Methodenartikel

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/61100

⸱

7 september 2021

 ,  , 
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen om een goede functie en vouwing van het proteoom (eiwithomeostase) te behouden, neemt af tijdens normale veroudering, waardoor het begin van een groeiend aantal leeftijdsgebonden ziekten wordt vergemakkelijkt. Eiwitten met polyglutamine-uitbreidingen zijn bijvoorbeeld gevoelig voor aggregatie, zoals geïllustreerd met het huntingtine-eiwit en het gelijktijdige begin van de ZvH. De leeftijdsgebonden verslechtering van het proteoom is op grote schaal bestudeerd door het gebruik van transgene Caenorhabditis elegans die polyQ-herhalingen tot expressie brengen die zijn gefuseerd met een geel fluorescerend eiwit (YFP). Dit polyQ::YFP transgene diermodel vergemakkelijkt de directe kwantificering van de leeftijdsgebonden achteruitgang van het proteoom door de progressieve vorming van fluorescerende foci (d.w.z. eiwitaggregaten) en het daaropvolgende begin van voortbewegingsdefecten die zich ontwikkelen als gevolg van de ineenstorting van het proteoom in beeld te brengen. Verder kan de expressie van het polyQ::YFP-transgen worden aangedreven door weefselspecifieke promotors, waardoor proteostase over weefsels kan worden beoordeeld in de context van een intact meercellig organisme. Dit model is zeer vatbaar voor genetische analyse en biedt dus een benadering om veroudering te kwantificeren die complementair is aan levensduurtests. We beschrijven hoe we de vorming van polyQ::YFP-foci in neuronen of lichaamswandspier tijdens het ouder worden nauwkeurig kunnen meten, en het daaropvolgende begin van gedragsdefecten. Vervolgens benadrukken we hoe deze benaderingen kunnen worden aangepast voor een hogere doorvoer en mogelijke toekomstige toepassingen met behulp van andere opkomende strategieën voor C. elegans genetische analyse.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwithomeostase (proteostase) wordt gedefinieerd als het cellulaire vermogen om de juiste functie en vouwing van het proteoom te behouden. De inherente uitdaging voor proteostase is ervoor te zorgen dat alle eiwitten goed worden gevouwen en onderhouden in een inheemse conformatie, die verder wordt versterkt door de gevarieerde aard van eiwitgrootte, aminozuursamenstelling, structurele conformatie, stabiliteit, omzet, expressie, subcellulaire compartimentering en modificaties1. Proteostase wordt gehandhaafd door de gecoördineerde werking van een groot proteostatisch netwerk, bestaande uit ongeveer 2000 unieke eiwitten, die de juiste synthese, vouwing, handel en afbraak binnen het proteoomreguleren 2,3. De werkpaardcomponenten van het proteostatische netwerk zijn negen belangrijke families van moleculaire chaperones4. Elk weefsel- en celtype maakt bij voorkeur gebruik van specifieke subsets van moleculaire chaperones, vermoedelijk in overeenstemming met de verschillende eisen van verschillende proteomen5.

Een kenmerk van normale organismale veroudering is de progressieve afname en ineenstorting van cellulaire proteostase, waarvan wordt gedacht dat het een onderliggende basis is voor het begin en de progressie van een groeiend aantal leeftijdsgebonden ziekten. De ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Huntington en Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) hebben bijvoorbeeld een gemeenschappelijk kenmerk: in elk geval wordt manifestatie van neurodegeneratie aangedreven door genetische veranderingen die een gemuteerd eiwit vatbaar maken voor aggregatie (respectievelijk amyloïde-β / Tau, α-synucleïne, HTT, FUS / TBD-43 / SOD-1)6,7,8,9,10 . Tijdens veroudering neemt de integriteit en induceerbaarheid van het proteostatische netwerk af, wat resulteert in de accumulatie van proteotoxische aggregaten die resulteren in cellulaire disfunctie en neurodegeneratie. Van belang is dat eiwit conformatieziekten niet uniek zijn voor neuronen en voorkomen in meerdere weefsels, zoals benadrukt door type II diabetes, multipel myeloom en cystische fibrose11,12,13,14. Daarom zal het ophelderen van mechanismen die in staat zijn om proteostase te behouden, de ontwikkeling van gerichte interventies voor de behandeling van ziekten en om gezond ouder worden te bevorderen, vergemakkelijken.

De kleine bodemnematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) heeft een belangrijke rol gespeeld bij het ontdekken van genen en het ophelderen van routes die de proteostase veranderen. Veel componenten van het proteostatische netwerk en de signaaltransductieroutes die de proteostase reguleren, zijn evolutionair geconserveerd. Bovendien heeft C. elegans de complexiteit en redundantie ten opzichte van gewervelde systemen verminderd, waardoor het meer vatbaar is voor genetische analyse en genontdekking. Bijkomende voordelen van C. elegans die ertoe hebben geleid dat het op grote schaal wordt gebruikt als een modelsysteem om proteostase te bestuderen, zijn onder meer: krachtige genetische en functionele genomica, een korte levenscyclus (3 dagen) en levensduur (3 weken), een compact en goed geannoteerd genoom, de beschikbaarheid van een breed assortiment genetische mutanten en het gemak van het visualiseren van weefselspecifieke veranderingen in de celbiologie met behulp van fluorescerende reporters.

Het progressieve verval van proteostase tijdens veroudering kan gemakkelijk worden gekwantificeerd in C. elegans. Het Morimoto-laboratorium toonde voor het eerst aan dat een polyglutamine-expansie gefuseerd tot geel fluorescerend eiwit (polyQ: : YFP) kon worden gebruikt om proteostatische afname van C. elegans tijdens veroudering15,16,17,18te kwantificeren. YFP-fusies tot 35 glutamine-herhalingen of meer resulteren in een leeftijdsgebonden vorming van fluorescerende foci samen met tekenen van cellulaire pathologie. Van belang is dat dit bereik van glutamine-expansie de lengte weerspiegelt van het polyglutaminekanaal van het huntingtine-eiwit waarbij de pathologie van de ziekte van Huntington bij mensen begint te worden waargenomen (meestal >35 CAG-herhalingen)19. Stammen met expressie van polyQ::YFP in spier-, darm- of neuronale cellen zijn gebruikt om te bevestigen dat de leeftijdsgebonden achteruitgang van proteostase optreedt in verschillende cel- en weefseltypen. Spierspecifieke polyQ::YFP-expressie (d.w.z. unc-54p::Q35::YFP) is de meest gebruikte weefselspecifieke verslaggever, omdat accumulerende fluorescerende foci gemakkelijk te kwantificeren zijn gedurende de eerste paar dagen van de volwassenheid met behulp van een eenvoudige fluorescerende ontleedmicroscoop (Figuur 1A-1B). Bovendien raken dieren verlamd tijdens het midden van het leven, omdat het proteoom in de spier instort als gevolg van het proteotoxische effect van de verslaggever (figuur 1C). Evenzo kan de leeftijdsgebonden afname van neuronale proteostase worden gevolgd (rgef-1p::Q40::YFP) door het direct kwantificeren van foci/aggregaatvorming en leeftijdsgebonden afnames in gecoördineerde lichaamsbuigingen na het plaatsen van dieren in vloeistof(Figuur 2).

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol over het meten van de leeftijdsafhankelijke progressie van eiwitaggregatieaccumulatie en de bijbehorende proteotoxiciteit geïnduceerd door de expressie van polyglutamineherhalingen in neuronaal en spierweefsel in C. elegans. We geven voorbeelden van typische resultaten die worden gegenereerd met behulp van deze stammen en methoden. Verder laten we zien hoe we deze methoden hebben gebruikt om transcriptionele regulatie van het proteostatische netwerk te bestuderen. We bespreken aanvullende manieren waarop deze reporters eenvoudig kunnen worden geïntegreerd met andere bestaande reagentia of kunnen worden aangepast voor grotere schermen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van reagentia

  1. Selecteer genen die van belang zijn om te worden geïnactiveerd via op voeding gebaseerde RNAi. Koop voorraden HT115 E. coli met daarin de RNAi-kloon van belang20. Als alternatief subclone het cDNA van het gen van belang in de multicloning site van de L4440 plasmide.
    OPMERKING: Om afbraak van dsRNA in de bacteriën te voorkomen, gebruikt u de HT115-stam. Dit is een RNase III-deficiënte E. coli-stam met IPTG-induceerbare T7-polymerase-activiteit. Voor proteostasestudies die geen gebruik maken van op voeding gebaseerde RNAi, kan HT115 of OP50 E. coli op standaard NGM-platen worden gebruikt.
  2. Bereid 5 x 6 cm platen per testconditie voor. Voor experimenten met RNAi, induceer dsRNA-productie in getransformeerde HT115 E. coli. Voor studies zonder RNAi kan OP50 E. coli op standaard NGM-platen worden gebruikt (zie aanvullend bestand 1 voor standaard NGM- en RNAi-plaatrecepten).
    OPMERKING: RNAi-platen kunnen enkele maanden bij 4 °C worden bewaard voordat ze met bacteriën worden gezaaid.
  3. Kweek culturen van E. coli 's nachts (16-20 uur) bij 37 °C in een schudende incubator bij 220 tpm. Kweek HT115 E. coli in Luria Bouillon (LB) met ampicilline (50 μg/ml).
    OPMERKING: Standaard OP50 E. coli is niet antibioticaresistent, maar streptomycineresistente varianten zijn ook beschikbaar.
    1. Concentreer bacteriën door centrifugatie bij 2.400 x g gedurende 15-20 minuten in een tafelcentrifuge, adem het supernatant op en suspensie de pellet opnieuw in 1/10van het startvolume (d.w.z. 10x concentratie) van LB met ampicilline voor HT115, of LB zonder ampicilline voor standaard OP50.
    2. Aliquot 200 μL geconcentreerde 10x bacteriën op elke plaat (3-4 replicaties per testconditie, met 2 extra back-upplaten, te gebruiken in geval van verontreiniging).
    3. Laat open platen drogen in een schone omgeving zoals een laminaire flowbank totdat alle vloeistof is geabsorbeerd of laat afgedekte platen een nacht op een laboratoriumbank drogen.
  4. Voor gezaaide RNAi-platen gedroogd in een kap, bewaar gedroogde platen in een wormendoos 's nachts (tot 24 uur) bij kamertemperatuur. Na 1 dag bij RT kunnen platen tot 2 weken bij 4 °C worden bewaard in een verzegelde zak (om te voorkomen dat platen uitdrogen). Laat voor gebruik de bij 4 °C opgeslagen platen terugkeren naar kamertemperatuur in de zak met ritssluiting om te voorkomen dat condens in de lucht schimmelvervuilingen in de lucht binnenkomt.
    1. Wanneer u RNAi op basis van voeding gebruikt, laat gezaaide HT115-bacteriën op RNAi-platen op RNAi-platen gedurende ten minste 12 uur voordat U C. elegans toevoegt. RNAi-platen bevatten IPTG, dat dsRNA-productie induceert. Als alternatief kan IPTG worden toegevoegd aan de vloeibare culturen aan het einde van stap 1.3.1, 2 uur voorafgaand aan het zaaien.
    2. Vermijd langdurige opslag van gezaaide HT115-platen bij kamertemperatuur (langer dan een paar dagen) om te voorkomen dat de agar barst waardoor C. elegans zich in agar ingraven.

2. Synchronisatie van C. elegans

OPMERKING: Kies of u C. elegans wilt synchroniseren door alkalische hypochlorietbehandeling van gravid volwassenen of eileg.

  1. Synchroniseer dieren door hypochlorietbehandeling van gravid volwassen dieren om de afgifte van embryo's te bevorderen22.
    1. Voor hypochlorietbehandeling, was gravid hermafrodieten 2 keer met M9 buffer, vervolgens resuspend in 5 ml hypochlorietoplossing (3,25 ml hypochlorietoplossing, 1 ml M9-buffer en 0,75 ml van 5 M NaOH) gedurende 5 minuten, waarbij geresuspendeerde dieren elke minuut worden geschud. Draai na 5 minuten dieren af en was 3 keer met M9-buffer.
      OPMERKING: Hypochloriet behandeling is geponeerd om proteostase te beïnvloeden21.
    2. Laat embryo's na behandeling met hypochloriet een nacht uitkomen in 3 ml M9-oplossing met rotatie bij 20 °C.
    3. Bereken de dichtheid van L1-dieren (of als alternatief embryo's) per μL door 10 μL L1-oplossing 3x op een plaat van 6 cm te laten vallen en het aantal L1-dieren te tellen om het gemiddelde aantal L1-dieren per μL te berekenen. L1-dieren zullen zich in de loop van de tijd vestigen. Meng daarom periodiek L1-oplossingen om bezinking te voorkomen.
    4. Zaai 50 L1-dieren per plaat, tel en noteer het aantal zaadjes en verplaats de platen naar een incubator van 20 °C. Het is belangrijk om het werkelijke aantal dieren op elke plaat aan het begin van de test te kennen.
      OPMERKING: Het synchroniseren van L1-dieren door 's nachts uit te komen in M9 wordt routinematig gebruikt omdat het de heterogeniteit van de ontwikkeling minimaliseert na het plaatsen van dieren op voedsel. Synchronisatie vindt echter plaats door ontwikkelingsstilstand als reactie op signalen van uithongering, die voor sommige studies moeten worden vermeden (zie23 voor aanvullende discussie). Als alternatief kunnen ruw gesynchroniseerde dieren worden verkregen door middel van een eierleg, zie 2.2.
    5. Vries overgebleven L1-dieren in en bewaar ze in vloeibare stikstof of een vriezer van -80 °C. Op deze manier wordt een monster van elke stam op het moment van de experimentele opstelling bewaard, waardoor een waardevolle bron voor toekomstige studies wordt gecreëerd en de reproduceerbaarheid wordt verbeterd.
      OPMERKING: Zie aanvullend bestand 1 voor recepten voor hypochloriet en M9-oplossing.
  2. Om dieren via eierleggen te synchroniseren, plaatst u 20 jonge gravid volwassen dieren (dag 1 van volwassenheid) op elk bord gedurende 4-6 uur en laat u ze eieren leggen totdat er ongeveer 50 eieren per bord zijn. Verwijder alle gravid volwassenen en verplaats borden met eieren naar een incubator van 20 °C.
    OPMERKING: De gravid volwassen dieren moeten worden gesynchroniseerd op de eerste dag van de volwassenheid. Oudere dieren kunnen eieren leggen die in de baarmoeder zijn vastgehouden, waardoor eieren vrijkomen die zich in een verder gevorderd ontwikkelingsstadium bevinden.

3. Productie van nakomelingen

OPMERKING: Er moeten stappen worden ondernomen om de productie van nakomelingen te voorkomen of om de gesynchroniseerde startpopulatie van hun nakomelingen te scheiden. Het voorkomen van nageslachtsproductie kan chemisch worden bereikt met toevoeging van 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) aan platen, wat hier wordt beschreven. Sommige studies hebben gemeld dat FUdR proteostase24,25kan veranderen. Alternatieve benaderingen om nageslachtsproductie te voorkomen worden hieronder besproken.

  1. Maak een 1000x stockoplossing van FUdR door 1 g FUdR op te lossen in 10 ml ultrapische H2O. Filter steriliseer voorraad FUdR met een filter van 0,2 μm en een spuit van 10 ml. Aliquot 1 ml bouillon in een steriele buis van 1,5 ml. Invriezen en bewaren bij -20 °C.
  2. Kweek dieren bij 20 °C tot het L4-stadium. N2-dieren die zijn grootgebracht uit gesynchroniseerde L1's van hypochlorietbehandeling hebben ongeveer 40 uur groei bij 20 °C nodig om L4 te bereiken. Groeisnelheden voor andere stammen moeten empirisch worden getest voordat er wordt geëxperimenteerd. Voor details over het nauwkeurig fasen van C. elegans zie26.
    1. Voeg aan elke plaat van 6 cm met L4-dieren 100 μL van 80x FUdR toe. Het is van cruciaal belang om FUdR toe te voegen in de L4-fase.
  3. Breng de platen terug naar een wormendoos en doe de doos in een zak met ritssluiting. Keer terug naar de juiste incubator.

4. Het meten van de afname van proteostase in spierweefsel met behulp van polyglutamine-tot expressie brengende dieren

OPMERKING: Er kunnen twee methoden worden gebruikt om de achteruitgang van de proteostase in spiercellen te identificeren: het in beeld brengen van de vorming van eiwitaggregaten tijdens veroudering (4.1) en het meten van de proteotoxiciteit die deze aggregaten veroorzaken met de leeftijd door het begin van verlamming (4.2).

  1. Beeldvorming polyglutamine aggregaatvorming in de spier tijdens veroudering
    OPMERKING: De leeftijdsafhankelijke progressie van eiwitaggregatie in de spiercellen wordt afgebeeld met behulp van polyglutamine (polyQ) herhalingen gefuseerd met een geel fluorescerend eiwit (YFP). Dit protocol schetst het gebruik van stam AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP], maar andere polyglutamine variant stammen kunnen ook worden gebruikt. Het polyQ::YFP transgen wordt uitgedrukt in de spier met behulp van de unc-54 spierspecifieke promotor. Gesynchroniseerde unc-54p::p olyQ::YFP die dieren uitdrukken, worden gevisualiseerd op dag 1, 2, 3 en 4 van de volwassenheid. Om unc-54p::p olyQ::YFP aggregaten te visualiseren, gebruikt u een samengestelde microscoop die is uitgerust voor fluorescentie of een fluorescerende ontleedmicroscoop. AM140 is verkrijgbaar bij het Caenorhabditis Genetics Center (CGC) op: https://cgc.umn.edu/strain/AM140.
    1. Kies op beeldvormingsdagen (dag 1, 2, 3 en 4 van de volwassenheid) 20 dieren en monteer op een microscoopglaasjesopstelling met een 3% agarosepad en een 5 μL-druppel van 10 mM natriumazide (verdund in M9-buffer).
    2. Nadat alle dieren zijn geïmmobiliseerd door natriumazide (~ 5 minuten), beeld je het hele lichaam van de dieren in met een 10x vergrotingslens(figuur 1A). Gebruik voor beeldvorming een FITC-filter en dezelfde blootstelling voor elk dier. Verwijder dia's na het afbeelden.
      OPMERKING: Als alternatief kunnen YFP-foci ook direct op platen worden gekwantificeerd, maar beweging moet worden geremd door een stroom koolstofdioxide op de plaat aan te brengen tijdens het scoren. Deze alternatieve methode is het meest geschikt bij het screenen van een groot aantal aandoeningen (zie discussie voor meer details).
    3. Tel na het verkrijgen van afbeeldingen het aantal foci in de lichaamswandspieren van het hele dier. Foci zijn helderdere onderbroken signalen die kunnen worden onderscheiden van het dimmer oplosbare signaal op de achtergrond.
    4. Plot de progressie van YFP foci accumulatie van dag 1, 2, 3 en 4. Zet een XY-grafiek uit waarbij X dagen van volwassenheid vertegenwoordigt en Y het aantal unc-54p::p olyQ::YFP foci (Figuur 1B). Het aantal foci in de experimentele toestand (bijv. gen-downregulatie of overexpressie) wordt vergeleken met controledieren. Voer statistische analyse uit tussen de groepen op elk tijdstip dat voor elke studie wordt waargenomen.
      1. Bij het vergelijken van foci telt voor slechts twee voorwaarden, voer een onafhankelijke monster t-test uit op elk tijdstip.
      2. Bij het vergelijken van foci-tellingen voor meer dan twee voorwaarden, voert u een omnibus eenrichtings-ANOVA-analyse uit voor elk tijdstip, inclusief de gegevens voor alle omstandigheden op dat moment. Als de omnibus ANOVA een significante p-waarde oplevert (d.w.z. p < 0,005), voer dan een post-hoc analyse uit met paarsgewijze onafhankelijke steekproef t-tests om de specifieke omstandigheden te bepalen waartussen een significant verschil in foci werd gedetecteerd (bijv. Voor groepen A, B en C vergelijken A & B, A & C en B & C).
  2. Het meten van verlammingspercentages bij dieren als surrogaat voor polyglutaminetoxiciteit in spiercellen
    OPMERKING: De leeftijdsafhankelijke toename van polyQ-aggregaten in spieren veroorzaakt de achteruitgang van de spierfunctie die de voortbeweging aandrijft. Dit defect in de voortbeweging kan worden bepaald door de progressieve snelheid van verlamming bij polyQ-tot expressie gebrachte dieren te meten. Voor de verlammingstest worden gesynchroniseerde unc-54p::p olyQ::YFP-uitdrukkende dieren gescoord op dag 3, 5, 7 en 9 van de volwassenheid. Voeg indien nodig extra tijdspunten toe om het scorebereik uit te breiden, zodat u het effect van genetische verstoring kunt beoordelen.
    1. Kijk op scoringsdagen (dag 3, 5, 7 en 9 van de volwassenheid) naar de platen van 6 cm met 50 dieren en noteer het aantal verlamde dieren. Verwijder verlamde dieren van het bord. Als dieren van het bord zijn gekropen of zijn gestorven, moeten ze worden gecensureerd; leg de gebeurtenis vast, zodat deze in de analyse kan worden meegenomen.
      OPMERKING: Een dier wordt als verlamd beschouwd wanneer er geen beweging wordt waargenomen na blootstelling aan lichte of zachte aanrakingsprikkels. Faryngeale pompactiviteit wordt gebruikt om te bepalen of niet-rokende dieren levend of dood zijn.
    2. Bereken aan het einde van het experiment de verlammingssnelheid voor elke aandoening. Doe dit op elk tijdstip door de fractie van verlamde dieren te delen door het totale aantal dieren dat op dat moment voor die aandoening is waargenomen. Als u meerdere platen per toestand per tijdspunt observeert (d.w.z. platen repliceert), berekent u de verhouding afzonderlijk voor elke replicaat.
    3. Plot de progressie van de verlammingssnelheid in een XY-grafiek (scatterplot). X staat voor dagen van volwassenheid en Y voor verlammingspercentages. De verlammingssnelheid van unc-54p::p olyQ::YFP dieren wordt vergeleken met controledieren(Figuur 1C). Statistische analyse uitvoeren tussen de groepen; voor meerdere onderzoeken, behandel onderzoeken onafhankelijk. Gebruik de Cox Proportional-Hazards Regression en de Wald test. De meeste data-analysetools die overlevingsanalyse ondersteunen, ondersteunen ook Cox-modellering.
      1. Transformeer de gegevens: elke voorwaarde moet twee kolommen hebben, een voor tijd en een andere voor "gebeurtenis". Voeg op elk waargenomen tijdstip een rij toe met "0" voor elk verlamd dier en een "1" voor elk gecensureerd dier. Het totale aantal rijen moet gelijk zijn aan het aantal startende dieren op de plaat voor die aandoening.
      2. Voer Cox Proportional-Hazards-modellering uit, gevolgd door de Wald-test, volgens de instructies voor uw statistische software. Een univariate model is geschikt voor typische experimentontwerpen. Voor meer dan twee aandoeningen, als een test met alle omstandigheden een significant resultaat aangeeft (d.w.z. p < 0,005), kunnen paarsgewijze tests tussen omstandigheden worden uitgevoerd om het specifieke significante paar of de significante paar voorwaarden te bepalen.
        OPMERKING: Het Cox-model gaat ervan uit dat de testconditie(s) de waarschijnlijkheid van een gebeurtenis proportioneel in de tijd moduleren. Dit betekent bijvoorbeeld dat het Cox-model niet geschikt zou zijn om een toestand waarbij de meeste dieren op dag 1 verlamd zijn, te vergelijken met een toestand waarbij de meeste dieren op dag 9 verlamd zijn. Uitbreidingen van het Cox-model en andere benaderingen voor het vergelijken van verhoudingen die op elk tijdstip verlamd zijn, zijn beschikbaar voor gevallen waarin de aanname van proportionele gevaren niet opslaat, zie27,28,29,30.

5. Het meten van de afname van proteostase in neuronaal weefsel met behulp van polyglutamine die dieren tot expressie brengt.

OPMERKING: Twee complementaire methoden worden gebruikt om de achteruitgang van de proteostase in neuronen te testen (1) door de vorming van eiwitaggregaten (fluorescerende foci) tijdens veroudering te kwantificeren en (2) door leeftijdsgebonden afname van het neuronale proteoom te meten via een op beweging gebaseerde test.

  1. Beeldvorming van polyglutamine aggregaatvorming in de neuronen tijdens veroudering
    OPMERKING: Vergelijkbaar met de test die al in spierweefsel is besproken, wordt de leeftijdsafhankelijke progressie van eiwitaggregatie in de neuronen in beeld gegeven door een polyQ::YFP-fusie-eiwit uit te drukken dat wordt aangedreven door de pan-neuronale weefselspecifieke promotor van rgef-1. Specifiek gebruiken we AM101: rmIs110 [rgef-1p::Q40::YFP], een veertig glutamine fusie tot YFP16. Om rgef-1p::p olyQ::YFP te visualiseren, gebruikt u een samengestelde microscoop die is uitgerust voor fluorescentie met een 40x vergrotingslens. AM101 is verkrijgbaar bij de CGC op: https://cgc.umn.edu/strain/AM101.
    1. Kies op beeldvormingsdagen (dag 4, 6, 8 en 10 van de volwassenheid) 20 dieren en monteer op een microscoopglaasje met een 3% agarosepad met een 5 μL druppel van 10 mM natriumazide (verdund in M9-buffer).
    2. Nadat alle dieren zijn geïmmobiliseerd door natriumazide (~ 5 minuten), maak z-stack beelden van het hoofd van de dieren met behulp van een 40x vergrotingslens(Figuur 2A). Verwijder dia's na het afbeelden.
    3. Na het verkrijgen van beelden, verwerk z-stacks om de maximale projectie te verkrijgen en gebruik om het aantal foci in neuronen op het zenuwringgebied te kwantificeren. Foci zijn helderdere onderbroken signalen die kunnen worden onderscheiden van het dimmer oplosbare signaal op de achtergrond.
      OPMERKING: We hebben specifiek het zenuwringgebied geselecteerd om rgef-1p::p olyQ::YFP-aggregaten te kwantificeren, omdat dit het gebied is waar de meeste neuronen samenkomen om synaptische verbindingen te maken. Om echter niveaus van geaggregeerde vorming in motorneuronen te meten, kunnen rgef-1p::p olyQ::YFP-aggregaten op de dorsale of ventrale zenuwstreng worden gekwantificeerd.
    4. Plot de progressie van YFP foci accumulatie van D4, D6, D8 en D10. Doe dit op een XY-grafiek waarbij X dagen van volwassenheid vertegenwoordigt en Y het aantal rgef-1p::p olyQ::YFP foci (Figuur 2B). Het aantal foci in de experimentele toestand (bijv. gen-downregulatie of overexpressie) wordt vergeleken met controledieren. Statistische analyse van foci tellingen voor neuronen wordt gedaan op dezelfde manier als voor spier polyQ foci; zie stap 4.1.4 en de bijbehorende opmerkingen.
  2. Het meten van lichaamsbuigingen als een surrogaatmaatstaf van polyglutamine proteotoxiciteit in neuronen.
    OPMERKING: De proteotoxische stress geïnduceerd door de progressieve geaggregeerde accumulatie van neuronale polyQ wordt bepaald door te kijken naar motorneurondefecten door middel van een thrashing-assay. Kwantificeer het aantal lichaamsbuigingen in een periode van 30 seconden terwijl het is gesuspendeerd in M9 fysiologische buffer(aanvullend bestand 1).
    1. Op dag 2 van de volwassenheid pluk je 10 gesynchroniseerde dieren van de plaat en plaats je op een 10 μL druppel M9-buffer op een microscoopglaasje. Herhaal deze stap minstens vier keer om een monster van 40 of meer dieren te krijgen.
    2. Video registreert de beweging van de 10 dieren die op de microscoopglaasje zijn geplaatst met 10 μL M9-buffer gedurende een periode van 30 s op een stereomicroscoop met een video-compatibele camera. Herhaal deze stap 4 keer voor een totaal monsteraantal van 40. Zoom en positie moeten zo worden aangepast dat alle dieren gedurende de volledige 30 seconden zichtbaar zijn in het frame.
    3. Zodra alle video's met de te analyseren dieren zijn opgenomen, speelt u de video af en scoort u de lichaamsbuigingen van elk dier. Eén lichaamsbuiging wordt gedefinieerd als wanneer de vulva van het dier van de ene kant naar de andere kant gaat en helemaal terug naar de beginpositie.
      OPMERKING: We vinden dat wilde dieren meestal 49 ± 0,79 lichaamsbuigingen in 30 seconden hebben.
    4. Zet het aantal lichaamsbuigingen voor elk dier uit in een kolomgrafiek waarbij elke stip het aantal lichaamsbuigingen in 30 s (Y-as) vertegenwoordigt met de verschillende omstandigheden die op de X-as zijn getest. Het aantal lichaamsbuigingen van unc-54p::p olyQ::YFP dieren wordt vergeleken met controledieren (Figuur 2C). Statistische analyse uitvoeren tussen de groepen onafhankelijk voor elk onderzoek; als de test op meerdere tijdstippen wordt herhaald, analyseert u de gegevens onafhankelijk voor elk tijdstip.
      1. Wanneer u slechts twee voorwaarden overweegt, voert u een t-test met onafhankelijke steekproef uit.
      2. Wanneer u meer dan twee voorwaarden tegelijk overweegt, voert u eerst een omnibus eenrichtings-ANOVA-analyse uit, inclusief de gegevens voor alle omstandigheden op dat tijdrit/tijdspunt. Als de omnibus ANOVA een significante p-waarde oplevert (d.w.z. p < 0,005), voer dan een post-hocanalyse uit met paarsgewijze onafhankelijke monster t-tests om de specifieke omstandigheden te bepalen waartussen een significant verschil in het aantal lichaamsbuigingen werd gedetecteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In C. elegansis het polyglutamine-herhalingsmodel instrumenteel geweest voor de identificatie van genen die het proteostatische netwerk reguleren. We hebben bijvoorbeeld eerder aangetoond dat het homeodomain-interagerende eiwitkinase (hpk-1), een transcriptionele cofactor, de proteostase tijdens veroudering beïnvloedt door de expressie van autofagie en moleculaire chaperones te reguleren31. We ontdekten dat verlies van hpk-1, hetzij door RNAi-uitschakeling of in hpk-...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veroudering wordt gekenmerkt door een geleidelijke afname van proteostase. Proteostase wordt onderhouden door een complex systeem, het proteostatische netwerk, voor de gecoördineerde, dynamische, stressresponsieve controle van eiwitvouwing, -afbraak en -translatie. Waarom proteostase faalt in de loop van het ouder worden is slecht begrepen, maar een rottend epigenoom, afnemende induceerbaarheid van stressreacties en verlies van compenserende overspraak vallen allemaal samen met deze afbraak. Bij C. elegans neemt...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen graag voormalige en huidige leden van het Samuelson-laboratorium bedanken voor hun hulp bij de verfijning van deze methode en / of discussie die de ontwikkeling van dit manuscript heeft geholpen. Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door het National Institute on Aging van de National Institutes of Health onder awardnummers RF1AG062593 en R21AG064519. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24 Well Culture PlatesGreiner Bio-One#662102
2 mL 96-well platesGreiner Bio-One#780286
600 µL 96-well platesGreiner Bio-One#786261
96-pin plate replicatorNunc250520
Luchtdoorlatende plaatsealVWR60941-086
bacteriologische agarAffymetrix/USB10906
bacto-peptonVWR90000-368
C. elegans RNAi clone bibliotheek in HT115 bacteriën- AhringerSource BioscienceC. elegans RNAi Collectie (Ahringer)Zie ook Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone bibliotheek in HT115 bacteriën- VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)Zie ook Rual et. al, Genome Research 2004. Deze bibliotheek is ook verkrijgbaar bij Dharmacon.
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)Alfa AesarL16497
Glazen microscope dekplapjesVWR48404-455
Glazen microscope slidesVWR160004-422
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranosid)Gold Bio12481C100
Rechthoekige niet-behandelde enkele plaat, 128x86mmThermo-Fisher242811
Natriumazid, CAS #26628-22-8Sigma-AldrichS2002
Zeiss Axio Imager M2m microscoop met AxioVision v4.8.2.0 softwareZeissonbekend
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscoopZeissonbekend

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
  2. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  3. Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., Balch, W. E. Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of Biochemistry. 78, 959-991 (2009).
  4. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  5. Sala, A. J., Bott, L. C., Morimoto, R. I. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. Journal of Cell Biology. 216 (5), 1231-1241 (2017).
  6. Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neuroscience Letters. 171 (1-2), 1-4 (1994).
  7. Poirier, M. A., Jiang, H., Ross, C. A. A structure-based analysis of huntingtin mutant polyglutamine aggregation and toxicity: evidence for a compact beta-sheet structure. Human Molecular Genetics. 14 (6), 765-774 (2005).
  8. Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659(2014).
  9. Eftekharzadeh, B., Hyman, B. T., Wegmann, S. Structural studies on the mechanism of protein aggregation in age related neurodegenerative diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 156, 1-13 (2016).
  10. Pokrishevsky, E., Grad, L. I., Cashman, N. R. TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Scientific Reports. 6, 22155(2016).
  11. Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., Soto, C. Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine. 21 (7), 439-449 (2015).
  12. Sikkink, L. A., Ramirez-Alvarado, M. Biochemical and aggregation analysis of Bence Jones proteins from different light chain diseases. Amyloid. 15 (1), 29-39 (2008).
  13. Qu, B. H., Strickland, E., Thomas, P. J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 29 (5), 483-490 (1997).
  14. Qu, B. H., Strickland, E. H., Thomas, P. J. Localization and suppression of a kinetic defect in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator folding. Journal of Biological Chemistry. 272 (25), 15739-15744 (1997).
  15. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  16. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  17. Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. New England Journal of Medicine. 355 (21), 2254-2255 (2006).
  18. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
  19. Walker, F. O. Huntington's disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
  20. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 0002(2001).
  21. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840(2013).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  23. Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819(2018).
  24. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964(2014).
  26. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  27. Schemper, M. Cox Analysis of Survival Data with Non-Proportional Hazard Functions. Journal of the Royal Statistical Society. Series D (The Statistician). 41 (4), 455-465 (1992).
  28. Royston, P., Parmar, M. K. The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt. Statistics in Medicine. 30 (19), 2409-2421 (2011).
  29. Campbell, I. Chi-squared and Fisher-Irwin tests of two-by-two tables with small sample recommendations. Statistics in Medicine. 26 (19), 3661-3675 (2007).
  30. Busing, F. M., Weaver, B., Dubois, S. 2 x 2 Tables: a note on Campbell's recommendation. Statistics in Medicine. 35 (8), 1354-1358 (2016).
  31. Das, R., et al. The homeodomain-interacting protein kinase HPK-1 preserves protein homeostasis and longevity through master regulatory control of the HSF-1 chaperone network and TORC1-restricted autophagy in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 13 (10), 1007038(2017).
  32. Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes & Development. 21 (22), 3006-3016 (2007).
  33. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  34. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  35. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  36. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  37. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  38. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
  39. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438(2011).
  40. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
  41. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 119-128 (2005).
  42. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  43. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  44. Johnson, D. W., et al. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad complexes integrate diverse longevity signals. PLoS Genetics. 10 (4), 1004278(2014).
  45. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  46. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Proteostasis DeclineC elegans AgingPolyQ YFP ReporterTissue Specific ExpressionFluorescent Foci QuantificationLocomotion DefectsNeuronal ProteostasisMuscle ProteostasisGenetic AnalysisHPK 1 Regulation

Gerelateerde artikelen