laatste 1 L-oplossing 100 mL 10x oplossing 1.3 (highK++4-AP aCSF) en 100 mL 10x oplossing 2 tot ~700 mL ddH2O toe.
    2. Voeg glucose en 4-AP (eindconcentratie = 100 μM) toe volgens tabel 1.
    3. Voeg ddH2O toe aan het eindvolume van 1 L en meet de osmolariteit (300 mOsm ±10 mOsm).
    4. Verwarm de oplossing voor 35 °C en carbogenate gedurende ten minste 10-15 minuten voor gebruik.
  4. LowMg2++BIC aCSF voor inductie van epileptische aanvallen (SLEs)
    1. Voeg voor een laatste 1 L-oplossing 100 mL 10x oplossing 1.4 (lowMg2++BIC aCSF) en 100 mL 10x oplossing 2 tot ~700 mL ddH2O toe.
    2. Voeg glucose en BIC (eindconcentratie = 10 μM) toe volgens tabel 1.
    3. Voeg ddH2O toe aan het eindvolume van 1 L en meet de osmolariteit (300 mOsm ± 10 mOsm).
    4. Verwarm de oplossing voor 35 °C en carbogenate gedurende ten minste 10-15 minuten voor gebruik.

3. Voorbereiding van de interfacekamer

  1. In een interfacekamer rusten plakjes op drie lagen filterpapier om voldoende oplossing onder het segment te garanderen. Om dit te doen, snijd twee ~ 4 cm x ~ 2 cm stukjes filterpapier voor elk segment-holding compartiment (de beschreven interface kamer bestaat uit twee compartimenten) en leg ze op de top van elkaar.
  2. Plaats dunne katoenen snaren rond de 4 cm x 2 cm filterpapier in de compartimenten om de spanning van de oplossing te breken. Zorg voor een gelijkmatige doorstroming (hier worden zwarte nylon panty's die tot dunne snaren ~ 10 cm lang zijn gesneden gebruikt; voor plaatsing, zie figuur 1).
  3. Plaats kleine stukjes filterpapier bovenop het grotere filterpapier in de compartimenten met plakjes. Kleine stukjes filterweefsel moeten ongeveer de grootte van een hersenschijf (~ 1,5 cm x ~ 1,0 cm) en zal verdere behandeling van individuele plakjes mogelijk te maken. Plaats drie tot vier kleine stukjes filterpapier in elk compartiment.
  4. Zorg voor een aCSF-stroomsnelheid van 1,8 mL/min met een peristaltische pomp.
  5. Carbogenate en prewarm de interface kamer tot ~ 35 °C (de uiteindelijke temperatuur van de slice moet ~ 32 °C).

4. Oprichting van het voorbereidingsgebied

OPMERKING: De bereiding kan onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd om besmetting en langwerpige overleving van de slice te voorkomen. Echter, niet alle vibratomen passen onder een steriele kap, en andere maatregelen zijn nodig om besmetting te verminderen tijdens de voorbereiding. In deze sectie worden enkele van deze maatregelen beschreven.

  1. Veeg het bereidingsgebied af met 70% EtOH en leg aluminiumfolie of steriele afdekkingen bovenop het gebied.
  2. Bereid superlijm, twee scherpe pincet, een spatel, een scalpel met messen, en een mes voor ruw snijden van het hersenweefsel. Gereedschappen kunnen voorafgaand aan de procedure worden gesteriliseerd om besmetting te verminderen.
  3. Veeg de bufferlade en de monsterplaat van de vibratome af met 70% EtOH. Zodra de bufferlade volledig droog is, bedek deze met aluminiumfolie en plaats de lade in het ijsbad. Vul het ijsbad met gemalen ijs en houd op -20 °C tot de voorbereiding.
  4. Veeg het vibratome en scheermesje af met 70% EtOH en kalibreer het vibratome om verticale trillingen en weefselschade tijdens de snijprocedure te minimaliseren.

5. Weefsel snijden en opslaan

  1. Direct na de resectie, plaats het weefsel onmiddellijk in de kou, carbogenated choline aCSF en vervoer snel naar het laboratorium.
    LET OP: Draag tijdens de voorbereiding te allen tijde handschoenen en een gezichtsmasker, omdat menselijk hersenweefsel potentiële ziekteverwekkers kan bevatten. Bovendien, het dragen van een gezichtsmasker bij het niet werken onder een steriele kap zal sterk verminderen besmetting van oplossingen en hersenweefsel.
  2. Verwijder weefsel uit choline aCSF en snijd alle verbrande delen van weefsel weg.
  3. Snijd een gelijkmatig oppervlak om weefsel stuk lijm op het monster plaat, terwijl rekening houdend met het snijden hoek en weefsel lagen. Idealiter bevat een hippocampal slice DG, CA1-4 en (indien mogelijk) subiculum.
  4. Snijd het hersenweefsel in plakjes van 400 μm dik en pas de amplitude en snelheid aan tijdens het snijden. Als gevolg van mogelijke resterende pia mater, menselijk hersenweefsel toont meer weerstand en kan vereisen langzamer snijden.
    OPMERKING: Slice dikte sterk van invloed op het beschikbare netwerk (meer neuronen in dikkere plakjes) of de levensvatbaarheid van de slice (penetratie van de oplossing in de slice). We hebben 500 μm-segmenten gebruikt om het mogelijk beschikbare micronetwerk te vergroten en konden geen verschillen in inductie van epileptiforme activiteit waarnemen. 300 μm-segmenten worden vaak gebruikt voor patchklemexperimenten, hoewel de inductie van epileptiforme activiteit in deze segmenten hier nog niet is getest. We gebruiken 400 μm als standaard plakdikte, hoewel 300-500 μm plakjes voldoende kunnen zijn.
  5. Gebruik voor het verzamelen een scalpel om de grootte van hersenschijfjes te verkleinen om in de opnamekamer te passen. Voor gebruik van de membraankamer (zie punt 6) moeten de plakjes maximaal 1,5 cm x 1 cm bedragen. Houd bij het verminderen rekening met de specifieke lagen en verbindingen die nodig zijn om intact te zijn voor de opname (bijvoorbeeld voor opname in de CA1 en DG, snijd het subiculum en het omringende witte weefsel weg).
  6. Met behulp van een spatel en kleine tangen, zorgvuldig plaatsen plakjes in de interface kamer op kleine filterpapieren en laat ze rusten voor ~ 1 uur in aCSF tot de opname.
  7. Plakjes kunnen tot 20 uur worden geregistreerd (zelfs langer wanneer ze onder steriele omstandigheden zijn).

6. Registratie van epileptiforme activiteit

  1. In de membraankamer (ondergedompelde type opnamekamer), plaats de hersenen slice op een transparante halflaatbare membraan, die is gelijmd aan een plastic ring24. Gebruik hiervoor superlijm om de plastic ring aan het membraan van een celkweekinzet te bevestigen.
  2. Gebruik een scalpel om een membraan aan de buitenkant van de plastic ring te verwijderen. Zorg ervoor dat het membraan gelijkmatig en volledig aan de ring is bevestigd voordat u het membraan in de kamer plaatst.
    LET OP: Het membraan kan worden opgeslagen in ddH2O bij 4-8 °C en maximaal 1 maand worden hergebruikt. Houd het membraan te allen tijde nat.
  3. Zowel de in- als uitstroom van de membraankamer zijn aangesloten op buizen voor oplossingsvoorziening. Plaats de buizen in een peristaltische pomp, zodat de in- en uitstroom in tegengestelde richting bewegen.
  4. Plaats de in- en uitstroombuis in carbogenated, voorverwarmd aCSF totdat alle buizen en de kamer zijn gevuld met oplossing. Pas de snelheid van de peristaltische pomp aan om een gelijkmatige stroomsnelheid van 10-13 mL/min te bereiken.
    OPMERKING: De hier gebruikte membraankamer is een hoge stroomsnelheid, een ondergelopen type opnamekamer die een oplossingsstroom tot 14 mL/min24mogelijk maakt. In het geval van het gebruik van een andere ondergelopen type opnamekamer, moeten de stroomsnelheden worden aangepast. Echter, voor inductie van epileptiforme activiteit, is het sterk aanbevolen om de membraankamer te gebruiken.
  5. Gebruik een verwarmingselement dat is aangesloten op de instroom in de nabijheid van de membraankamer om een stabiele temperatuur van 32 °C te garanderen.
  6. Bereid 1-2 MΩ glazen pipetten met behulp van een verticale trekker. Vul pipetten met 154 mM NaCl-oplossing en plaats ze in een elektrodehouder.
  7. Met behulp van een pincet en een spatel, verwijder een hippocampal slice uit de interface kamer door het nemen van de slice met het kleine filter papier en het plaatsen van zowel in een petrischaal gevuld met carbogenated aCSF. Haal het kleine filterpapier uit het hippocampal-segment en breng (indien nodig) wat kracht aan met behulp van een pipet om het plakje van het filterpapier te scheiden. Pas op dat u het segment niet omdraait.
  8. Plaats het segment in de opnamekamer en houd het op zijn plaats met behulp van slice mesh.
    OPMERKING: Volgens het principe van Bernoulli zijn in de gebruikte membraankamer in het gebruikte type membraankamer de plakjes meestal stabiel zonder gebruik te maken van een extra snijgaas.
  9. Plaats elektroden in de regio en de laag van belang (hier, CA1) en beginnen met opnemen.
  10. Record veld potentiële activiteit in de huidige klem modus met een sampling rate van 10-20 kHz en low-pass gefilterd op 2 kHz.
  11. Record basale activiteit in aCSF voor maximaal 5 min.
  12. Schakel de instroombuizen van aCSF naar highK++4AP of lowMg2++BIC aCSF en de uitstroombuis naar een afvalcontainer om het mengen van oplossingen te voorkomen. Na 2 min, plaats de uitstroombuis in dezelfde oplossing als de instroom om oplossing te besparen.
  13. Burst activiteit veroorzaakt door highK++4-AP moet 2-5 min zichtbaar zijn na de wasbeurt. Echter, inductie van SLEs door lowMg2 ++BIC kan tot 30 min duren. Verander indien nodig de posities van elektroden zorgvuldig om optimale resultaten te verkrijgen.
  14. Eenmaal in de laatste positie, record baseline activiteit voor ten minste 20 min. Als u DED's opneemt, moet u rekening houden met langere basisregistraties vanwege de lage frequentie van DES.
  15. In het geval dat de basisactiviteit stabiel is (plateau van gebeurtenisfrequentie), was in het gewenste medicijn. Merk op dat als gevolg van de hoge stroomsnelheid wassen in van drugs duurt slechts 2-5 min, waardoor voor een snelle oplossing uitwisseling.
  16. Record activiteit tijdens de toepassing van geneesmiddelen van ten minste 20 min, na uitwassen. De activiteit moet gedurende ten minste 60-90 minuten stabiel zijn, zodat langere opnames mogelijk zijn.

7. Analyse

  1. Analyse van frequentie en amplitude kan worden uitgevoerd met alle beschikbare software. Tot nu toe zijn we niet in staat geweest om een betrouwbare automatische analyse van DSE's of burst-activiteit vast te stellen, en in plaats daarvan gebruikt een semi-geautomatiseerde analyse met visuele bevestiging van de geïdentificeerde activiteit.
  2. Burst-activiteit wordt gekenmerkt door bifasische, positieve en negatieve afbuiging en een duur van ≥100 ms. Alle gebeurtenissen die visueel worden geïdentificeerd als burst-activiteit (bijvoorbeeld semi-automatisch door drempelanalyse) moeten handmatig worden aangegeven voor verdere analyse van de gebeurtenisfrequentie (inter-gebeurtenisinterval, IEI), amplitude en het totale aantal gebeurtenissen tijdens het geanalyseerde tijdsbestek.
    OPMERKING: Vanwege de hoge frequentie van burst-activiteit wordt de laatste 5 minuten van elke toepassingsfase meestalgeanalyseerd 20.
  3. SLEs kunnen worden geanalyseerd zoals beschreven in Heuzeroth et al. Geïdentificeerde SLEs kunnen verder worden geanalyseerd voor duur, amplitude, piekfrequentie en duur van tonic (hoge frequentie spiking) vs. clonic (lage frequentie spiking) fase duur. SLA's die <10 s in duur zijn, moeten van de analyse worden uitgesloten.
    OPMERKING: Voor preklinische evaluatie van mogelijke anti-epileptica worden effecten op burst-activiteit (veroorzaakt door highK++4AP) onderzocht als gevolg van gevestigde inductie in gereseceerde hippocampalweefsel. Voorlopige resultaten over de inductie van SLEs met behulp van lowMg2 ++BIC zijn gemeld (Figuur 2), hoewel de analyse van deze gegevens hier niet is opgenomen.

Resultaten

Epileptiforme activiteit is met succes geregistreerd in resected menselijk hippocampal weefsel afkomstig van maximaal 15 patiënten. Het opzetten van stabiele transport- en voorbereidingsprocedures is van cruciaal belang voor een succesvolle inductie van epileptiforme activiteit in menselijk hersenweefsel. Onlangs gepubliceerde resultaten hebben aangetoond 1) stabiele inductie van epileptiforme activiteit in resected weefsel van verschillende patiënten evenals 2) het gebruik van resected menselijk hersenweefsel als een preklinisch instrument voor de evaluatie van nieuwe anti-pileptische mechanismen14,20.

Toepassing van highK++4-AP geïnduceerde epileptiforme activiteit in de vorm van burst activiteit binnen een paar minuten (Figuur 2A,B,C,D). Als gevolg van een lage neuronale verdeling in menselijk hippocampaalweefsel of hoog neuronaal celverlies als gevolg van temporale kwab epilepsie (TLE), kan de plaatsing van elektroden worden aangepast in het begin van de opname. In gevallen waarin burst-activiteit van segmenten na 10 minuten niet zichtbaar is in het CA1-gebied (onafhankelijk van plaatsing van elektrode), kan de levensvatbaarheid van de schijf worden aangetast en moet het segment worden vervangen.

SLA's, met een duur van >10 s, kunnen worden geïnduceerd met toepassing van lowMg2++BIC (Figuur 2E,F). Figuur 2E toont een stabiele inductie van SSE's na een paar minuten en een stabiele frequentie gedurende de opname. Hier werd de SLE-activiteit met succes geïnduceerd in twee van de vier segmenten van de onderzochte patiënt. Een segment toonde alleen burst activiteit na 15 min SLE activiteit, terwijl de andere slice niet sles zelfs na 40 min toonde.

Voor preklinische evaluatie van substantieeffecten werd een mogelijk anti-epileptisch effect op de burstactiviteit veroorzaakt door highK++4-AP onderzocht. Bekende en potentiële anti-epileptica (lacosamide, DMEA, dynorfine14)werden getest, en voorbeelden worden hier getoond voor de conventionele AED lacosamide (een natriumkanaalblokker) en DMEA (een nieuwe potentiële anti-pileptische stof)20. Het aantal gebeurtenissen en inter-event interval (IEI) van burst gebeurtenissen daalde zowel tijdens de toepassing van lacosamide en DMEA (Figuur 3C), hoewel amplitudes waren meestal onaangetast (Figuur 3D). In een subset van plakjes, hoewel inductie van burst-gebeurtenissen werd bereikt in de eerste paar minuten, de frequentie van de activiteit niet herstellen tijdens het wassen van de toegepaste AED's (gegevens die hier niet worden weergegeven, zie Kraus et al.20). Hier werden de toegepaste geneesmiddelen beschouwd als effecten; echter, dalingen van burst activiteit kan zijn beïnvloed door het geleidelijke verval in de activiteit tijdens lange opnames. De resultaten moeten dus zorgvuldig worden geïnterpreteerd.

figure-results-1
Figuur 1: Interfacekamer. Voor het opslaan van menselijke hippocampal hersenen plakjes, een interface kamer met twee hersenen slice holding compartimenten wordt gebruikt (A); specifiek, een Haas-type interface kamer23. Hier rusten de plakjes van hippocampal hersenen op (d) drie lagen filterpapier,e) kleinere stukken om de behandeling van individuele hersenschijfjes mogelijk te maken, en (f) grotere filterpapierstukken om een voldoende oplossingslaag onder het segment te garanderen. (c) Een katoenen snaar rond de plakjes van de hersenen, bovenop het filterpapier, zorgt voor een gelijkmatige oplossingsstroom van de inhammen aan de (a)bovenkant van het compartiment. bb) Een deksel leidt zuurstof van onder het compartiment op het plakje. (B) Bovenste weergave van één compartiment met plaksluiting. (C) Zijaanzicht om de lagen filterpapier te illustreren. (g)Onderkant van de kamer. (h) Buis voor oplossingsinstroom, die is aangesloten op een peristaltische pomp (blauwe pijlen markeren de richting van de oplossingsstroom). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Epileptiforme activiteit in menselijke hippocampal plakjes veroorzaakt door highK++4-AP en lowMg2++BIC. CA1 voorbeeldopnames en fragmenten van toepassing van highK+ (8 mM)+4-AP (100 μM) (A,B,C,D) en lowMg2++BIC (10 μM) (E,F). (A) Badtoepassing van highK++4-AP induceert epileptiforme activiteit binnen een paar minuten, en de activiteit is stabiel gedurende ten minste 60 min. Details van (A) kan worden gezien in (B). Twee verschillende soorten activiteit worden geïnduceerd in het CA1-gebied van menselijke hippocampal-segmenten: interictal-achtige pieken (C, details van [B]) en burstactiviteit (D, details van [B]). Burst-activiteit bleek gevoelig te zijn voor anti-epileptica en werd daarom geanalyseerd op het effect van potentiële anti-epileptica(figuur 3). (E,F) Toepassing van lowMg2++BIC induceert SSE's met een duur van >10 s (F)in CA1 binnen een paar minuten. De inductie van SED's kan echter tot 30 minuten in andere plakjes duren. Schaalbalken = 0,2 mV, 2 min (A,E), 5 s (B), 500 ms (C,D), 5 min (E) en 2 s (F). Dit cijfer is aangepast van Kraus et al.20. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Afname van epileptische uitbarstingsactiviteit van menselijke plakjes tijdens het aanbrengen van lacosamide of DMEA. Burst activiteit daalde tijdens het aanbrengen van (A) lacosamide en (B) DMEA, een potentiële nieuwe anti-epileptische molecuul. A) en (B) vertonen voorbeeldige opnamen van het CA1-gebied met fragmenten van regio's die worden gebruikt voor analyse in de deel C en (D). Burst activiteit verminderde tijdens lacosamide (100 μM) en DMEA (10 mM) toepassing, zoals gezien door middelste fragmenten en neemt weer toe tijdens het uitwassen. (C.D) Aantal en amplitude van burst activiteit werden geanalyseerd voor de laatste 5 minuten van elke toepassingsfase (baseline, lacosamide / DMEA, uitwassen) en getoond als samengevatte resultaten voor alle patiënten (aantal voorvallen, C; amplitude, D) als gemiddelde ± SD. Elke stip geeft één patiënt aan. Sterretjes markeren significante verschillen zoals beoordeeld door friedmantest en post-hoc met Dunnett's meervoudige vergelijking van groepen voor analyse van de toepassing van lacosamide (*p < 0,05, n = 4) of door herhaalde meting ANOVA en post-hoc met Tukey's vergelijking voor analyse van DMEA-toepassing (**p < 0,01, n = 10). Schaal balken = 0,2 mV, 2 min (volledige opname, A), 5 s (fragmenten, A), 3 min (volledige opname, B), en 1 s (fragmenten, B). Dit cijfer is aangepast van Kraus et al.20. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Oplossing 1.1 choline aCSF
Stof10x concentratie (mM)1x concentratie (mM)Opmerking
choline Cl1100110
(+)-Na L-ascorbaat11611.6
MgCl2x6H2O707
Na pyruvate313.1
Kcl252.5
NaH2PO412.51.25
NaHCO326026
CaCl2 CaCl2-0.5toevoegen aan de uiteindelijke oplossing
Glucose-10toevoegen aan de uiteindelijke oplossing
Oplossing 1.2 aCSF
Stof10x concentratie (mM)1x concentratie (mM)Opmerking
Nacl1290129
NaH2PO412.51.25
CaCl2 CaCl2161.6
Kcl303
MgSO4 MgSO4181.8
Glucose-10toevoegen aan de uiteindelijke oplossing
Oplossing 1.3 highK++4-AP aCSF
Stof10x concentratie (mM)1x concentratie (mM)Opmerking
Nacl1240124
NaH2PO412.51.25
CaCl2 CaCl2161.6
Kcl808
MgSO4 MgSO4181.8
Glucose-10toevoegen aan de uiteindelijke oplossing
4-AP-0.1toevoegen aan de uiteindelijke oplossing
Oplossing 1.4 lowMg2++BIC aCSF
Stof10x concentratie (mM)1x concentratie (mM)Opmerking
Nacl1300130
NaH2PO412.51.25
CaCl2 CaCl2161.6
Kcl303
Glucose-10toevoegen aan de uiteindelijke oplossing
Bic-0.01toevoegen aan de uiteindelijke oplossing
Oplossing 2
Stof10x concentratie (mM)1x concentratie (mM)Opmerking
NaHCO321021

Tabel 1: Voorbereiding van 10x en laatste 1x oplossingen voor transport, voorbereiding en opname.

Discussie

Levend resected menselijk hersenweefsel is een zeer waardevol instrument in preklinische evaluatie van AED's, omdat het goed vertegenwoordigt een intact menselijk hersenmicro-netwerk. Het gepresenteerde protocol beschrijft een methode voor weefseltransport en -bereiding, die zorgt voor hoogwaardige hippocampale plakjes en een stabiele inductiemethode voor epileptiforme activiteit die cruciaal is voor AED-evaluatie.

Onderzoek naar epileptiforme activiteit en methoden voor chemische of elektrische inductie in menselijke hersenenplakjes zijn eerder aangetoond door andere groepen17,20,21,22. Dit protocol beschrijft de inductie van stabiele burst activiteit in plakjes van verschillende patiënten via toepassing van hoge K++4-AP evenals inductie van SLEs in CA1 gebied via toepassing van lage Mg2 ++BIC. Het bleek dat de inductie van burst-activiteit consistenter is (80% van de geteste plakjes bij 15 patiënten) dan de inductie van SSE's (50% van de geteste plakjes bij één patiënt). Tot nu toe is de inductie van SLEs echter slechts bij één patiënt getest. Niettemin wordt inductie van SLEs door lage Mg2++BIC aanbevolen, omdat SLEs nog niet kunnen worden geïnduceerd met behulp van hoge K++4-AP.

Verschillende studies hebben methoden geïntroduceerd voor het vervoer en de voorbereiding van menselijk hersenweefsel en vaak wijzen op drie factoren die van cruciaal belang zijn voor de neuronale overleving: transporttijd, gebruikte transportoplossingen en opslagomstandigheden.

Voor een optimale levensvatbaarheid van de slice, sommige groepen suggereren dat het vervoer van gereseceerde hersenweefsel zo kort mogelijk. Echter, operatiekamers en laboratoria zijn zelden in de nabijheid, wat betekent dat de kwaliteit van de slice kan worden aangetast als gevolg van lange transport. Sommige groepen hebben dit obstakel overwonnen door constante O2 toe te passen op de oplossing tijdens het vervoer12. We hebben getransporteerd hersenweefsel voor korte (max = 15 min) en lange (tot 1 uur) perioden zonder constante extra O2 levering tijdens het vervoer, vergelijkbaar met andere groepen18,25. In deze gevallen werden verschillen in weefselkwaliteit niet waargenomen tijdens epileptiforme opnames. In de communicatie met andere groepen in ons instituut veranderde de kwaliteit van de snijvlakken ook niet voor patch-clamp experimenten. In tegenstelling, variantie in de kwaliteit van het weefsel mogelijk het gevolg is van schade tijdens operaties, langdurige resectie, en snijden procedure.

Met betrekking tot transport- en snijoplossing laten alle gepubliceerde methoden NaCl weg van oplossingen om zwelling van cellen als gevolg van osmotische druk te verminderen, vergelijkbaar met de standaardprocedure voor patchklemexperimenten voor knaagdieren. Tot nu toe zijn er echter verschillende substituten geïntroduceerd (d.w.z. sucrose gebaseerde aCSF13,22, op NMDG gebaseerde aCSF12,26en choline-gebaseerde aCSF27). Ting en collega's introduceerden de NMDG-gebaseerde aCSF voor de voorbereiding van de slice in 201426 en voegden later een herstelprotocol toe, dat nacl langzaam herintroduceert in de segmenten28. Echter, zoals beschreven door Ting et al., neuronen van hersenweefsel bereid in NMDG-gebaseerde aCSF tonen een hogere membraanbestendigheid, waardoor hele-cel afdichting tijdens patch-clamp experimenten26. Daarom zijn we overgestapt van NMDG-gebaseerde aCSF naar het gebruik van choline-gebaseerde aCSF20,die hoogwaardige slices oplevert voor zowel veldpotentieel als patch-clamp opnames.

Wat de opslag van plakjes betreft, wordt algemeen aanvaard dat interfaceomstandigheden optimale oxygenatie bieden die cruciaal zijn voor lange slice-overleving18. Echter, andere groepen tonen slice survival voor maximaal 72 uur onder ondergedompelde omstandigheden12. In tegenstelling tot eerdere hypothese, menselijke hersenen plakjes lijken meer bestand tegen lage oxygenatie of oxidatieve stress in vergelijking met knaagdier plakjes. In de eerste plaats zijn interfacekamers eerder gebruikt voor het opslaan van menselijke hippocampal-plakjes, hoewel ondergedompelde omstandigheden worden aanbevolen voor het onderhoud van menselijke hersenensegmenten in patch-clamp experimenten.

Zoals besproken door andere groepen, een extra kritische stap voor lange slice overleven (interface voor <48 h18, ondergedompeld voor <72 h12) is de preventie van bacteriële besmetting. Knaagdier hersenen plakjes worden meestal gebruikt in elektrofysiologische opnames voor maximaal 8 uur, en bacteriële besmetting wordt niet beschouwd als de levensvatbaarheid van de slice beïnvloeden tijdens deze periode. Hoog aantal plakjes bereid uit een resectie en de ongewone beschikbaarheid van menselijk hersenweefsel wijst op de noodzaak om de levensvatbaarheid van de menselijke hersenen plakjes te verlengen. Deze methode beschrijft met succes de voorbereiding van levende menselijke hippocampal hersenen plakjes, die gemakkelijk kunnen worden aangepast aan steriele omstandigheden. Echter, voor de opnames hier uitgevoerd, slice survival uitbreiding van 20 uur was geen prioriteit.

Opname in interfacekamers is ook essentieel gebleken voor het inductie van epileptiforme activiteit zoals SLEs22. Ondergedompelde omstandigheden, als gevolg van lage oxygenatie, worden zelden gebruikt voor het registreren van SLEs; ze zijn echter nodig voor optische hoge resolutie die nodig is voor patch-clamp experimenten. Het gebruik van een geoptimaliseerde onderwater type opnamekamer maakt het mogelijk de opname van epileptiforme activiteit (extracellulair veld of enkel neuron) in menselijke hersenen plakjes, als gevolg van hoge oxygenatie en snelle toepassing van geneesmiddelen29. Hier worden methoden en resultaten voor veldpotentieelopnames beschreven, maar het moet worden benadrukt dat patchklemopnamen met succes zijn uitgevoerd in muis- en menselijke hersensegmenten met behulp van deze gewijzigde opnamekamer (gegevens die niet zijn weergegeven).

Resected menselijk hersenweefsel heeft een hogere translationele waarde in vergelijking met knaagdier modellen. Het vertegenwoordigt een volwassen, zieke neuronale netwerk dat niet kan worden gereproduceerd door IPSCs. Echter, zoals in elk in vitro systeem, menselijke hersenen plakjes vertegenwoordigen geen intact menselijk brein. Bovendien kunnen de geregistreerde neuronale netwerken van gereseceerd hersenweefsel aanzienlijke moleculaire en functionele veranderingen ondergaan als gevolg van schade tijdens de operatie of voorbereiding. Snijprocedures blijken de GABAergic-functie te beïnvloeden en kunnen de inductie van epileptiforme activiteit30beïnvloeden. Deze beperkingen moeten worden overwogen bij het formuleren van een hypothese. Bij het testen van potentiële anti-epileptica moet het gebruik van verschillende hersengebieden worden overwogen, omdat medicijndoelen mogelijk niet in alle menselijke hersengebieden of alle patiënten worden uitgedrukt. In het bijzonder vertonen de hippocampi van TLE-patiënten vaak tekenen van hippocampale sclerose die gepaard gaan met ernstig neuronaal celverlies. Het wordt aanbevolen om patiëntinformatie te verkrijgen over pathologische veranderingen en ziektegeschiedenis, zoals potentiële vuurvastheid ten opzichte van medicijnen, en dit te overwegen tijdens de interpretatie van gegevens.

Tot slot, deze methode beschrijft met succes de voorbereiding van levende menselijke hippocampal hersenen plakjes en inductie technieken voor het opnemen van twee verschillende soorten epileptiforme activiteit. Aangezien de beschikbaarheid van levend menselijk hersenweefsel zeldzaam is, moeten geoptimaliseerde transport- en opnameomstandigheden worden gebruikt om maximale output van experimenten met menselijke hersensegmenten te garanderen. Er wordt gesuggereerd dat resected menselijk hersenweefsel kan worden gebruikt als een preklinische validatie tool in aanvulling op knaagdier modellen en celcultuur experimenten.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

Wij danken Mandy Marbler-Pötter (Charite-Unversitätsmedizin, Berlijn) voor uitstekende technische bijstand. P.F. werd gefinancierd door de German Research Foundation (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) in het kader van de Duitse Excellence Strategy-EXC-2049-390688087. Dit werk is ondersteund door het QUEST Center for Transforming Biomedical Research van het Berlijnse Instituut voor Gezondheid.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(+)-Na L-ascorbateSigma AldrichA4034
4-APSigma Aldrich275875-5G
BladeseliteSERVE GmbHHW3gebruikt voor de vibratome
CaCl2Merck102382
Choline ClSigma AldrichC1879
Filter paperTiffenEK1546027T
Gas-tight bottle capsCarl Roth GmbH+Co.KGE694.1
Glass filamentsScience ProductsGB150F-8Pvoor opname elektroden
Glass gas disperserDWK Life Sciences GmbH258573309
GlucoseSigma AldrichG7528
Interface Chamberinhouse gemaakt-zie Haas et al., 1979
KClAppliChem131494.1210
Membrane (Cell culture inserts)MerckPICM030050
Membrane chamberinhouse gemaakt-zie Hill and Greenfield, 2011
MgCl2?6H2OCarl RothHNO3.2
MgSO4Sigma AldrichM7506
Na pyruvateSigma AldrichP8574
NaClCarl Roth3957.1
NaH2PO4Merck106346
NaHCO3Carl RothHNO1.2
Peristaltic pumpGilsonMinipuls 3
Slice holderWarner instrumentsSHD-41/15
Vertical pullerNarishigePC-10
VibratomeLeicaVT1200S

Referenties

  1. Hirtz, D., et al. How common are the "common" neurologic disorders. Neurology. 68 (5), 326-337 (2007).
  2. Ngugi, A. K., Bottomley, C., Kleinschmidt, I., Sander, J. W., Newton, C. R. Estimation of the burden of active and life-time epilepsy: a meta-analytic approach. Epilepsia. 51 (5), 883-890 (2010).
  3. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
  4. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  5. Ledri, M., et al. Differential Effect of Neuropeptides on Excitatory Synaptic Transmission in Human Epileptic Hippocampus. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 35 (26), 9622-9631 (2015).
  6. Qi, X. R., et al. Alterations in the steroid biosynthetic pathways in the human prefrontal cortex in mood disorders: A post-mortem study. Brain Pathology. 28 (4), 536-547 (2018).
  7. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  8. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (1), 54-60 (2002).
  9. Le Maître, T. W., Dhanabalan, G., Bogdanovic, N., Alkass, K., Druid, H. Effects of Alcohol Abuse on Proliferating Cells, Stem/Progenitor Cells, and Immature Neurons in the Adult Human Hippocampus. Neuropsychopharmacology. 43 (4), 690-699 (2018).
  10. Dennis, C. V., Suh, L. S., Rodriguez, M. L., Kril, J. J., Sutherland, G. T. Human adult neurogenesis across the ages: An immunohistochemical study. Neuropathology and Applied Neurobiology. 42 (7), 621-638 (2016).
  11. Verwer, R. W. H., et al. Mature astrocytes in the adult human neocortex express the early neuronal marker doublecortin. Brain. 130 (12), 3321-3335 (2007).
  12. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 8407(2018).
  13. Le Duigou, C., et al. Imaging pathological activities of human brain tissue in organotypic culture. Journal of Neuroscience Methods. 298, 33-44 (2018).
  14. Agostinho, A. S., et al. Dynorphin-based "release on demand" gene therapy for drug-resistant temporal lobe epilepsy. EMBO molecular medicine. 11 (10), 9963(2019).
  15. Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  16. Beaulieu-Laroche, L., et al. Enhanced Dendritic Compartmentalization in Human Cortical Neurons. Cell. 175 (3), 643-651 (2018).
  17. Sandow, N., et al. Drug resistance in cortical and hippocampal slices from resected tissue of epilepsy patients: no significant impact of p-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins. Frontiers in Neurology. 6, 30(2015).
  18. Wickham, J., et al. Prolonged life of human acute hippocampal slices from temporal lobe epilepsy surgery. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  19. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. , (2015).
  20. Kraus, L., et al. Dimethylethanolamine Decreases Epileptiform Activity in Acute Human Hippocampal Slices in vitro. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 209(2019).
  21. Antonio, L. L., et al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. , (2016).
  22. Gabriel, S., et al. Stimulus and Potassium-Induced Epileptiform Activity in the Human Dentate Gyrus from Patients with and without Hippocampal Sclerosis. Journal of Neuroscience. 24 (46), 10416-10430 (2004).
  23. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
  24. Hill, M. R. H., Greenfield, S. A. The membrane chamber: a new type of in vitro recording chamber. Journal of neuroscience methods. 195 (1), 15-23 (2011).
  25. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, 24818(2016).
  26. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in molecular biology. 1183, Clifton, N.J. 221-242 (2014).
  27. Testa-Silva, G., et al. Human synapses show a wide temporal window for spike-timing-dependent plasticity. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 2, 12(2010).
  28. Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  29. Morris, G., Jiruska, P., Jefferys, J. G. R., Powell, A. D. A New Approach of Modified Submerged Patch Clamp Recording Reveals Interneuronal Dynamics during Epileptiform Oscillations. Frontiers in Neuroscience. 10, 519(2016).
  30. Valeeva, G., Valiullina, F., Khazipov, R. Excitatory actions of GABA in the intact neonatal rodent hippocampus in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2013).

Herprints en machtigingen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings
Posted by JoVE Editors on 7/13/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings. Step 2.1.3 in the Protocol was corrected.

Step 2.1.3 in the Protocol was updated from:

Add final concentrations of glucose and MgCl, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).

to:

Add final concentrations of glucose and CaCl2, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).

Tags

Epileptiforme activiteitacute preparatie van hersensnijdensnijden met vibratoomcholine ACSF oplossingopstelling van interfacekamerlaag magnesium bicucullinehoog kalium 4 aminopyridinepatchclamp registraties
Voorbereiding van acute menselijke hippocampal slices voor elektrofysiologische opnames
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.